（正式版）DB32∕T 2792-2015 《南粳9108原种生产技术规程》

DB32BasicSeedProducingTechnologyofRiceVarietyNanjing9108江苏省质量技术监督局发布I本标准主要起草人：周丽慧、陈涛、赵庆勇、姚姝、赵春芳、赵凌、朱镇、张亚东、王才1南粳9108原种生产技术规程本标准规定了南粳9108原种生产的品种来源和类型、原种生产技术、株行决选技凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适2选择标准和决选标准应符合DB32/T2791—2015水稻品种南粳9108的规定。株行选择标准应符合DB32/T27913储藏和检验按GB/T3543.1～7-1995进行，符合GB4404.1-2008之规定的原种种子(资料性附录)南粳9108暗胚乳突变基因和香米基因的分子检测方法南粳9108是含有暗胚乳突变基因Wx-mq和香米基因fgr的水稻品种，可针对这两个基因进行分子标记检A.1.1四引物PCR分子标记序列稻谷出苗后在三叶期按单株提取基因组DNA,利用四引物PCR标记进行分子检测。正向外引物(Wx-mq-O-F)序列为5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC-3',反向外引物(Wx-mq-O-R)序列为5'-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3',正向内引物(Wx-mq-I-F)序列为5'-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3',反向内引物(Wx-mq-I-R)序列为5'-GTCGATGA20μLPCR反应体系包括：DNA(10ng/μL)2.0μL,Primer(4pmol/μL)2.0μL,10×PCRBuffer(含MgCl₂)2.0μL,dNTP(2.5mmol/L)0.4μL,Taq酶(5U/μL)0.5μL和ddH₂O13.1μL。PCR反应在MJResearchPTC-200热循环仪上进行，反应程序如下：94℃下预变性5min,每个循环94℃下变性30s,65℃下退火30s,72℃下延伸1min,共35个循环，最后72℃下延伸10min,4℃下保存待用。反应产物在质量比浓度为1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察分析。利用Wx-mq基因四引物分子标记扩增水稻品种的基因组DNA,南粳9108标准稻谷能同时扩增出439bp和292bp的DNA条带，而非南粳9108标准稻谷则同时扩增出439bp和200bp或同时存在439bp、292bp和200bp的DNA条带。(M:分子量标准；1、2、5、7、8、9、10为南粳9108稻谷A.2香米基因fgr的分子标记检测将稻谷进行幼苗DNA提取，利用InDel标记进行分子检测。正向引物(InDel-E2-F)序列为5'-GGGAGGCGCTGAAGA反向引物序列(InDel-E2-R)序列为5'-GGGTAGTCACCACCCTACA.2.2PCR反应体系。20μLPCR反应体系包括：DNA(10ng/μL)2.0μL,Primer(4pmol/μL)2.0μL,10×PCRBuffer(含MgCl₂)2.0μL,dNTP(2.5mmol/L)0.4μL,Taq酶(5U/μL)0.5μL和ddH₂O13.1μL。PCR反应在MJ5DB32/T2792-2015ResearchPTC-200热循环仪上进行，反应程序如下：94℃下预变性5min,每个循环94℃下变性30s,55℃下退火30s,72℃下延伸1min,共35个循环，最后72℃下延伸10min,4℃下保存待用。A.2.3产物分析反应产物在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，经硝酸银染色并于凝胶成像系统下观察分析。利用fgr基因InDel分子标记扩增水稻品种的基因组DNA,南粳9108标准稻谷能扩增出100bp的DNA条带，而非南粳9108标准稻谷则扩增出107bp或同时具有100bp和107bp的带型。