超声联合天然产物对林蛙油脱腥的研究

PAGEIIPAGE8摘要林蛙油是高蛋白、低胆固醇的食品，广泛应用于保健和膳食中，素有“绿色软黄金”之称。然而，林蛙油强烈的腥味影响了它的食用与市场推广，因此开发安全高效的林蛙油脱腥技术成为产业发展的关键。本课题采用超声联合天然产物作为脱腥手段，系统评估其对林蛙油腥味物质的去除效果。论文主要研究内容及结果如下：测定了林蛙油的基本理化指标：水分16%，灰分9.1%，粗脂肪5.5%，蛋白质42.5%，膨胀度112.73mL/g，结果符合《中国药典》和GB/T19507-2008《地理标志产品吉林长白山中国林蛙油》相关标准。通过单因素实验分析了五个因素对林蛙油脱腥效果的影响，确定超声单因素最佳工艺为：功率500W超声时间60min，脱腥率达48.06%；天然产物单因素最佳工艺为迷迭香：芦笋复配比4：1，添加量343mg/0.5g，吸附时间60min，脱腥率达56.4%。通过单因素实验结果构建复合脱腥模型，以TBARs值作为评分因素，利用响应面优化实验，确定林蛙油脱腥的最优工艺条件为：超声60min，天然产物添加量335mg/0.5g，天然产物吸附时间55min，通过方差分析得知林蛙油脱腥因素的显著性排序为：天然产物添加量(P＜0.0001)＞超声时间(P=0.0006)＞天然产物吸附时间(P=0.0011)。该工艺条件下制备的林蛙油样品TBARs值由通常的303.275μg/gTBARs值下降至113.3μg/g，脱腥率高达62.6%应用模糊数学模型建立感官评价体系优化林蛙油的脱腥工艺，通过单因素实验和正交实验确定林蛙油脱腥的最优工艺条件为：超声时间60min，天然产物添加量343mg/0.5g，天然产物吸附时间60min，在此条件下林蛙油感官评分最高，香气感受最好，颜色最黄亮透明且凝胶性最好。关键词：林蛙油；脱腥；超声；天然产物AbstractAbstractABSTRACTOviductusRanaeisahigh-protein,low-cholesterolfoodthatiswidelyutilizedinhealthcareanddietaryapplications,oftenreferredtoas"greensoftgold."However,thepronouncedfishyodorofOviductusRanaeinfluenceonitsconsumptionandmarketpromotionpotential.Consequently,theadvancementofsafeandefficientdefishytechnologyforOviductusRanaehasbecomeacriticalfactorforindustrialdevelopment.Inthisstudy,ultrasoundcombinedwithnaturalproductswasemployedasamethodfordeodorization,andtheremovalefficacyoffishyodorcompoundsinOviductusRanaewassystematicallyevaluated.Theprimaryresearchcontentandresultsaresummarizedasfollows:ThebasicphysicochemicalpropertiesofOviductusRanaeweredetermined,includingmoisture(16%),ash(9.1%),crudefat(5.5%),protein(42.5%),andswellingcapacity(112.73mL/g).Theseresultscompliedwiththerelevantstandardsoutlinedinthe"ChinesePharmacopeia"andGB/T19507-2008"JilinChangbaiMountainChineseOviductusRanae".Throughasingle-factorexperiment,theinfluenceoffivefactorsonthedeodorizationefficiencyofOviductusRanaewasanalyzed.Theoptimalultrasonicsingle-factorprocesswasidentifiedasfollows:ultrasonicpowerof500Wfor60minutes,achievingadeodorizationrateof48.06%.Fornaturalproducts,theoptimalsingle-factorprocesswasdeterminedtobearatioofrosemarytoasparagusof4:1,anadditionamountof343mg/0.5g,andanadsorptiontimeof60minutes,resultinginadeodorizationrateof56.4%.Basedontheresultsofthesingle-factorexperiments,acompositedeodorizationmodelwasconstructed.UsingtheTBARsvalueasthescoringfactor,theoptimaldeodorizationconditionsforOviductusRanaeweredeterminedthroughresponsesurfaceoptimizationexperiments.Theoptimalconditionsincludedanadditionamountofnaturalproductsof335mg/0.5gandanadsorptiontimeof55minutes.Thesignificanceofthedeodorantfactorswasrankedasfollows:additionamountofnaturalproducts(P<0.0001)>ultrasonictime(P=0.0006)>adsorptiontimeofnaturalproducts(P=0.0011).TheTBARsvalueofOviductusRanaedecreasedfrom303.275μg/gto113.3μg/g,achievingadeodorizationrateof62.6%.AsensoryevaluationsystemwasdevelopedusingafuzzymathematicalmodeltooptimizethedeodorizationprocessofOviductusRanae.Theoptimalprocessconditionswereidentifiedthroughsingle-factorexperimentsandorthogonalexperiments:ultrasonictimeof60minutes,naturalproductadditionof343mg/0.5g,andnaturalproductadsorptiontimeof60minutes.Undertheseconditions,OviductusRanaeexhibitedthehighestsensoryscore,possessedthemostdesirablearoma,displayedavividyellowandtransparentcolor,anddemonstratedsuperiorgelproperties.Keywords:OviductusRanae；Deodorant；Ultrasond；NaturalproductsPAGE9PAGE9第1章绪论1.1林蛙油概述1.1.1林蛙油林蛙，也叫雪蛤，是我国东北地区一种有重要生态和药用价值的两栖类动物，它的雌性输卵管经干制后得到“林蛙油”，一直以来都是滋补佳品，在中医药和保健食品领域有着广泛应用。林蛙油含有多种优质蛋白、不饱和脂肪酸以及矿物质等营养活性成分，具有增强免疫力、抗疲劳、抗衰老等多种生理功能，被誉为“绿色软黄金”，随着健康中国战略不断推进，人们营养健康意识日益提高，林蛙油慢慢变成功能性食品市场重要组成部分[1]。但是林蛙油产业化推广遇到“食用感官性差”的核心难题，特别是浓重的腥味让消费者难以接受，限制了市场的进一步开拓，传统脱腥手段常伴有高温损伤营养成分，化学残留危险或者成效不佳之类的状况，迫切需要创建起绿色，高效且无损的新型脱腥工艺，在这种情况下，超声技术由于具备空化效应而在食品脱腥方面显示出较好的运用潜能，而且像迷迭香，芦笋这类天然植物产品含有大量挥发气味和吸附物质，有不错的掩蔽异味及去腥能力，于是把超声技术同天然产物联合起来用以林蛙油脱腥处置，既能攻克传统技术难关又符合当前食品工业朝绿色加工和保存营养方向发展的潮流趋向，有着比较大的研究价值和现实意义[2]。1.1.2林蛙油应用目前市场上主要的产品有林蛙油软胶囊、片剂、颗粒、口服液等，如吉蛙系列胶囊产品在功能性食品市场具有一定的知名度(赵立香等，2014)[3]。也有许多学者尝试将林蛙油与其他一些调味品复配，如果汁、蜂蜜、大枣等，制作出酸甜型方便食品及乳状制品(崔敬爱等，2007；张琪，2018)[4]。在功能食品方面，林蛙油酸奶、固体饮料、压片糖果等新产品层出不穷。随着“美丽经济”的兴起，林蛙油在化妆品上的潜力也被发掘出来，研究发现，它含有胶原蛋白、不饱和脂肪酸、氨基酸、雌激素类物质，具有皮肤滋养、保湿、美白、防晒等多重功效，可用于乳液、面霜、防晒等多种护肤产品中(王勇等，2002；张建与柴秋泉，2017)[5]。刘春娟等(2017)通过对林蛙油的一系列理化及皮肤试用试验，研制出保湿防晒林蛙油乳液，为其在日化产业中的应用提供了依据[6]。1.2脱腥技术概述1.2.1超声脱腥原理超声脱腥的原理主要是“空化效应”，当超声波作用到液体中时，会产生高频振动，使液体中产生微气泡，微气泡在超声波的作用下会迅速膨胀并瞬间崩溃，这个过程会产生强烈的冲击波，在局部形成高温高压环境，在林蛙油脱腥的过程中，这种空化效应能够破坏腥味物质(如醛类、胺类等)的分子结构[7]，使其化学键断裂或者重新排列，进而降低腥味物质的浓度，而且冲击波和高温高压环境还能促使腥味物质从油脂相向水相转移，加快其脱离林蛙油体系的速度，实现脱腥的目的，而且超声处理还可以提高物质的传质效率，促进其他脱腥方法(比如吸附剂)与腥味物质接触并发生作用，从而提升整体脱腥的效果[8]。1.2.2天然产物脱腥原理天然产物(迷迭香、芦笋)在林蛙油脱腥中也起着重要作用，其脱腥原理主要依赖于化学成分特性和吸附作用，以迷迭香为例[9]，迷迭香酸是迷迭香的主要成分，其具有邻苯二酚结构，这种结构能有效抑制脂质氧化，减少脂质氧化过程中产生的多种异味，迷迭香酸及其他成分通过物理吸附或化学结合方式，与林蛙油中腥味物质发生相互作用，将其吸附固定，减少腥味。芦笋中有效成分也与腥味物质发生吸附或者络合反应，选择性地去除特定腥味成分。1.2.3超声联合天然产物复合脱腥原理超声联合天然产物脱腥技术并不是两个方法的简单叠加，而是利用超声和天然产物的协同作用达到高效的脱腥效果。超声空化效应产生的物理破碎作用使林蛙油体系中的腥味物质更容易暴露出来，增大与天然吸附剂的接触面积，为天然产物吸附腥味物质提供条件；天然产物的吸附作用可以及时吸附超声处理后释放出的腥味物质，防止腥味物质再次结合或者生成新的异味。这种“物理破碎-化学吸附”的协同作用既发挥了超声处理的高效性，又利用了天然产物的选择性和安全性，提高了林蛙油的脱腥效率，还保留了林蛙油的营养成分并提高了林蛙油产品的质量，为林蛙油脱腥提供了一种绿色、安全、高效的途径[10]。1.2.4林蛙油脱腥技术发展概况在林蛙油脱腥技术研究方面，国内外学者做了许多探索工作，传统脱腥手段包含高温处理，酸碱处理以及有机溶剂萃取等，高温处理能够减轻腥味，不过会破坏林蛙油里的热敏性营养成分，酸碱处理和有机溶剂萃取存在化学残留问题，会影响产品的安全性和品质，近些年来，随着绿色技术发展，生物酶法，吸附法和物理处理技术慢慢被重视起来，生物酶法借助特定酶分解腥味物质，酶的专一性较强，成本高，而且对工艺条件要求严格，单纯吸附法可以吸附腥味物质，但是对林蛙油中的功能成分也有一定的吸附损失，影响产品的营养价值。在超声技术的应用上，国外将超声技术用于鱼油、乳脂等油脂类的脱腥中，发现超声空化作用能破坏腥味物质结构；国内有学者将超声技术与其他技术联用处理水产蛋白腥味，但林蛙油脱腥的研究还处于起步阶段。1.2.5林蛙油脱腥技术存在的问题虽然近年来有关林蛙油开发与加工技术的研究有了些许进展，但在实际应用当中，林蛙油脱腥技术仍然存在诸多瓶颈和困难，其一，当前大部分脱腥手段难以在“有效地去除腥味”和“保持营养活性成分”这两个方面达成有效的协调统一，一些工艺具备很强的脱腥能力，但却伴随着大量蛋白质，不饱和脂肪酸等关键成分的损失[11]，造成产品质量下滑，无法符合高品质保健食品的要求，其二，有些传统的脱腥办法依靠化学试剂或者高温处理，也许会引发化学残留或者损害林蛙油的热敏性营养物质，这不符合现今绿色，安全，无添加的食品消费潮流。这种脱腥手段既削弱了消费者的接受程度，又影响到产品在市场上的推广力，其三，当下的研究大多着眼于单个脱腥技术的比较及改良，却没有系统地考察不同技术相互配合时所形成的脱腥机理，特别是关于“物理-化学”复合途径的理论支撑以及工艺参数仍然不明晰，这阻碍了脱腥技术体系朝着多元化方向发展并实现标准化创建，其四，就产业而言，某些工艺在操作流程，设备需求，技术把控等方面存在繁杂之处，其制程成本偏高，很难符合中小型企业的加工需求，而且还不利于脱腥技术向规模化，标准化，产业化方向推进[12]。1.3本课题的意义及研究目的1.3.1本课题的意义理论意义：林蛙油属于具有传统药用背景的动物源性保健原料，虽然在中医药典籍中早有记载，但是其现代科学研究依然比较滞后，特别是在有效成分构成，品质影响因素以及脱腥机制等方面仍然缺少系统研究，本课题针对林蛙油腥味物质的去除，联系现代食品工程技术以及天然产物应用，探究超声协同天然植物成分（迷迭香，芦笋）在油脂脱腥中的作用机理，有益于充实林蛙油深加工领域的基础理论体系，弥补其在绿色脱腥技术方面的研究空缺。本文提出的“物理空化-化学吸附”协同脱腥模型，对其他动物源油脂类物质的品质提升研究也具有一定借鉴意义，有利于促进绿色食品加工技术和传统中药材现代化利用的交叉融合，拓宽绿色脱腥技术理论研究边界[13]。实践意义：随着我国居民营养健康意识的提升，具有保健功能的传统动植物资源越来越受到市场的青睐，而林蛙油具有滋补作用，但其强烈的腥味严重阻碍了消费者接受度和产品附加值，是制约其产业化发展的主要障碍，目前缺乏兼具脱腥效果和营养保留的绿色处理技术，限制了林蛙油在食品、保健品以及医养结合产业中的广泛应用[14]。本研究提出并验证了“超声+天然产物”的协同脱腥路径，其绿色、高效、无残留等特点，不仅可以显著提升林蛙油的感官品质和市场竞争力，还能为其标准化生产与系列产品的开发提供技术支持。而且该工艺具有良好的产业复制性和推广性，对于推动地方特色资源的高值化利用、促进区域经济发展、延长中药和食品交叉产业链具有重要的现实意义[15]。1.3.2本课题的研究目的本课题要研发出一种高效又安全的林蛙油去腥工艺体系，从而破解传统去腥手段在营养损失，化学残留以及感官改良等方面的难题[16]，把超声处理同天然产物结合使用，全面探究它们对林蛙油去腥效果和营养成分保留状况的影响，找出“物理空化-化学吸附”联合去腥机理，改进各个工艺参数，创建适合林蛙油的最佳去腥技术方案，之后，还要分析处理前后林蛙油的理化性质和感官品质改变情况，评判去腥处理的总体效果和应用前景，通过这个课题的研究，希望给林蛙油产业做到品质提升，市场拓展给予理论支撑和技术途径，促使它朝着功能化，标准化和多样化方向发展，进而推动中药资源的现代化开发和特色产业链延伸。1.4本课题主要研究内容及技术路线1.4.1主要研究内容本课题以林蛙油脱腥工艺优化为核心，要冲破传统脱腥手段所存在的质量损失，技术单一以及应用受限等状况，促使林蛙油朝着高品质保健食品方向发展，为达成这一目的，课题大概会着重解决如下几个方面的关键科学和技术问题：（1）林蛙油腥味成分识别及来源解析问题：目前对于林蛙油中腥味成分的种类及形成机理研究较少，课题需通过理化检测手段识别主要挥发性腥味成分，确定其来源及形成特点，为后续脱腥机制研究奠定基础。（2）绿色脱腥技术的协同机制问题：现有的脱腥方法大多局限于单一的技术路径，缺少对复合技术协同脱腥机制的阐述，本课题要探究超声波空化效应与天然产物（迷迭香、芦笋）吸附掩味作用的协同机理，剖析“物理破坏-化学掩蔽”的复合作用机理。（3）脱腥工艺参数优化与营养保持的协调问题：林蛙油属于热敏性保健原料，加工过程中营养成分极易流失，本研究要找到腥味去除与营养成分保留之间的平衡，采用响应面优化法等技术手段，筛选出最佳超声参数、天然产物添加量及处理时间组合，从而做到脱腥效率与营养保持的双优化。（4）脱腥技术的可推广性与应用转化问题：有些实验技术操作繁杂，设备要求高，不适合产业化进程，本课题要综合评判脱腥工艺的稳定情况，可控程度和经济状况，找出其在林蛙油初加工或者精深加工环节的工程化应用途径，加强成果的可复制性和推广可能性。1.4.2技术路线林蛙油理化性质 林蛙油理化性质膨胀度蛋白质灰分水分粗脂肪膨胀度蛋白质灰分水分粗脂肪单因素实验单因素实验超声脱腥天然产物脱腥超声脱腥天然产物脱腥吸附时间添加量复配比超声时间超声功率吸附时间添加量复配比超声时间超声功率最佳脱腥工艺最佳脱腥工艺感官评定响应面法感官评定响应面法图1-1技术路线图Fig.1-1TechnologyRoadmap第2章材料与方法2.1材料与设备2.1.1实验材料林蛙油，吉林省长白山生态食品有限公司。2.1.2实验试剂(见表2-1)表2-1主要药品与试剂Tab.2-1Mainmedicinesandreagents名称纯级厂家氢氧化钠分析纯国药集团化学试剂有限公司硼酸分析纯国药集团化学试剂有限公司盐酸分析纯国药集团化学试剂有限公司甲基红分析纯国药集团化学试剂有限公司溴甲酚绿分析纯国药集团化学试剂有限公司浓硫酸分析纯国药集团化学试剂有限公司无水乙醚分析纯国药集团化学试剂有限公司TBA生化试剂国药集团化学试剂有限公司TCA分析纯国药集团化学试剂有限公司丙二醇分析纯国药集团化学试剂有限公司迷迭香提取物标准化提取物陕西海益斯生物科技有限公司芦笋提取物标准化提取物陕西海益斯生物科技有限公司2.1.3实验仪器(见表2-2)表2-2主要仪器设备Tab.2-2Maininstrumentsandequipment名称型号厂家磁力搅拌水浴锅SHJ-A4常州亿能实验仪器厂石墨消解仪SH220F海能未来技术集团股份有限公司全自动凯氏定氮机K9860海能未来技术集团股份有限公司电子天平AR244CN奥豪斯(上海)有限公司超声波恒温水浴锅NT-1015常州诺泰自动化设备有限公司高剪切分散机MBL50默格机械(上海)有限公司涡旋混合仪XW-80A上海驰唐电子有限公司低速大容量离心机DL-5-B上海安亭科学仪器厂紫外可见分光光度计UV-1800PC上海美普达仪器有限公司制冰机CM-140KE星歧欧洲有限公司真空干燥箱BZF-30上海博讯医疗生物仪器股份有限公司实验室纯水系统Smart-S15上海和泰仪器有限公司2.2实验方法2.2.1林蛙油理化性质的测定2.2.1.1水分测定林蛙油的水分测定方法参照GB5009.3-2016《食品中水分的测定》，采用直接干燥法，取三次测定结果的平均值。(2-1)式中:m1———称量瓶和林蛙油的质量(g)m2———称量瓶和干燥后的林蛙油质量(g)2.2.1.2灰分测定林蛙油的灰分测定方法参照GB5009.4-2016《食品中灰分的测定》，采用灰化法，取三次测定结果的平均值。(2-2)式中:m1———坩埚的质量(g)m2———坩埚和炭化后的林蛙油质量(g)2.2.1.3粗脂肪测定林蛙油的粗脂肪测定方法参照GB5009.6-2016《食品中脂肪的测定》，采用索氏提取法，取三次测定结果的平均值。(2-3)式中:m1———接收瓶的质量(g)m2———接收瓶和脂肪的质量(g)2.2.1.4总蛋白质测定2.2.1.4.1实验方法林蛙油的蛋白质测定方法参照GB5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》，采用凯氏定氮法。2.2.1.4.2溶液配制NaOH溶液：4g/mLNaOH。滴定酸：0.1mol/LHCl。甲基红指示剂：1g/L甲基红/95%乙醇溶液。溴甲酚绿指示剂：1g/L溴甲酚绿/95%乙醇溶液。混合指示剂：甲基红：溴甲酚绿=1：5。硼酸溶液：20g/L硼酸溶液：混合指示剂=100：1。2.2.1.4.3仪器参数石墨消解仪：曲线加热；210℃30min→280℃30min→320℃30min→420℃90min全自动凯氏定氮机：样品重量0.5000g；标准酸c(HCl)=0.1000mol/L；空白体积0.0000mL；蛋白系数6.25；硼酸15mL；稀释水10mL；碱液50mL；蒸馏5min。2.2.1.4.4全自动凯氏定氮法实验操作把0.5g左右的林蛙油样品用滤纸包好，放入消化管中，在每一根消化管中加入0.4g硫酸铜和6g硫酸钾，再准备三根空白，里面放入一张滤纸，加入0.4g硫酸铜和6g硫酸钾。在通风橱内用量筒量取消化液的体积12mL浓硫酸倒入消化管中，将每根消化管放上小漏斗冷凝回流。打开消解仪进行加热消解，直到没有白烟产生后冷却，颜色从绿变蓝后即可开始凯氏定氮。记录试液消耗盐酸标准滴定液的体积V1，空白试验消耗盐酸标准滴定液的体积V2，取三次测定结果的平均值。(2-4)式中:X———试样中蛋白质的含量(g/100g)；V1———试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积(mL)；V2———试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积(mL)；c———硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度(mol/L)；0.0140———1.0mL盐酸[c(HCl)=1.000mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量(g/mmoL)；V3———吸取消化液的体积(mL)；V4———消解溶液的定容体积(mL)；F———蛋白质折算系数；100———由g/g转化为g/100g的转换系数；注：蛋白质含量结果保留三位有效数字。2.2.1.5膨胀度测定林蛙油的膨胀度测定方法参照膨胀度测定法(通则2101)测定，取三次测定结果的平均值。(2-5)式中：S———膨胀系数；V———林蛙油膨胀后的体积(mL)；W———供试品按干燥品计算的重量(g)。2.2.2单因素实验2.2.2.1林蛙油样品预处理林蛙油剔除筋膜，挑选其中呈琥珀色蜡质状，具有脂肪样光泽的部分，拆分成粒径3mm的小块。2.2.2.2超声脱腥林蛙油样品的制备使用精度达到0.0001g的电子天平，精确称取0.5g林蛙油样品置于100mL离心管中，加入70mL蒸馏水后放入37℃超声波恒温水浴锅，按实验要求设定适宜的超声频率和时间；在超声过程中，每隔20min通过膜过滤滤出浸泡水，并且重新添加70mL蒸馏水继续超声处理；待超声结束后再使用膜过滤滤出样品中剩余的水分。2.2.2.3天然产物的制备按照实验要求计算并称取一定质量的迷迭香和芦笋，放入研钵中混合研磨至60目以上，混合所得天然产物用50mL离心管收集中备用。2.2.2.4天然产物脱腥林蛙油样品的制备使用精度达到0.0001g的电子天平，精确称取0.5g林蛙油样品置于100mL离心管中，按实验要求称取一定质量的天然产物，用70mL蒸馏水溶解后置于超声波恒温水浴锅中功率500W超声10min混匀，加入置有林蛙油样品的100mL离心管中；根据实验要求浸泡一定时间后，使用膜过滤滤出样品中的天然产物溶液。2.2.2.5TBA，TCA溶液的配置0.02mol/LTBA溶液：精确称量0.2883g的TBA粉末，转移至烧杯中，加入适量蒸馏水(约50mL)，搅拌溶解；将溶液转移至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，摇匀；避光保存于棕色玻璃瓶中。20%TCA溶液：使用精确到0.0001g的电子天平精确称量20g三氯乙酸晶体，转移至烧杯中，加入适量蒸馏水(约50mL)，搅拌溶解；将溶液转移至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，摇匀；避光保存于棕色玻璃瓶中。2.2.2.6TBARs值的测定向处理后的林蛙油样品中加入20%TCA溶液25mL，用分散均质机均质20s，涡旋混合仪涡旋30s，再使用5000r/min的高速离心机离心15min；离心结束后，吸取上清液5.00mL于25mL比色管中，每个样品吸取两次，分为实验组与对照组，实验组中加入0.02mol/LTBA溶液5mL，对照组中加入蒸馏水5mL，混匀，沸水浴20min取出，冰水浴15min冷却样品，在532nm处测定吸光值，每组样品重复3次，结果取平均值。测得实验组与对照组吸光度的差值即为林蛙油的TBARs值。2.2.2.7TBARs值标准曲线的绘制吸取相当与丙二醇50μg的标准溶液0、0.05、0.1、0.2、0.4、1、2mL置于10mL比色管中，加水稀释至总体积5.00mL，加入5.00mLTBA溶液，然后按样品测定步骤测得吸光度，绘制标准曲线。2.2.3Bok-Behnken响应面实验2.2.3.1复合脱腥林蛙油样品的制备天然产物溶液制备：按实验要求称取一定质量的天然产物，用70mL蒸馏水溶解后置于超声波恒温水浴锅中功率500W超声10min混匀备用。复合脱腥林蛙油样品的制备：使用精度达到0.0001g的电子天平，精确称取0.5g林蛙油样品置于100mL离心管中，加入70mL天然产物溶液后放入37℃超声波恒温水浴锅，按实验要求设定适宜的超声频率和时间；在超声过程中，每隔20min通过膜过滤滤出浸泡液，并且重新添加70mL天然产物溶液继续超声处理；待超声结束后再使用膜过滤滤出样品中剩余的液体。2.2.3.2Bok-Behnken响应面试验设计根据单因素试验的结果，以超声时间(A)、天然产物添加量(B)、天然产物吸附时间(C)作为自变量，以复合脱腥林蛙油TBARs值作为响应值，设计3因素3水平试验，采用Bok-Behnken进行工艺优化。响应面试验因素及水平设计见表2-3。表2-3响应面试验因素及水平设计Tab.2-3Responsesurfacetestfactorsandhorizontaldesign水平A/minB/mgC/min-1453044506034360175382752.2.4应用模糊数学模型建立感官评价体系2.2.4.1建立感官评价体系2.2.4.1.1确定评价对象集设评价对象集X={x1，x2，x3……xi}，此集合代表了需评估的所有样品。xi表示用于评估的各类脱腥林蛙油样本。2.2.4.1.2确定评价因素集将脱腥林蛙油的感官品质评估指标定义为集U={u1，u2，u3}，ui表示需要进行感官评价的因素集，u1，u2，u3分别表示脱腥林蛙油样品的香气、色泽、组织状态。2.2.4.1.3确定评价权重集针对10位感官评估团队成员对脱腥林蛙油样本的香气、色泽、组织状态三个指标的打分情况，各项评价指标得分与总分100的比例确定了其权重，权重的总和为1，即权重集V=(v1，v2，v3}，v1+v2+v3=1。vi是各评价指标相应的隶属度。2.2.4.1.4模糊矩阵的建立和模糊转换构建模糊矩阵及执行模糊转换是模糊集理论中的关键操作，旨在处理不确定性与模糊性，其目的在于更精确地模拟现实世界中复杂的决策过程与系统行为。统计10名感官评定小组成员对脱腥林蛙油样品的香气、色泽、组织状态的评价，然后统计评价结果。将各等级(优、良、中、差)的最终票数除以感官评定总人数(10)，得模糊矩阵R。感官指标综合评判集Y=V×R。2.2.4.1.5建立评语集，计算感官评分为了量化脱腥林蛙油样品的感官质量，小组讨论确定脱腥林蛙油感官质量的评语集W={W1，W2，W3，W4}，其中W1，W2，W3，W4分别表示优、良、中、差，赋值90、70、50、30，即V={90，70，50，30}，最终模糊数学感官评价总分Z=Y×W。2.2.4.2单因素试验按2.2.3.1的方法制备林蛙油凝胶食品，分别考察超声时间(30min、45min、60min、75min、90min、W/W)，天然产物添加量(265mg、304mg、343mg、382mg、421mg，W/W)，天然产物吸附时间(30min、45min、60min、75min、90min、W/W)，由感官评定小组的10位成员基于脱腥林蛙油的香气、色泽、组织状态3个因素为进行感官评估，，并通过打分量化分析，进而揭示了每种因素对感官评分的具体贡献。这一分析旨在精确定位最佳的操作条件，以期在保持食品品质的同时，最大程度地提升消费者的接受度。2.2.4.3正交试验选取超声时间、天然产物添加量、天然产物吸附时间三个考察因素，每个因素选取三个水平，对脱腥林蛙油的工艺参数进行正交优化。正交因素水平表见表2-4。表2-4正交实验因素水平表Tab.2-4Factorsandlevelsoforthogonaltest因素水平A超声时间(min)B天然产物添加量(mg)C天然产物吸附时间(min)1453044526034360375382752.2.4.4感官评价统计10名感官评定小组成员对脱腥林蛙油产品的香气、色泽、组织状态3项感官指标的评价，每观察和嗅闻一次后用咖啡豆重置嗅觉，间隔10min再进行观察和嗅闻。具体评分标准如表2-5所示。表2-5脱腥林蛙油感官评定指标Tab.2-5Sensoryevaluationindexofproducts评价指标感官描述等级香气无明显腥味，气味协调有较淡腥味，气味较协调腥味明显，不协调强烈腥味优良中差色泽透明均一，亮黄半透明，黄较浑浊，深黄，局部发褐不透明，暗沉发褐优良中差组织状态凝胶性好，无松散凝胶性较好，轻微松散凝胶性较差，部分松散凝胶性差，完全松散优良中差第3章结果与讨论3.1林蛙油的理化性质表3-1林蛙油样品理化指标Tab.3-1PhysicalandchemicalindicatorsofOviductusRanaesamples成分名称林蛙油理化指标%水分16灰分9.1粗脂肪5.5蛋白质42.5膨胀度(mL/g)112.73本研究对林蛙油的基本理化性质进行了系统测定，见表3-1，根据《中国药典》及GB/T19507-2008《地理标志产品吉林长白山中国林蛙油》，林蛙油的理化指标需满足水分≤18%，膨胀度≥100mL/g。实验数据表明，所选林蛙油样品的水分及膨胀度均符合药典和相关规定，其水分含量为16%，膨胀度为112.73mL/g，反映出样品具有较高的吸水膨胀能力，这一特性可能与其蛋白质及多糖的结构有关，灰分为9.1%，粗脂肪为5.5%，蛋白质含量高达42.5%，说明其品质优良，活性成分丰富，符合后续脱腥工艺研究的原料要求。林蛙油的基础理化性质测定表明其蛋白质含量高，脂肪含量低，因此在脱腥过程中需重点关注去除水溶性腥味物质，同时需避免过度处理导致热敏性蛋白质的变性或功能损失。实验结果验证了样品的合规性与研究可行性，为超声联合天然产物的协同脱腥工艺的优化提供了重要依据。3.2林蛙油单因素脱腥最佳参数3.2.1TBARs值标准曲线回归方程y=0.0229x+0.0007，线性范围0-10μg。实验结果表明线性关系较好。实验结果见如图3-1。图3-1TBARs值标准曲线Fig.3-1ThestardardcurveofTBARsvalue03.2.2空白组TBARs值空白组(未经脱腥处理的林蛙油)的TBARs值为303.28±5.29μg/g(RSD=5.29%)，见表3-2，显著高于所有实验组，表明未处理样品中脂质氧化产物(如丙二醛)含量较高，腥味物质积累明显。该结果为脱腥工艺的必要性提供了直接依据，同时验证了超声联合天然产物处理对氧化腥味物质的高效去除效果。空白组数据的稳定性(RSD<6%)也为后续工艺优化及实验结果的可靠性奠定了基线参考。表3-2林蛙油空白样品的TBARs值Tab.3-2TheTBARsvalueoftheblanksampleofOviductusRanae供试品编号TBARs值(μg/g)平均值RSD(%)1277.07303.285.292322.933316.384316.385316.386270.523.2.3超声单因素对脱腥效果的影响图3.2(A)和图3.2(B)分别描述了不同超声时间和功率对林蛙油TBARs值的影响。如图所示，在超声时间为60min，超声功率为500W时，林蛙油的TBARs值为157.5μg/g，去腥效果达48.06%。(A)超声功率(W)(A)Ultrasonicpower(W)(B)超声时间(min)(B)Ultrasoundtime(min)图3-2超声单因素对TBARs值的影响Fig.3.2Theinfluenceofsingle-factorultrasoundonTBARsvalues3.2.4天然产物单因素对脱腥效果的影响图3.4和图3.5分别描述了不同天然产物配比，天然产物添加量与吸附时间对林蛙油TBARs值的影响。如图所示，在天然产物配比为迷迭香：竹笋=4：1，天然产物添加量为343mg，吸附时间为60min时，，林蛙油的TBARs值为132.2μg/g，去腥效果达56.4%。天然产物复配比(A)Compoundratio(B)天然产物添加量(mg)(B)Additionamount(mg)(C)天然产物吸附时间(min)(C)Adsorptiontime(min)图3-3天然产物单因素对TBARs值的影响Fig.3.2TheinfluenceofsinglefactorsofnaturalproductsontheTBARsvalues3.3响应面优化实验3.3.1响应面及方差分析结果采用DesignExpert12.0.3.0软件，将响应面试验得到的17组数据拟合到二阶多项式模型中，得到模型方程：YTBARs值=121.32+6.87A+16.73B+6.13C+2.46AB+5.09AC-4.5BC+32.66A2+44.07B2+11.43C2。表3-3响应面实验结果Tab.3-3Experimentalresultsofresponsesurface编号ABCTBARs/(μg/g)145(-1)304(-1)60(0)193.001245(-1)382(+1)60(0)124.049375(-1)304(-1)60(0)154.398475(-1)382(+1)60(0)120.774545(-1)343(0)45(-1)184.398645(-1)343(0)75(-1)168.948775(-1)343(0)45(-1)160.424875(-1)343(0)75(-1)223.175960(0)304(-1)45(-1)124.0491060(0)304(-1)75(-1)151.6471160(0)382(+1)45(-1)193.6991260(0)382(+1)75(-1)177.8481360(0)343(0)60(0)117.1491460(0)343(0)60(0)160.2241560(0)343(0)60(0)206.81660(0)343(0)60(0)186.6251760(0)343(0)60(0)120.599方差分析通过P值验证模型的可信性，P值越小表示该系数对脱腥效果的影响越显著。由表3-4可知，该模型的F值为181.38，P值小于0.0001，表示预测模型显著，有效可靠。通过比较P值，得出4个因素对林蛙油脱腥率的影响效果为：天然产物添加量(B)>超声时间(A)>天然产物吸附时间(C)。模型失拟项不显著，结果为0.3055，表明无明显的测定误差或异常值影响模型的拟合效果。拟合得到TBARs值的二次多项方程的回归系数R2为0.9957，AdjR2为0.9902，表明试验数据和预测值的拟合度较好，可用于优化超声联合天然产物对林蛙油脱腥的影响并研究各因素间的交互作用。表3-4二次模型拟合的反差分析结果Tab.3-4Thecontrastanalysisresultsofthequadraticmodelfitting项目平方和自由度均方F值P值显著性模型17512.9091945.88181.38<0.0001**A377.471377.4735.190.0006**B2238.9412238.94208.70<0.0001**C300.491300.4928.010.0011**AB24.13124.132.250.1773AC103.791103.799.670.0171*BC80.99180.997.550.0286*A24491.9914491.99418.72<0.0001**B28177.0318177.03762.22<0.0001**C2550.191550.1951.290.0002**残差75.10710.73失拟项41.99314.001.690.3055纯误差33.1148.28总和17588.0016R2=0.9957AdjR2=0.9902PreR2=0.9589注：P＜0.01为极显著，用**表示，P＜0.05为显著，用*表示。3.3.2各交互作用对林蛙油脱腥率的影响(见图3-4)超声时间和天然产物量对TBARs值的影响超声时间和吸附时间对TBARs值的影响天然产物量和吸附时间对TBARs值的影响图3-4各交互作用对TBARs值的影响Fig.3-4TheinfluenceofeachinteractionontheTBARsvalue由图3-4可知，C和A或B构成的曲面较为陡峭，表明这些组合的两者交互作用对TBARs值的影响最显著，A和B的曲面相对平缓，暗示这个组合的交互作用较弱。最终确定优化参数为超声时间58.868min，天然产物添加量335.113mg，天然产物吸附时间55.636min，预测的脱腥林蛙油TBARs值为118.480μg/g。3.3.3模型验证结果为了验证数学模型优化的结果，按照模型预测的试验条件，进行3次平行的超声联合天然产物复合脱腥试验，以验证模型预测的可靠性。为了便于实际操作，将超声时间、天然产物添加量、天然产物吸附时间分别调整为60min、335mg和55min。由表3-5可知，脱腥林蛙油TBARs预测值为，按照实际情况调整后，脱腥林蛙油TBARs值为(113.320±2.65μg/g)，两者的相对偏差为3.65%，表明试验结果与预测值吻合性较好，可用于林蛙油的超声联合天然产物复合脱腥技术优化。通过响应面法确定各因素的最佳工艺参数为：超声时间60min，天然产物添加量343mg/0.5g，天然产物吸附时间55min。各因素对林蛙油凝胶态产品感官评分影响的主次顺序为：天然产物添加量(B)>超声时间(A)>天然产物吸附时间(C)。表3-5二次模型拟合的反差分析结果Tab.3-5ContrastanalysisResultsofthesecondarymodelfitting项目A/minB/mgC/minTBARs值理论值58.868335.11655.623118.480实际值600.33555113.3203.4感官评价分析结果3.4.1单因素实验结果与分析超声时间(min)(A)Ultrasoundtime(min)天然产物添加量(mg)(B)Amountofnaturalproductsadded(mg)吸附时间(min)(C)Adsorptiontime(min)图3-5三因素对感官评分的影响Fig.3-5Theinfluenceofthreefactorsonsensoryscoring图3-5显示，随着超声时间、天然产物添加量、天然产物吸附时间的增加，感官评分均表现出先上升后下降的变化规律。图3-5(A)显示，超声处理时间为60min时效果最佳。超声处理时间不足时，空化作用较弱，无法充分破坏腥味物质的分子结构，致使脱腥效果不理想；反之，若超声时间过长(>60min)，空化效应产生的高温高压环境可能促使脂质发生二次氧化，生成丙二醛等挥发性异味化合物，同时还可能损害林蛙油中的热敏性成分，例如不饱和脂肪酸，从而降低产品的感官品质。图3-5(B)显示，天然产物的最佳添加量为343mg。当天然产物添加量不足时，迷迭香酸和芦笋多酚的吸附位点有限，难以充分结合腥味成分；而添加过量(>343mg)则易导致自身氧化反应，例如迷迭香酸转化为醌类化合物，进而引发轻微苦涩感，同时残留的吸附剂还可能破坏凝胶体系的稳定性，影响产品质地表现。图3-5(C)显示，天然产物的最佳吸附时间为60min。吸附时间过短(<60min)，腥味成分尚未充分扩散至吸附剂表面，难以实现有效去除；而吸附时间过长(>60min)，已结合的腥味物质可能出现解吸现象，同时天然成分在水相中长时间暴露可能发生水解或氧化反应，不仅削弱脱腥能力，还可能对产品色泽稳定性产生不利影响。3.4.2正交试验模糊评判结果3.4.2.1各评定指标权重的确定本试验以主观赋权法确定各指标的权重，10名感官评价小组成员分别对脱腥林蛙油的香气、色泽及组织状态三项评价指标进行重要性评分，为了降低个体差异和实验误差，最终以各项指标得分平均值与满分100的比值作为权重计算依据，相关结果见表3-6，最终求得香气、色泽、组织状态的权重分别为0.45，0.27，0.28即权重集V={0.45，0.27，0.28}。表3-6各评定指标权重统计分析表Tab.3-6Statisticalanalysisofweightsforevaluationindicators编号香气色泽组织状态15020302453520340253542040405503020650203075525208452530950302010452035平均值452728权重0.450.270.283.4.2.2模糊数学感官评价结果与分析10名感官评价小组员以脱腥林蛙油的香气、色泽、组织状态3个因素为评价指标，对正交试验中9组样品进行等级评价，评价结果见表3-7。表3-7感官评价结果Tab.3-7SensoryEvaluationResults试验编号香气色泽组织状态优良中差优良中差优良中差1064006403700237001900370035500055004514190046002800527106400550061900082046007073007304600808206400010009064073004600将表3-7中各样品的各等级评价人数除以总评价人数，得到样品1号~9号的模糊矩阵Ri。 基于模糊变换法则，1~9号样品评价结果为Y=V×R，各试验组的模糊综合评判结果见表3-8。表3-8各评价对象综合评判集Tab.3-8ComprehensivesensorYevaluationofsamplesYj评价结果表Y1(0.0840.6280.2880)Y2(0.2460.75400)Y3(0.2250.4720.2750.028)Y4(0.2090.79100)Y5(0.3920.5630.0450)Y6(0.1570.7890.0540)Y7(0.1120.6720.2160)Y8(0.1620.7480.090)Y9(0.3010.5190.180)依据公式Z=Y×W进行模糊评估后的综合评分如下：Z1=65.92，Z2=74.92，Z3=67.88，Z4=74.18，Z5=76.94，Z6=72.06，Z7=67.92，Z8=71.44，Z9=72.42。3.4.2.3正交优化试验结果与分析模糊综合评估的最终得分是通过综合评价结果(见表3-8)与其对应的评分标准