布替萘芬包合物水凝胶的制备及性质研究

1绪论1.1盐酸布替萘芬（butenafinehydrochloride，BTF）盐酸布替萘芬（butenafinehydrochloride，BTF）是一种新型的丙烯胺类抗菌剂，能特异性地抑制真菌中角鲨烯环氧化酶的活性，阻碍真菌麦角甾醇的生物合成，进而影响真菌的生长和增殖。目前BTF多用于浅表性真菌感染，但与那他霉素、氟康唑和两性霉素B的对比研究表明，BTF对眼部真菌同样具有广谱抗菌活性，特别是对曲霉菌属、互隔交链孢霉及新月弯孢霉的抗菌活性更强（曲霉菌MIC90为0.063μg/mL）REF_Ref7588\r\h[14]。但BTF和其他几类抗真菌药一样，具有水溶性差、生物利用度低等不足，本课题旨在通过制备BTF包合物水凝胶制剂，探索其在药物传递中的潜在应用，为进一步的药物研发提供基础和参考。1.2水凝胶水凝胶是一类由亲水高分子链通过不同的化学键合和作用力相互连接而形成的三维网状高分子材料，具有一定的固体性和流动性。随着材料科学的发展，水凝胶与生物活性材料之间具有良好的相容性，在组织工程支架、3D打印、载药与控制释放、细胞组织培养、生物传感以及个体化医学等方面具有重要的意义REF_Ref4925\r\h[1]。根据其交联形式的不同，水凝胶可以分为物理交联和化学交联。传统水凝胶多依赖于氢键、疏水等非共价键结合，而化学交联的水凝胶则是通过共价键将聚合物链段相连，从而实现对温度、pH、压力等环境的响应。目前主要研究的类型包括温敏水凝胶、pH敏感水凝胶、化学交联水凝胶、压力敏感水凝胶等，为各种创面的修复提供了更多智能化的选择REF_Ref7806\r\h[2]。温敏水凝胶随着外界温度的改变而发生相应的改变（膨胀率、透光率等）。在临界温度以下，亲水基团酰胺基占主导地位，水凝胶发生溶胀；超过临界温度后，疏水性异丙基占支配地位，并发生退溶胀。与其它水凝胶不同，温敏水凝胶的临界温度更低，当外部环境发生改变时，会发生相变，因此温敏水凝胶表现出了优于其它水凝胶的优良特性REF_Ref7891\r\h[3]。在人体内能够发生更好的缓释作用，可降低药物毒性并防止药物外泄，应用前景广泛。水凝胶作为一种材料，尽管取得了诸多进展，但仍存在一些问题有待解决。未来的研究聚焦于开发新型高强度、高生物相容性和低成本的水凝胶材料，同时加强跨学科合作促进技术创新与应用转化REF_Ref8380\r\h[4]。1.2.1泊洛沙姆（poloxamer）泊洛沙姆（poloxamer）是一类由聚氧乙烯（polyethyleneoxide，PEO）、聚环氧丙烷[poly（propyleneoxide），PPO]组成的非离子型三嵌段（PEO-PPO-PEO）共聚物，分子量为1100～15000Da。结构式见图1-1。poloxamer的型号、溶解度和表面活性等特性主要取决于其分子中PEO和PPO嵌段的比例REF_Ref5425\r\h[17]。随着PEO嵌段比例的升高，poloxamer的溶解度和亲水亲油平衡值均显著提高，使得其表面活性增强REF_Ref8462\r\h[5]。poloxamer是一类新型的非离子表面活性剂，在多种前沿技术领域中，poloxamer在提高药物溶解度REF_Ref8527\r\h[6]、增加药物稳定性以及降低药物毒副作用REF_Ref8462\r\h[5]等方面展现出广泛的应用潜力，为药物制剂的研发提供了新的思路和方法。图1-1泊洛沙姆结构式1.2.2卡波姆（carbomer）卡波姆（carbomer）又名聚羧乙烯（carboxy-polymethleme，CP），结构式见图1-2。是一种由丙烯酸与烯丙基蔗糖交联而成的高分子聚合物，在水溶液中，水分子逐步向高分子粒子内扩散，carbomer分子处于溶胀状态，在水溶液中均匀分布。水分子向粒子内扩散所需的时间更长，但其凝胶网络仍然是松散的，所以它在水里有良好的溶胀能力，一段时间后会生成高粘性的胶状物质REF_Ref8678\r\h[7]。图1-2卡波姆结构式1.3β-环糊精包合物环糊精（cyclodextein，CD）也叫环聚葡萄糖，是由环糊精葡萄糖残基转移酶作用于糖原、淀粉等葡萄糖聚合物而形成的。当直链淀粉被葡萄糖残基转移酶降解，没有水分子参与时，就得到6、7、8个吡喃葡萄糖单元以α-1，4键合的环状产物，分别叫做α-、β-、γ-环糊精，其中应用最多的是β-环糊精，分子结构见图1-3。环糊精是一类具有较高水溶性、较大内腔、生物相容性好、无毒等优点的化合物，经常被用来改善难溶性药物的溶解性和生物利用度REF_Ref8981\r\h[8]。已有研究发现，包合物在一定程度上可以改善药物的水溶性，同时可以提高水凝胶的理化稳定性，并有助于其在水凝胶中的吸收，并且与其它纳米材料相比，它的制备过程更适合规模化生产REF_Ref9043\r\h[9]。然而，因其促透效果较差，单靠环糊精载药难以满足要求。本研究构建了以羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)/磺丁基-β-环糊精钠盐(SBE-β-CD)为载体的药物包合物，并结合凝胶剂制备包合物水凝胶。图1-3β-环糊精的分子结构1.4本课题的意义及研究内容真菌性角膜炎（FK）是眼科的一种感染性疾病，约占眼科感染性疾病的30%-60%，也是角膜致盲的主要原因，角膜外伤、泪液异常、角膜接触镜佩戴、抗生素和糖皮质激素长期应用等都是FK常见的诱因。FK致病菌以曲霉菌和镰刀菌多见，临床所占比例约为70%。目前BTF多用于浅表性真菌感染，与那他霉素、氟康唑和两性霉素B的对比研究表明，BTF对眼部真菌同样具有广谱抗菌活性，特别是对曲霉菌属、互隔交链孢霉及新月弯孢霉的抗菌活性更强REF_Ref7588\r\h[14]REF_Ref4882\r\h[16]。目前BTF尚没有眼用市售制剂，开发BTF新型眼部给药制剂用于早期FK的治疗具有重要的临床应用价值，基于传统剂型在眼部给药应用时的不足和BTF的特点，本实验制备了BTF水凝胶眼用制剂，一方面利用新型包合材料改善药物的疏水性，另一方面采用水凝胶基质延长眼部滞留时间，改善角膜通透性，提高药物生物利用度，以期能满足临床使用需求。另外筛选合适包合物材料及浓度并建立药物的HPLC含量测定方法，测定药物在凝胶中的含量，通过抑菌圈指标考察包合物水凝胶对曲霉菌的抑菌程度。2实验材料2.1仪器高效液相色谱仪（岛津LC-15C）、DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（上海力辰邦西仪器科技有限公司）、DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）、SB25-12DTN超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、微量进样器（平头100μL；宁波市镇海三爱仪器厂）、移液枪（大龙兴创实验仪器股份有限公司，10-100μL）、抽滤机、离心机、电子分析天平（1/1000g，岛津菲律宾工厂）、冰箱。2.2试药无水乙醇（药用级，99.5%；C17032697；规格：500mL；山东科源生化有限公司）；2-羟丙基-β-环糊精（97%；C16218223；规格：500g；上海麦克林生化科技股份有限公司）；磺丁基-β-环糊精钠盐（规格：99%，100g；C16026048；上海麦克林生化科技股份有限公司）；甲醇（规格：色谱级，≥99.9%，500mL；C16801799；上海麦克林生化科技股份有限公司）；乙腈（规格：forHPLC，99.9%，500mL；C16867037；山东科源生化有限公司）；灭菌注射用水（批号：31808202；规格：5mL；遂成药业股份有限公司）；乙酸铵（规格：forHPLC，≥99.0%，250g；C17276167；山东科源生化有限公司）；磷酸二氢铵（规格：forHPLC，≥99.0%(T)100g；C16889419；上海麦克林生化科技股份有限公司）；卡波姆981（规格：500g；C11425439；上海麦克林生化科技股份有限公司）；泊洛沙姆407（规格：500g；GNG22921B；正一生物）；盐酸布替萘芬（规格：1g；数量：10瓶；D1215E；美仑生物MB1526）；盐酸布替萘芬供含量测定用（规格：100mg；数量：1瓶；中检所100681）。3包合物的制备及含量测定3.1包合物的制备本实验采用两种包合物材料分别制备两种包合物，包括2-羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）和磺丁基-β-环糊精钠盐（SBE-β-CD）两种包合物材料，通过正交实验设计L9（34）4因素3水平表，4个因素分别为药物与包合物的比例、包合时间（h）、包合温度（℃）、搅拌转速（r/min）。其中HP-β-CD的设计方案如下表3.1。表3.1HP-β-CD正交实验设计表水平/因素A：BTF与HP-β-CD的比例B：包合时间（h）C：包合温度（℃）D：搅拌速度（r/min）11：123520021：234030032：1445400取BTF0.1g精密称定，用2mL无水乙醇溶解。根据处方计算包合材料用量，精密称取，用纯化水溶解。处方温度下，将BTF乙醇溶液缓慢滴加到包合材料水溶液中，并按照处方规定的转速和时间进行搅拌。搅拌结束后，用0.45μm过滤器过滤，取滤液进行干燥。得到白色粉末，密封保存备用。每个处方平行做3次。SBE-β-CD的设计方案如表3.2。表3.2SBE-β-CD正交实验设计表水平/因素A：BTF与SBE-β-CD的比例B：包合时间（h）C：包合温度（℃）D：搅拌速度（r/min）11：123520021：234030032：14454003.2含量测定方法的建立3.2.1色谱条件色谱柱：大连依利特分析仪器有限公司，HypersilODS2-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-0.02mol/Ｌ乙酸铵溶液（80：20）；柱温：室温；检测波长：282nm；流速：1.0mL/min；进样量：20μLREF_Ref9203\r\h[10]。3.2.2标准曲线的绘制取BTF对照品25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇溶液定容，备用。利用储备液分别配制成浓度为1、2、5、10、15、20、25、50μg/mL的BTF对照品溶液，均使用甲醇溶液定容。定容完成后，用0.45μm过滤器过滤，取滤液进样，记录色谱图。3.2.3包合物的预处理取BTF-HP-β-CD包合物10mg，精密称定，用1mL甲醇溶液溶解，超声震荡数分钟，使药物完全从包合物中游离。用0.45μm过滤器进行过滤，配制不同浓度的包合物样品溶液，其中浓度包括1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL、50μg/mL，记录以上峰面积，选择6个浓度点，绘制线性回归曲线。3.2.4HP-β-CD包合物样品测定取HP-β-CD包合物样品10mg，精密称定，置于不同的EP管内，分别加入1mL甲醇溶液（抽滤，超声均已完成）进行溶解，超声震荡数分钟，将包合物及药物进行分离，用0.45μm过滤器过滤，得浓度为10mg/mL的样品。在此基础上配制浓度为1mg/mL，10μg/mL的样品，用流动相稀释，27份样品操作同上。配制完成后进样，每份样品平行做两组，求取平均值。根据下方公式计算载药量。公式：载药量（%）=包合物中BTF的量/包合物的重量（3.1）3.2.5SBE-β-CD包合物样品测定该项操作同“3.2.4”项，每份样品平行做两组，根据公式（3.1）计算载药量。3.3包合物的最优处方筛选3.3.1BTF-HP-β-CD包合物将BTF-HP-β-CD包合物的相关数据输入到正交表中，分析处理，得最优处方数据，制备最优处方，平行做3组，选取其中1组进行含量测定，含量测定相关操作方法同“3.2.4”项，记录相关数据。3.3.2BTF-SBE-β-CD包合物相关操作方法同“3.3.1”项，平行做3组，选取其中1组进行含量测定，记录相关数据。3.4结果与讨论3.4.1流动相的选择使用BTF供试品进行HPLC的预实验，取25mgBTF供试品，精密称定，置于25mL容量瓶中，加入一定比例甲醇溶液，完成母液的制备。配制3种不同浓度梯度（100μg/mL、50μg/mL、20μg/mL）的BTF供试品溶液。用移液枪移取母液100μL、50μL、20μL到EP管中，再移取适量甲醇溶液到EP管中，使每个EP管总溶液为1mL。用0.45μm过滤器过滤，放置备用。在预实验阶段，选择3种流动相进行预实验，筛选最合适的流动相，其中3种流动相的条件如下表3.3：表3.3流动相条件流动相1REF_Ref9203\r\h[10]流动相2REF_Ref9269\r\h[11]流动相3REF_Ref9327\r\h[12]溶液乙腈-0.02mol/L乙酸铵溶液甲醇-0.05mol/L乙酸铵溶液乙腈-0.04mol/L磷酸二氢铵溶液比例80：2095：540：60柱温（℃）室温4030波长（nm）282223256流速（mL/min）1.00.81.0准备样品及流动相溶液，打开仪器和电脑，进行排气。设置相关条件，冲洗柱子，注意每次换流动相时需排气。进样分析数据，记录色谱图，分析图谱数据，筛选合适流动相。流动相图谱如下图3-1。对比得出流动相1（乙腈-0.02mol/L乙酸铵溶液）（80：20)得到的峰图更符合，则使用该流动相进行含量测定。如下表3.4。表3.4预实验结果流动相峰图特征峰112无3无3.4.2筛选合适样品浓度由下图3-1可得包合物样品的最低检测浓度为1μg/mL，为标准曲线的浓度选择提供了可行的范围。浓度10mg/mL浓度50μg/mL浓度30μg/mL浓度15μg/mL浓度5μg/mL浓度2μg/mL浓度1μg/mL图3-1包合物样品色谱图3.4.3标准曲线图的绘制标准品溶液测出的峰面积如图3-2，选取6种浓度分别为1、5、10、15、20、50μg/mL，测定结果以峰面积为y，以浓度为x，进行回归分析，得回归方程。浓度1μg/mL浓度2μg/mL浓度5μg/mL浓度10μg/mL浓度15μg/mL浓度20μg/mL浓度25μg/mL浓度50μg/mL图3-2标准品色谱图绘制曲线，得到标准回归曲线图3-3，标准曲线的线性范围1~50μg/mL，在此范围内，R2为0.9974，说明浓度与峰面积呈良好线性关系，符合方法学的要求。图3-3标准曲线图3.4.4BTF-HP-β-CD包合物样品测定数据结果BTF-HP-β-CD包合物样品测定数据中实验四到实验六稀释浓度为20μg/mL，其余实验稀释浓度为10μg/mL。结果如下表3.5。表3.5BTF-HP-β-CD数据结果称取质量（g）稀释浓度（μg/mL)峰面积实验一第1组0.010010①125458②143456实验一第2组0.0101①89921②78925实验一第3组0.0103①44543②50917实验二第1组0.0100①39333②41411实验二第2组0.0100①50957②46425实验二第3组0.0102①52262②54694实验三第1组0.0100①47831②52322实验三第2组0.0100①47305②47526实验三第3组0.0100①49514②51208实验四第1组0.010120①37409②37699实验四第2组0.0100①37385②37365实验四第3组0.0100①43903②44836实验五第1组0.0100①41783②41632实验五第2组0.0103①35907②35810实验五第3组0.0100①38207②38207实验六第1组0.0100①46219②46928实验六第2组0.0100①49046②50009实验六第3组0.0100①52439②52307实验七第1组0.010010①77379②79862实验七第2组0.0100①91207②95456实验七第3组0.0100①68298②70833实验八第1组0.0100①102951②104542实验八第2组0.0100①122368②132795实验八第3组0.0100①80561②81537实验九第1组0.0100①78742②81998实验九第2组0.0100①59510②61389实验九第3组0.0099①68775②69732效应曲线图3-4表明，影响载药量的因素A>C>B>D，即B/H比例>包合温度>包合时间>搅拌速度。由此得出，BTF-HP-β-CD最佳制备工艺具体条件为摩尔比BTF/HP-β-CD=2：1，包合时间2h，包合温度35℃，搅拌速度为200r/min。此时正交试验表的均值最大，详见下表3.6。由差异比较表3.7可知，因素A和C是制备工艺中较为重要的影响因素，B和D在不同水平间不存在显著性差异，为次要影响因素。表3.6BTF-HP-β-CD正交设计数据结果水平/因素A：BTF与HP-β-CD的摩尔比例B：包合时间（h）C：包合温度（℃）D：搅拌速度（r/min）实验结果实验11：123520026.72%实验21：13403008.29%实验31：14454009.16%实验41：22404002.45%实验51：23452002.17%实验61：24353004.63%实验72：124530023.13%实验82：133540033.70%实验92：144020018.48%均值114.72317.43321.68315.790均值23.08314.7209.74012.017均值325.10310.75711.48715.103极差22.0206.67611.9433.773表3.7BTF-HP-β-CD差异比较方差来源偏差平方和自由度F比F临界值A728.11422.7234.460B67.64820.2534.460C249.66620.9344.460D24.23720.0914.460误差1069.678图3-4效应曲线图BTF-HP-β-CD最优处方制备完成后，进样后得到的色谱图如下图3-5，根据公式（3.1）计算的载药量如表3.8。（1）（2）图3-5BTF-HP-β-CD包合物最优处方色谱图表3.8BTF-HP-β-CD最优处方峰面积稀释浓度（μg/mL）平均载药量（%）①1528442027.50②1530433.4.5BTF-SBE-β-CD包合物样品测定数据结果表3.9BTF-SBE-β-CD测定数据称取质量（g）稀释浓度（μg/mL）峰面积实验一第1组0.010510①40056②39187实验一第2组0.0103①33978②33696实验一第3组0.0105①35535②36631实验二第1组0.0101①31736②31579实验二第2组0.0105①32832②32700实验二第3组0.0104①35192②35358实验三第1组0.0102①30063②31076实验三第2组0.0101①29039②29227实验三第3组0.0101①47391②46508实验四第1组0.010220①28935②29030实验四第2组0.0104①32030②32188实验四第3组0.0101①36526②36496实验五第1组0.0102①30582②31223实验五第2组0.0102①39099②41579实验五第3组0.0101①37600②37673实验六第1组0.0103①34453②34049实验六第2组0.0103①36936②36538实验六第3组0.0100①32450②33550实验七第1组0.0104①103797②103862实验七第2组0.0101①138910②139975实验七第3组0.0100①93543②91703实验八第1组0.0102①84378②83893实验八第2组0.0104①78567②79170实验八第3组0.0101①79239②81239实验九第1组0.0103①87501②102634实验九第2组0.0100①105971②113464实验九第3组0.0100①93194②93323效应曲线图3-6表明，影响载药量的因素A>C>B>D，即B/H比例>包合温度>包合时间>搅拌速度。通过分析和数据处理得到以下数据，BTF-SBE-β-CD制备最优条件为摩尔比BTF/SBE-β-CD=2：1，包合时间2h，包合温度45℃，搅拌速度为300r/min。此时正交试验表的均值最大，详见下表3.10。由差异比较表3.11可知，因素A和B是制备工艺中较为重要的影响因素，C和D在不同水平见不存在显著差异，为次要影响因素。表3.10BTF-SBE-β-CD正交设计实验结果水平/因素A：BTF与SBE-β-CD的摩尔比例B：包合时间（h）C：包合温度（℃）D：搅拌速度（r/min）实验结果实验11：12352003.29%实验21：13403001.90%实验31：14454002.98%实验41：22404000.81%实验51：23452001.64%实验61：24353001.28%实验72：124530018.31%实验82：133540011.43%实验92：144020015.64%均值12.7237.4705.3336.857均值21.2434.9906.1177.163均值315.1276.6337.6435.073极差13.8842.4802.3102.090表3.11BTF-SBE-β-CD差异比较方差来源偏差平方和自由度F比F临界值A348.78023.7284.460B9.55120.1024.460C8.28020.0884.460D7.64220.0824.460误差374.258图3-6效应曲线图BTF-SBE-β-CD最优处方制备完成后，进样后得到的色谱图如下图3-7，根据公式（3.1）计算的载药量如表3.12。(1)（2）图3-7BTF-SBE-β-CD最优处方色谱图表3.12BTF-SBE-β-CD最优处方峰面积稀释浓度（μg/mL）平均载药量（%）①1245202021.10②1254613.4.6小结含量测定过程中，BTF-SBE-β-CD包合物样品溶解时加热数分钟，完全溶解。根据以上数据显示，实验过程中BTF-HP-β-CD的载药量（27.5%）与BTF-SBE-β-CD的载药量（21.1%）相比要大，表明HP-β-CD包合物材料的载药性能与SBE-β-CD包合物材料相比要好。4水凝胶的制备及含量4.1泊洛沙姆407（poloxamer407）基质用量的筛选本实验采用温敏水凝胶poloxamer407材料进行制备REF_Ref9203\r\h[10]REF_Ref10503\r\h[13]。制备空白原位水凝胶时，采用单因素正交设计，选择的浓度分别为5%、10%、12%、15%、20%，如下表4.1。表4.1泊洛沙姆407空白水凝胶的实验设计方案条件4℃下溶胀浓度5%10%12%15%20%取poloxamer4070.5g、1.0g、1.2g、1.5g、2.0g，精密称定，将水凝胶分别撒入装有10mL水的烧杯中，不搅拌，放入4℃冰箱中溶胀过夜，第二天观察溶液是否澄清，若澄清，则代表poloxamer407溶胀完成，若不澄清，则相反。将每个烧杯分别放入到35~37℃的恒温水浴锅1~2分钟，将其倒置观察流动性。若倒置不流动，形成凝胶状体，则选用该种浓度的poloxamer407。4.2卡波姆981（carbomer981）基质用量的筛选本实验采用普通水凝胶carbomer981材料进行制备REF_Ref9203\r\h[13]。同样采用单因素正交设计。选择的浓度分别为4%、5%、6%，如下表4.2。表4.2卡波姆981空白水凝胶的实验设计方案条件室温下溶胀浓度4%5%6%取0.4g、0.5g、0.6gcarbomer981，精密称定，分别置于3个烧杯中，向3个烧杯中分别加入10mL纯化水，等待2~3个小时，观察凝胶形成情况，然后将其倒置180°观察凝胶是否流动。若倒置不流动，形成凝胶状体，则选用该种浓度的carbomer407。4.3BTF包合物水凝胶的制备4.3.1poloxamer水凝胶的制备称取适量poloxamer407加入2mL水中，置于4℃冰箱里溶胀过夜，称取两种包合物适量（约相当于BTF20mg），分别加入到溶胀好的水凝胶里，超声过滤，其中加入的BTF-HP-β-CD包合物为0.0730g（凝胶称取0.4006g），BTF-SBE-β-CD包合物为0.0947g（凝胶称取0.4012g），然后分别取水凝胶1mL，加入一定比例的饱合NaCl溶液REF_Ref947\r\h[15]，振摇使凝胶变稀、分散。4.3.2carbomer水凝胶的制备称取适量carbomer981加入2mL水中，置于室温下溶胀数小时，称取两种包合物适量（约相当于BTF2mg）以及已溶胀水凝胶适量，其中加入的BTF-HP-β-CD包合物为0.0073g（称取凝胶为0.2128g），BTF-SBE-β-CD包合物为0.0095g（称取凝胶为0.2051g），然后分别加入lmL的饱合NaCl溶液，振摇使凝胶变稀、分散。4.4BTF包合物水凝胶的含量测定色谱条件同“3.2.1”，与前面不同的是对样品的处理，将水凝胶和制作完成的载药包合物按一定比例混合，超声溶解，后将制备好的样品离心，取上清液过滤，进样，记录色谱图。4.5BTF包合物水凝胶体外抗真菌效果初步评价将曲霉菌制成106CFU/ml左右的菌悬液，接种于葡萄糖琼脂培养基，采用钢管放置器将牛津杯放入上述含菌培养基中，用移液枪分别取BTF溶液（由于没有市售的滴眼液，因此制备BTF混悬液代替）、BTF包合物水凝胶、两性霉素B滴眼液、灭菌注射用水添加入不同的牛津杯中，然后转移到生化培养箱中培养（28℃，72h），用游标卡尺测量四种溶液形成的抑菌圈大小，记录数据。4.6结果与讨论4.6.1poloxamer的浓度选择温敏水凝胶poloxamer407最终选择的浓度为20%，在4℃冰箱内溶胀一夜后为澄清透明液体。在35~37℃的恒温水浴锅加热数分钟后，倒置观察为白色透明胶体状且倒置不流动，所以后续制备BTF包合物水凝胶时用20%的泊洛沙姆407。下图4-1为poloxamer407凝胶的相转变预实验。图4-120%泊洛沙姆407(左：室温；右：37℃）4.6.2carbomer的浓度选择普通水凝胶carbomer981最终选择的浓度为4%，根据结果观察，在室温下溶胀数小时后呈白色胶体状，倒置不流动。则选用4%的carbomer981水凝胶进行下一步实验。图4-24%卡波姆981溶胀后倒置图4.6.3poloxamer水凝胶的含量测定开始制备水凝胶的过程中有用到离心机离心，离心结果如下图4-3。图4-3泊洛沙姆离心图未稀释前，进样后形成的峰图如下图4-4，调整流速为1.5mL/min、0.8mL/min，如下图4-5和图4-6。图4-4图4-5图4-6另用25μg/mL标准品溶液确定流速改变后的出峰时间，如图4-7，出峰时间在32min左右。图4-7图4-8结果显示，如图4-8，峰图还是未分开，加入适量饱和NaCl溶液REF_Ref15529\r\h[15]搅拌使其变稀、分散，峰图分开，其中加入BTF-HP-β-CD包合物及BTF-SBE-β-CD包合物两种图谱，流速为0.8mL/min，如图4-9和图4-10。图4-9图4-10因峰面积较大，进一步用流动相稀释，取250μL到10mL容量瓶中，加流动相定容，再取容量瓶中液体25μL至EP管中，加入975μL流动相，使EP管总体积为1mL，再次进样，得到图4-10、图4-11数据。（1）（2）图4-10BTF-HP-β-CD泊洛沙姆水凝胶（1）（2）图4-11BTF-SBE-β-CD泊洛沙姆水凝胶表4.3poloxamer407水凝胶药物含量测定结果水凝胶稀释倍数峰面积含药量含BTF-HP-β-CD①1600761200.4g：4mg②93150含BTF-SBE-β-CD①970940.4g：6.3mg②1363674.6.4carbomer水凝胶的含量测定制备包合物水凝胶的过程中用到离心机离心，carbomer水凝胶大分子已沉降，离心结果如下图4-12。图4-12离心后出现分层，取上清液过滤，因结果不符合进样量，未采用离心方法。重新称取一定比例的水凝胶和包合物加入饱和NaCl溶液搅拌稀释，使其变稀、分散。调流速为0.8mL/min，得到BTF-HP-β-CD包合物及SBE-HP-β-CD包合物两种峰图，如图4-13和图4-14。图4-13图4-14因峰面积较大，取250μL到10mL容量瓶中，加流动相定容，再取25μL至EP管中，加入975μL流动相，使EP管总体积为1mL，再次进样。得到下图数据。（1）（2）图4-15BTF-HP-β-CD卡波姆水凝胶（1）（2）图4-16BTF-SBE-β-CD卡波姆水凝胶表4.4carbomer981水凝胶药物含量测定结果水凝胶稀释倍数峰面积含药量含BTF-HP-β-CD①16001761210.21g：9.5mg②146725含BTF-SBE-β-CD①466500.21g：1.5mg②515154.6.5BTF包合物水凝胶体外抗真菌效果初步评价表4.5不同药物对曲霉菌的抑菌圈大小（n=3）组别抑菌圈测量值（mm）BTF溶液（混悬液）9.6±1.1BTF包合物水凝胶18.3±1.6两性霉素B滴眼液15.7±1.4灭菌注射用水0结果显示，BTF包合物水凝胶形成的抑菌圈明显高于溶液组。4.6.6小结本实验用到的水凝胶基质有泊洛沙姆407和卡波姆981，前者为温敏水凝胶，在4℃下溶胀一定时间可变成白色透明液体，在体温35~37℃下可变成凝胶状态，随着外界温度的改变而发生相应的改变，对于后续的药物给药带来极大的便利性。通过HPLC测定凝胶中的BTF含量发现，BTF-HP-β-CD卡波姆水凝胶的含药量为0.21g：9.5mg，BTF-SBE-β-CD卡波姆水凝胶的含药量为0.21g：1.5mg；BTF-HP-β-CD泊洛沙姆水凝胶的含药量为0.4g：4mg，BTF-SBE-β-CD泊洛沙姆水凝胶的含药量为0.4g：6.3mg。结果显示，与SBE-β-CD包合的卡波姆水凝胶相比，HP-β-CD包合的药物含量药高，与HP-β-CD包合的泊洛沙姆水凝胶相比，SBE-β-CD包合的药物含量药高。如下表4.6。表4.6不同包合物水凝胶的含药量BTF-HP-β-CD卡波姆水凝胶BTF-SBE-β-CD卡波姆水凝胶BTF-HP-β-CD泊洛沙姆水凝胶BTF-SBE-β-CD泊洛沙姆水凝胶含药量0.21g：9.5mg0.21g：1.5mg0.4g：4mg0.4g：6.3mg5讨论本课题以开发BTF新型眼部给药制剂包合物水凝胶用于早期FK的治疗为出发点，研究探讨了β-环糊精包合物的制备、水凝胶的制备以及水凝胶体外抗真菌评价三个方面的问题。5.1β-环糊精包合物的制备在环糊精包合物的制备部分，选取无水乙醇作为溶剂，利用HP-β-CD和SBE-β-CD作为载体，对BTF这一难溶性药物进行包合。通过磁力搅拌与烘箱干燥操作的方法，成功制备出BT