沃特世ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱仪标准操作指南（SOP）

沃特世ACQUITYUPLCI-Class超高效液相色谱仪标准操作指南（SOP）文档说明适用仪器：WatersACQUITYUPLCI-Class（二元高压梯度泵、样品管理器SM、PDA/TUV检测器、柱温箱）配套软件：Empower3色谱工作站适用场景：常规液相定量/定性检测、梯度洗脱、等度洗脱、色谱方法开发，适配医药、食品、环境、化工检测实验室编制目的：统一标准化操作流程，降低仪器故障、避免色谱柱损伤、杜绝基线异常、保障数据合规可追溯一、仪器组成及核心部件认知1.1整机模块构成BSM二元溶剂管理泵：系统输液核心，提供高压梯度流动相输送，最高耐压15000psi，支持四通道溶剂切换FTN样品管理器（自动进样器）：自动进样、洗针、样品温控，支持微量进样、旁路进样ColumnManager柱温箱：精准控制色谱柱温度，控温范围4℃~65℃，保障保留时间稳定PDA光电二极管阵列检测器/TUV紫外检测器：样品组分紫外吸收检测，实时采集色谱基线与图谱SealWash柱塞清洗模块：持续清洗柱塞杆，防止缓冲盐析出磨损泵密封垫网络集线器：整机数据通讯枢纽，所有硬件模块统一联网传输数据1.2管路标识区分A1/A2：水相/缓冲盐流动相管路B1/B2：有机相（乙腈/甲醇）流动相管路SealWash：柱塞清洗液管路NeedleWash：洗针液管路（强洗针、弱洗针双路）二、实验前期准备（必做，避免基线噪声、泵压波动）2.1流动相配制要求（UPLC严苛标准）纯水：必须使用18.2MΩ·cm超纯水，每日现配，禁止使用普通蒸馏水有机溶剂：色谱纯乙腈/甲醇，禁止工业级、分析纯溶剂缓冲盐体系：磷酸盐、乙酸盐等缓冲盐需经0.22μm水相滤膜真空过滤，有机相经0.22μm有机滤膜过滤全程超声脱气：流动相超声脱气15min，UPLC高压体系严禁气泡，气泡会直接导致压力波动、鬼峰、保留时间漂移添加剂注意：三氟乙酸、甲酸、乙酸等改性剂按需添加，配比精准，现配现用2.2清洗液配制标准柱塞清洗液（SealWash）：5%甲醇超纯水，持续清洗泵柱塞，防止盐结晶磨损密封垫弱洗针液：10%甲醇水溶液，清洗进样针外壁残留样品强洗针液：80%乙腈水溶液，清洗针内壁顽固残留、交叉污染2.3样品前处理样品使用对应流动相溶解，避免溶剂效应所有样品上机前0.22μm有机/水相滤膜过滤，严禁颗粒物进入流路损伤色谱柱和进样针选用沃特世原装2mL样品瓶，瓶盖垫压紧，避免漏液、气泡，禁止使用非标样品瓶刮伤进样针2.4色谱柱安装规范区分色谱柱流向：箭头标识为流动相流向，禁止反接手拧接头至拧紧后再微调1/4圈，禁止蛮力扳手拧死，防止PEEK管螺纹滑丝色谱柱安装后，先低流速平衡，再升至实验流速三、标准开机流程（顺序严禁颠倒）3.1硬件开机顺序第一步：打开网络集线器电源，等待通讯指示灯常亮（通讯基础）第二步：开启BSM二元泵电源、FTN自动进样器电源，仪器整机自检，等待硬件无报错第三步：开启柱温箱电源，设定实验所需柱温，提前预热第四步：待泵体流路有液体流出、压力稳定后，开启PDA/TUV检测器电源，检测器自检完成第五步：打开电脑，登录Empower3工作站软件3.2软件端联机与流路灌注（核心除气泡步骤）3.2.1柱塞清洗液灌注工作站进入【系统控制台】，选中BSM泵模块点击Control→PrimeSealWash，启动柱塞清洗液灌注直至清洗液管路连续无气泡流出，点击停止3.2.2流动相湿灌注（WetPrime）点击Control→PrimeA/BSolvents选择对应流动相通道A1/A2、B1/B2，灌注时间设置3min，流速固定8mL/min（系统默认，无需修改）梯度通道依次灌注，彻底排除泵头、管路内气泡3.2.3自动进样器洗针与注射器灌注选中FTN进样器，Control→PrimeSyringes，灌注注射器5~7次（更换流动相必须增加灌注次数）Control→WashNeedle，设置弱洗针200μL、强洗针300μL，完成针体全面清洗3.3系统平衡设置初始方法流速、流动相比例、柱温，系统Run运行等待基线平直、压力稳定波动范围≤50psi，方可进样检测四、Empower3工作站方法建立与样品运行操作4.1新建仪器方法登录Empower→新建项目→新建仪器方法泵参数设置：设定流速、梯度洗脱程序、流动相A/B比例、系统最大压力上限（常规设置12000psi）柱温箱参数：设置柱温，一般液相常规检测35℃~40℃进样器参数：设置进样体积、洗针程序、进样针清洗模式检测器参数：设置检测波长、采样频率、运行时长，PDA检测器可设置光谱采集范围保存仪器方法，命名归档，方便后续直接调用4.2新建样品组与进样序列进入【运行样品】界面，新建进样序列依次录入：空白溶剂、对照品、标准曲线、待测样品、质控样品绑定已建好的仪器方法，核对样品瓶位、进样体积、运行时间4.3样品运行与实时监控核对序列无误后，点击【开始运行】，系统自动进样检测实时监控：泵压力曲线、基线噪声、色谱峰出峰情况压力异常飙升、基线漂移严重时，立即暂停运行，排查气泡、管路堵塞问题4.4数据处理与图谱导出样品运行结束后，进入【浏览项目】新建处理方法，设置积分参数、保留时间窗口、峰宽阈值自动积分校准，完成标准曲线拟合、样品含量计算导出PDF图谱、原始数据、结果报告，统一归档保存五、分级关机流程（缓冲盐体系&无盐体系区分操作，重中之重）5.1含缓冲盐流动相关机（最常用，禁止直接关泵）第一步：冲洗盐体系（防止盐结晶堵柱、堵泵）：更换无盐纯水，100%纯水，0.3mL/min流速冲洗色谱柱+整机流路30min，彻底冲走管路和泵头内缓冲盐第二步：过渡有机相：切换至50%乙腈水溶液，冲洗20min第三步：整机保柱封存：100%纯乙腈，0.3mL/min冲洗30min，色谱柱和流路全程保存在纯乙腈中第四步：硬件关机：缓慢降流速至0→检测器Standby关机→关闭检测器电源→关闭自动进样器、泵电源→关闭集线器→关闭电脑第五步：软件退出：正常退出Empower软件，禁止强制关机5.2纯有机相/无盐流动相关机直接使用100%乙腈冲洗流路20min，后续关机步骤同上，无需纯水除盐步骤5.3短期待机（停机1-3天）无需关机，系统保持0.1mL/min纯乙腈低流速待机，柱温箱保持30℃，保护色谱柱，减少再次平衡时间六、日常维护与周期性保养计划6.1每日维护检查流动相余量、清洗液余量，及时补充查看废液桶液位，废液不得超过桶体2/3，防止废液倒灌损坏检测器观察运行压力、基线状态，记录仪器运行日志擦拭自动进样器托盘，清理洒落样品6.2每周维护更换全部柱塞清洗液、洗针液清洗流动相溶剂过滤头，超声清洗10min检测器基线校准、自动归零6.3月度维护检查泵密封垫磨损情况，压力波动异常及时更换清理检测器流通池，消除残留污染校准进样器进样精度七、常见故障快速排查表故障现象根本原因快速解决方法系统压力持续波动、压力忽高忽低管路存在气泡、溶剂过滤头堵塞、泵密封垫老化重新湿法灌注排气泡；清洗过滤头；更换泵密封垫基线噪声大、无规律毛刺峰流动相未脱气、流通池污染、检测器未预热完成重新超声脱气；清洗流通池；检测器预热30min再运行保留时间持续漂移柱温不稳定、流动相配比偏差、色谱柱未平衡完全锁定柱温；重新配制流动相；延长系统平衡时间出现规律鬼峰洗针液污染、进样针残留交叉污染更换新鲜洗针液；加强洗针次数系统压力超高报警色谱柱堵塞、管路弯折、过滤器堵塞排查管路；反冲保护柱；更换在线过滤器筛板自动进样器无法进样样品瓶液位不足、进样针偏移、注射器进气泡补充样品；重新校准进样针；灌注注射器排气八、高危操作禁忌（严禁操作，避免仪器不可逆损坏）❌禁止带缓冲盐流动相直接关机，盐结晶会直接击穿泵头与色谱柱❌禁止高压下拆卸管路、色谱柱，高压喷液极易造成人身伤害和流路进气❌禁止使用未过滤、未脱气流动相上机❌禁止色谱柱反接高压运行❌禁止废液桶满溢运行，废液倒灌会直接损坏检