PEDVCOE蛋白单克隆抗体的制备和可变区测序

摘要本研究旨在展现猪流行性腹泻病毒（PEDV）的核心中和抗原表位COE蛋白，并对其免疫特性进行深入剖析，从而为PEDV的有效检测及亚单位疫苗的研发铺设基石。我们先将PEDV的COE基因序列嵌入进pcDNA3.1+中，成功制备出pcDNA3.1-COE，并转染至HEF293K细胞进行表达。采用Ni-NTA亲和柱纯化蛋白。然后将纯化的蛋白联合弗式佐剂，对BALB/c小鼠进行体内接种免疫，将小鼠的脾细胞和SP2/0细胞通过杂交瘤细胞技术巧妙的完成细胞融合，采用酶联免疫吸附法对单克隆抗体进行效价测定，其中多种基因型PEDV毒株表现出交叉反应性，进一步用RT-PCR扩增单克隆抗体的轻重链可变区基因，结果表明VH和VL链都具有抗体可变区的完整支架，在识别COE蛋白的受体结合域方面发挥关键作用。综上，本实验成功制备了高特异性的PEDVCOE蛋白单克隆抗体。关键词：PEDV，COE蛋白，单克隆抗体，可变区测序前言猪流行性腹泻（PED）作为一种由特定冠状病毒引起的猪肠道传染病，具有传播迅速、发病率高的特点。该病的主要症状包括呕吐与腹泻，且不分猪只的年龄，均有感染风险，尤以新生小猪的病情最为凶险REF_Ref20803\r\h[1]。20世纪80年代初期，中国大陆即报告猪流行性腹泻疫情，随后通过病原学研究成功分离出相关病毒REF_Ref197528305\r\h[2]。近年来，我国大型养猪场比例不断提高，种猪场数量持续增加，仔猪死亡率较高，疫病威胁更加明显，特别是2010年以来，疫病出现了持续多年的全国性大流行，对养猪业造成了重大打击REF_Ref20894\r\h[3]。猪流行性腹泻病毒（PEDV）通过口鼻途径侵入体内，首当其冲的是小肠区域，它主要是在小肠绒毛的上皮细胞内进行大量的繁殖。这一过程中，细胞内的结构—细胞器首当其冲受损，引发细胞整体功能的紊乱REF_Ref197465308\r\h[4]。随着病情的逐渐恶化，上皮细胞严重受损并最终脱落，最终导致营养吸收的严重受阻，造成严重腹泻。并且产生的腹泻是渗出性的，严重的腹泻会导致脱水，甚至会导致猪衰竭和死亡REF_Ref197465328\r\h[5]。猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于冠状病毒科甲型冠状病毒属，病毒粒子呈球形，直径约130nmREF_Ref10878\r\h[6]。由于细胞培养液中牛血清含有的抗体成分会竞争性抑制病毒S蛋白与宿主细胞受体的结合，严重阻碍病毒分离培养。1982年，我国科学家通过优化胎猪肠组织细胞单层培养条件，成功突破这一技术瓶颈。随后在1991年，我国的学者李树根等人也证实了这一点：在传代Vero细胞培养的系统中引入胰蛋白酶能有效诱导PEDV在此类细胞中适应和生长，进而在PK与ST细胞内增殖，并展现出清晰的CPE效应。猪流行性腹泻病毒的遗传物质为线性单股正链RNA，具有直接侵染宿主细胞的生物学特性，其完整基因组序列长度约为28kb，并且结构比较独特，在5'端有一个帽状结构，而3'端则拖着一条poly（A）尾巴REF_Ref197441351\r\h[7]。在这一遗传信息带上有六个关键基因依次排列：Rep基因、S基因、M基因、E基因、N基因及ORF3基因。其中，复制酶作为一种多聚蛋白，在病毒的复制过程中扮演着核心角色REF_Ref197441643\r\h[8]。COE蛋白位于PEDV的S蛋白上，COE蛋白含有中和抗原表位，这意味着它能刺激机体的免疫系统并产生中和抗体，并能够在不同的表达系统中进行重组表达，这些表达可以用于生产大量的COE蛋白用于诊断和研究REF_Ref197441774\r\h[9]。由于COE蛋白的高度保守性和免疫性，它被用作诊断PEDV的重要抗原，建立的检测方法具有高敏性和特异性。单克隆抗体技术的关键在于将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，使抗体分泌功能与无限增值特性进行技术结合，从而使杂交瘤细胞系产生稳定单一抗体。这一里程碑式技术由Kohler和Milstein于1975年首次报道，二人也因该成果获1984年诺贝尔生理学或医学奖REF_Ref197441882\r\h[10]。从生物医学基础研究到临床诊断治疗，其应用范畴覆盖蛋白质纯化、疾病标志物检测、靶向药物开发等多个关键领域，成为现代生物技术产业的重要支撑。单克隆抗体技术的逐步成熟，使其成为生物学研究及临床应用的重要工具支撑。随着技术的进步以及研究的深入，单克隆抗体技术在未来将会有更广泛的应用前景REF_Ref197441905\r\h[11]。在医疗领域的疾病攻克征途上，治疗性单克隆抗体正以破竹之势迅猛进展。时间回溯至20世纪末，治疗性单克隆抗体犹如一颗璀璨新星横空出世。1986年首款具备划时代治疗意义的单克隆抗体OrthocloneOKT3，正式获准应用于临床，这对于肾移植患者而言，无疑是久旱逢甘霖的重大喜讯，它显著削减了患者的排斥反应频率，极大地提升了他们的生存品质。OKT3在临床实践的辉煌战果，犹如一把钥匙，开启了治疗性单抗研发领域的洪流之门。时至今日，众多疾病的治愈方案已深深镌刻下单克隆抗体相关产品的烙印，诸如阵发性夜间血红蛋白尿、哮喘及类风湿性关节炎等顽疾，均在其助力下迎来了治疗的新篇章REF_Ref11809\r\hREF_Ref197441913\r\h[12]。1.材料与方法1.1材料及试剂本实验所使用的猪流行性腹泻病毒（PEDV）毒株是由河南省农业科学院提供。实验中使用的细胞包括HEK293T细胞，SP2/0骨髓瘤细胞，Vero细胞。6~8周龄的BALB/c雌性小鼠来源于河南斯克贝斯公司，小鼠在实验前均经过严格的健康检查，确保无特定病原体。在本次实验中，我们使用的主要试剂包括SIGMA公司提供的完全和不完全弗氏佐剂，而其余所有试剂则均选用国内生产的分析纯级别产品。1.2实验器材分子生物学设备：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、超纯水仪、核酸蛋白定量仪细胞培养设备：无菌超净工作台、离心管（不同规格）、培养瓶、96孔板、冷冻管免疫分析设备：酶联免疫吸附检测仪、Wb转膜仪、荧光显微镜纯化与测序设备：亲和层析柱、超滤膜、测序仪1.3实验方法1.3.1重组质粒pcDNA3.1-COE的构建根据NCBI公布的PEDVChina/2016/Hubei中的COE基因的核苷酸序列，经DNAStar分析亲疏水性和抗原性，设计表达COE蛋白,序列包括PEDV（CH/Hubei/2016）信号肽、PEDVCOE（499-638aa）和6×His标签。根据HEK293T细胞的偏好进行了密码子优化，全基因合成由上海生物技术有限公司完成。1.3.2利用HEK293T系统表达COE蛋白将冻存的HEK293T细胞进行复苏，起始浓度控制在5×105cells/mL，在37℃、5%CO2培养箱中培养。将所有试剂恢复室温，按照PEI:待转质粒为2:1的比例配制转染复合物，也就是将40μLPEI（1mg/mL）和20μg待转质粒分别加入到培养基中，在室温环境下放置15min后，将两种溶液混合，并在相同温度下继续放置15分钟；然后，在细胞培养瓶中加入转染复合物，37℃，5%CO2培养箱中培养；72h后，进行取样，WB检测目的蛋白的表达情况。按上述方法进行大量表达。在每分钟12000转的离心机中，离心细胞液30min，取得的上清液用0.22μm滤膜过滤，然后使用Ni-NTA亲和柱纯化目标蛋白质。首先用超纯水冲洗AKTA蛋白纯化仪的管道，然后将Ni-NTA亲和柱连接在机器上，用平衡缓冲液A（20mMTris-HCl，150mMNaCl，PH8.0）平衡柱子然后将细胞上清液以0.5mL/min的流速通过柱子。取样结束后，用8%的洗脱液B（20mMTris-HCl，150mMNaCl，500mM咪唑，PH8.0）洗去杂质蛋白，用50%的洗脱液B洗脱目标蛋白。目标蛋白质的峰值流出物与平衡缓冲液A交换，并在10KDa超滤管中浓缩。然后使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度，随后分装并保存在-80℃冰箱中。1.3.3单克隆抗体的制备sp2/0细胞的活化和制备：从冷冻的状态复苏sp2/0细胞，并在细胞融合前10d，选取健康并且未接受过免疫的小鼠，在其背部皮下1个位点进行注射。注射后，每日观察，当肿瘤体积约0.6cm3时，将其处死并妥善固定。从处死的小鼠身上取出肿瘤，经过处理后，悬浮瘤细胞。将悬浮的瘤细胞缓慢地加入到50mL离心管中，离心管中含有15mL淋巴细胞分离液。以每分钟1200rpm的速度离心10min，从中分离出位于中间层的sp2/0细胞，然后加入适量的基础培养基。再次以每分钟1200rpm的速度离心5min，重复洗涤两次。最后，用5mL的基础培养基重新悬浮瘤细胞，进行细胞计数。制备免疫脾细胞：对免疫小鼠进行眼眶采血，收集阳性血清样本后，通过断颈方式实施安乐死，将死亡小鼠放入75%的酒精溶液进行5分钟消毒。消毒后的小鼠尸体固定在解剖板上，在确保无菌操作的环境中，小心剥离其外层的皮肤。采用侧向交叉固定的方式稳住小鼠，准确摘取脾脏组织，并使用约4mL左右的基础培养基对其进行细致匀浆处理。待匀浆自然沉降稳定后，缓慢吸取上层清液，并将其转移至装有预先准备的腹腔巨噬细胞的50mL的离心管中。将试管放入离心机中，以1200rpm的转速离心10min。离心结束后，仔细倾析去掉上清液，加入HAT选择性培养液，轻轻吹气，使细胞重新悬浮在溶液中。细胞融合：将骨髓瘤细胞sp2/0与免疫后的小鼠脾细胞以1:5的比例在离心管中混合，通过旋转使两者均匀融合，随后进行离心处理，弃置上层清液，仅保留沉淀物。轻拍离心管底部于掌心，利用轻微震动使沉淀的细胞变得松散。确保细胞沉淀保持在松散状态后，在低于37°C的环境条件下，将37℃的PEG2000融合剂加入1mL到离心管中，并同时保证融合剂沿离心管壁缓慢加入。加入后，均匀旋转离心管1分钟，确保其分布均衡。在未来的4min内，按步骤分别加入总计20mL的DMEM培养液，目的是终止融合剂PEG2000的融合作用。根据如下步骤：在第1分钟内，向容器中加入1mLDMEM；第2min，加入2mLDMEM；第3min再添加4mLDMEM；最后一分钟将剩余的13mLDMEM全部加入。完成混合后，对已经融合的细胞执行离心操作，去掉上层的清亮液体，随后加入15mL的HAT溶液，并轻轻地将细胞与溶液混合均匀。之后，将这种融合后的细胞悬浮液均匀地分配到已经铺有饲养层的96孔细胞培养板中，每个孔中注入100μL的悬浮液。最后，将整个培养板放在CO2培养箱中，进行细胞培养工作。单克隆抗体的筛选：在严格的无菌操控环境中，我们采集小鼠的脾脏组织，将小鼠的脾细胞切割成微小的碎片，并与SP2/0细胞进行充分混合。通过引入聚乙二醇（PEG）作为融合剂，诱导了脾细胞与SP2/0细胞之间的高效融合反应。我们在融合细胞悬浮液中加入含有胸腺嘧啶核苷（HAT）的选择性培养基，并将培养物维持10天左右，筛选出具有杂交特性的阳性细胞系。在此基础上，我们对筛选出的阳性细胞系进行有限稀释，进一步单克隆化，最终筛选出分泌稳定、抗体效价高的阳性克隆。腹水的制备和纯化：选用年龄介于6至8周的BALB/c品系小鼠，通过腹腔途径为每只小鼠注射100μL的灭菌液体石蜡。经过7~10d的等待期后，向每只小鼠的腹腔内注射杂交瘤细胞，细胞数量控制在3×105~5×105。在此期间，密切监测小鼠的生理状态，一旦发现小鼠腹部明显膨胀，且行动受限时，即可采集腹水样本。为取得纯化的单克隆抗体，对腹水选用辛酸硫酸铵法进行纯化，并通过SDS凝胶电泳检测其纯度。1.3.4单克隆抗体ELISA效价测定将纯化后的COE蛋白通过碳酸盐缓冲溶液（调整至PH9.6）稀释，确保浓度为0.5μg/mL，并向每个实验孔中注入100μL该溶液，随后在4℃的环境下进行包被处理，持续时间为一整夜。移除包被液后，向各孔加入200μL的5%脱脂乳溶液，接着在37℃的条件下封闭1h。接下来，取1μL单克隆抗体与999μLPBST溶液混合均匀，并进一步进行倍比稀释，直至达到1:1000的比例。随后，向每个孔中加入100μL此稀释液，并且在37℃的条件下培育1h。使用PBST溶液进行三次清洗，每次清洗时长为5min。然后，采用HRP标记的抗小鼠IgG抗体，以1：5000至1：10000的比例溶解于封闭液中，每孔加入100μL，在37℃的条件下培育1h。加入酶底物显色液TMB后，避光放置15min，在第20min时加入终止液，以为了停止显色。最后，将其放置在酶标仪上，测量OD450数值。抗体的效价即P/N比值大于或等于2.1时的最小稀释度。1.3.5单克隆抗体可变区的测序对产生单克隆抗体的杂交瘤细胞进行收集，提取细胞转录物，然后按照TAKARA的逆转录酶说明书进行逆转。以反转后的cDNA为模板，以VH-F:ATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT,VH-R:CCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG,VL-H:ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT,VL-R:ACTGGATGGTGGGAAGATGGA为上下游引物对重链（VH）和轻链（VL）基因进行扩增，PCR反应体系（50μL）:PrimeSTARMaxPremix25μL,上下游引物各1.5μL,cDNA1-1μL,ddH2O补至50μL。反应程序操作为：预变性：温度升高达95℃，保持5分钟。进入循环阶段：第一，温度保持95℃半分钟；第二，降到55℃，保持1分钟，进行退火；第三，再升高温度到72℃，保持1分钟。终延伸：固定温度为72℃，反应10分钟。完成PCR反应后，采用核酸凝胶电泳，180V电泳20min。为判断目的基因是否成功扩增，需要结合Marker来进行判断。目的片段在扩增成功后要进行切胶回收,纯化后的产物与Taq酶以1:1的比例在72℃反应10min。然后将产物与T载体在16℃下持续反应30min，以进行连接。成功后，将选出的阳性克隆送往上海，在生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果与IgBLAST进行对比，之后对抗体CDR进行注释分析，并同时对可变区序列进行分析。2.结果与分析2.1PEDVCOE蛋白的表达与纯化为了获得PEDVCOE蛋白，将重组质粒pcDNA3.1-COE转染到HEK293T细胞进行表达，收集上清经Ni-CTA柱纯化后进行SDS电泳鉴定，在约30KDa处有一特征的弥散性条带，比预期蛋白分子量稍高，可能是发生了糖基化修饰（REF_Ref197805740\h图1A）。SDS电泳分析显示COE蛋白纯度较高（REF_Ref197805740\h图1B），适合后续的免疫和抗体制备实验。图SEQ图\*ARABIC1COE蛋白的表达与纯化图SEQ图\*ARABIC1COE蛋白的表达与纯化M:蛋白质分子质量标准2.2单克隆抗体的筛选与鉴定通过ELISA检测免疫小鼠的血清，显示小鼠体内产生了高水平的抗COE抗体，保证细胞融合的顺利进行。通过细胞融合和两轮的单克隆化操作，成功获得杂交瘤细胞，其能稳定地分泌出抗COE单克隆抗体（REF_Ref197807021\h图2A）。将取得的杂交瘤细胞腹腔注射到小鼠体内，7~10d后收集腹水，采用蛋白A亲和层析法，从腹水中分离并纯化单克隆抗体。通过酶联免疫吸附法检测单克隆抗体的选择性和结合能力，如REF_Ref197807021\h图2B显示腹水效价可以达到1:64000。图SEQ图\*ARABIC2COE单抗2B6E3筛选结果A：杂交瘤细胞显微镜图B：腹水2B6E3的效价REF_Ref197807357\h图3A可表明：单克隆抗体和PEDV的COE蛋白可以发生特定反应，并且在约30KDa处可观察到一条较为明显的弥散性条带，表明PEDVCOE蛋白单克隆抗体具有优异的反应能力。采用IFA的方法以确定单克隆抗体与PEDV毒株的结合力。采用PEDV感染Vero细胞，出现特征性合胞体后进行IFA测定，一抗为筛选的单抗，二抗为AlexaFluor488标记的羊抗鼠IgG。荧光显微镜观察结果表明单抗能与PEDV反应发出荧光（REF_Ref197807357\h图3B），说明制备的单克隆抗体均可与PEDV病毒结合，识别天然的PEDVCOE蛋白。图SEQ图\*ARABIC3单克隆抗体2B6E3的鉴定A:WB鉴定图B:IFA鉴定图2.4可变区基因的测序结果从杂交瘤细胞中提取总RNA，裂解细胞，采用异丙醇沉淀RNA。用逆转录酶将RNA转录成互补DNA，然后用特异引物扩增轻链和重链可变区的基因。电泳鉴定结果见（REF_Ref197808083\h图4A），成功扩增抗体可变区序列，符合预期大小。将轻重链基因连在T载体上进行测序，获得测序结果后在抗体基因数据库中对VH和VL基因序列进行比对，并绘制了抗体可变区的互补决定区（CDRs）和骨架区（FRs）图（REF_Ref197808083\h图4B）。结果表明，VH链和VL链都具有抗体可变区的完整支架，其中包含四个保守的框架区（FR）和三个高度分化的CDR区，其中CDR3由于序列多样性和构象灵活性，可能在识别COE蛋白的受体结合域方面发挥关键作用。图SEQ图\*ARABIC4单抗2B6E3轻重链测序结果A：轻重链PCRB：CDR结构域标示图3.讨论猪流行性腹泻病毒所致的急性肠道传染病，是威胁仔猪存活的主要疾病之一。该病在我国猪群中肆虐至今，不仅导致众多新生仔猪不幸死亡，更给养猪行业造成了严重的经济损失REF_Ref197443545\r\h[13]。中国在猪只流行性腹泻防护举措当中，疫苗注射被视为极难替代的主要环节。实际情况表明，疗效理想者寥寥，现今对该传染性疾病尚无法提出毫无争议的特异药物治疗办法REF_Ref197443576\r\h[14]。针对初生阶段小猪个体，其免疫系统发育期明显滞后，大概需等至4周或5周龄之后才逐渐发挥功能，由此可见，母源性抗体处于仔猪刚诞生生活最前几周，对外界致病因子的防御能力实际上相当突出。新近一些试验观察指出，在出世不久的小仔猪身上采纳定向抗体口服补给措施，能够间接构建较为坚实稳固且极其完备繁复的病毒屏障，并由此在降低死亡率方面体现了别具一格的实际价值REF_Ref197443596\r\h[15]。COE蛋白作为PEDV的关键核心表位区域，能够引发强烈的免疫反应，因而针对COE蛋白的抗体具有广泛的应用前景。实验通过构建pcDNA3.1-COE蛋白，在HEK293T细胞中高效表达并利用Ni-NTA亲和柱纯化COE蛋白，电泳结果显示，在约30KDa位置处有一条特征的弥散性条带，研究证实了蛋白的高纯