精讲册第23章　基因工程

第5部分生物技术与工程第23章基因工程高考生物学某省市专用目录第1节重组DNA技术的基本工具和DNA的粗提取

考点清单

即练即清第2节PCR和电泳

考点清单

即练即清

考法清单第3节基因工程的基本操作程序和蛋白质工程

考点清单

即练即清

考法清单提升提升第1节重组DNA技术的基本工具和DNA的粗提取一、重组DNA技术的基本工具“分子手术刀”——限制性内切核酸酶(限制酶)来源主要是原核生物作用具体作用识别并切割双链DNA分子的特定核苷酸序列作用化学键磷酸二酯键作用结果限制酶切割DNA分子产生的末端通常有两种形式(如图所示):

“分子缝合针”——DNA连接酶作用将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键分类E.coliDNA连接酶来自大肠杆菌,连接互补的黏性末端和平末端,但连接具有平末端的DNA片段的效率远低于T4DNA连接酶T4DNA连接酶来自T4噬菌体,连接互补的黏性末端和平末端“分子运输车”——基因载体作用将目的基因导入受体细胞种类质粒(最常用)定义裸露的(不与组蛋白结合)、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细

胞拟核DNA之外,并具有自我复制能力的环状双链DNA分子结构特点具有复制原点(在细胞中能够自我复制)、标记基因(便于重组DNA分子的

筛选)、一个至多个限制酶切割位点(供目的基因插入)其他载体噬菌体、动植物病毒等错

DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化磷酸二酯键形成,但DNA连接酶连接两

个DNA片段,DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有核酸片段3'端。二、DNA的粗提取与鉴定实验原理(1)DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理,可以初步分离DNA与蛋白质;(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2mol/L的NaCl溶液;(3)DNA+二苯胺试剂

蓝色实验步骤

知识归纳

DNA粗提取与鉴定中的注意事项(1)本实验的研磨液中含SDS(可使蛋白质变性与DNA分离)、EDTA(为DNA酶抑制剂,

可防止细胞破碎后DNA酶降解DNA)、Tris(提供缓冲体系,使DNA呈稳定状态)。实验

中若遇到实验试剂缺乏的情况,可以用家用洗洁精(含SDS)或质量分数为10%的洗衣粉

水溶液(含有蛋白酶和表面活性剂,可用解洗衣粉)替代研磨液,也能达到裂解细

胞膜、让蛋白质变性的目的。(2)在DNA进一步提纯时,选用冷却的体积分数为95%的酒精的作用是溶解蛋白质杂质

和析出DNA。(3)鉴定过程需要沸水浴加热,且二苯胺试剂可用于鉴定DNA,但无法检测溶液中是否

含蛋白质杂质。即练即清从真题到教材1.限制性内切核酸酶(简称:限制酶)可以识别双链DNA分子特定的

,并且

使每一条链中特定部位的

断开,产生

末端或

末端。DNA连接酶

主要有两类:E.coliDNA连接酶和

连接酶,这两类酶都能将双链DNA片段“缝

合”起来,恢复

,但E.coliDNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率

要远远低于T4DNA连接酶(2023重庆,12)(2023新课标,6)。核苷酸序列磷酸二酯键黏性平T4DNA磷酸二酯键2.DNA粗提取与鉴定(1)实验中涉及的主要试剂及作用试剂作用体积分数为95%的冷酒精溶液溶解蛋白质,提取DNA2mol/L的NaCl溶液溶解

二苯胺试剂鉴定DNA(2)在

条件下,DNA遇

呈现蓝色(人教版选必3P74—75)(2023江苏,9)(2023广东,11)。DNA沸水浴二苯胺试剂第2节PCR和电泳提升PCR和琼脂糖凝胶电泳PCR原理DNA半保留复制和DNA的热变性条件模板含有待扩增序列的基因组DNA或从mRNA逆转录来的cDNA原料四种游离的脱氧核苷酸或脱氧核苷三磷酸(dNTP)引物一般为根据目的基因两端序列设计的能与之互补配对的短单链核酸(一般需要选择2种引物分

别扩增两条模板链)酶耐高DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)缓冲液需含有Mg2+,以激活DNA聚合酶步骤和结果

琼脂糖凝胶电泳电泳的定义DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,

这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极某著名企业检测原理在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来知识拓展

PCR扩增后进行电泳结果异常分析未出现扩增条带的可能原因模板DNA含有杂蛋白或TaqDNA聚合酶的抑制剂;TaqDNA聚合酶失活;引物出现质量问题;引物浓度不合适;Mg2+浓度过低;变性低;变性时间过短等出现非特异性扩增条带的可能原因模板DNA出现污染;TaqDNA聚合酶出现质量问题;引物特异性不强(如与非目的序列有同源性)或形成引物二聚体;Mg2+浓度过高;复性时的低;PCR循环次数过多等小表达PCR技术操作中为什么需要用2种不同的引物?

。DNA分子由两条反向平行的脱氧核苷酸链构成,PCR扩增时只能从各自模板链的3'端开始,故需碱基序列不同的2种引物即练即清真题选改判1.(2024河北,13)利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后,在紫外灯下观察结

果。

(

)√2.(2024湖南,15)电泳时产物的片段越小,迁移速率越慢。

(

)×解析

其他条件一致时,电泳时,产物的片段越大,迁移速率越慢。3.(2024黑、吉、辽,7)采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验中,琼脂糖凝胶浓度的

选择需考虑待分离DNA片段的大小。

(

)√解析

在琼脂糖凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度有关,一般而言,对于较大的

DNA片段,需要选择较低浓度的凝胶,对于较小的DNA片段,需要选择较高浓度的凝胶。从真题到教材4.利用PCR获取目的基因:需要

作为原料,通过

方式打开DNA双链,利用

催化合成DNA子链,同时要加入一对引物,引物的作用是

(2022江苏,24)(2022山东,25)(2022辽宁,12)。4种脱氧核苷酸加热耐高DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸5.PCR产物一般通过

来鉴定,在凝胶中DNA分子的

与凝胶的浓度、DNA分子大小和构象等有关,凝胶中的DNA通过染色后,可在300nm的

下被检测出来(2024河北,13)(2024黑、吉、辽,7)。琼脂糖凝胶电泳迁移速率紫外灯PCR引物的设计原则、选择及结果分析1.PCR引物的设计原则、选择引物的设计原则(1)引物是一段短单链核酸,且能与DNA母链的一段碱基序列互补配对;(2)引物的5'端可以被修饰,而3'端一般需与DNA模板链严格互补配对,不可被修饰。5'端常见的修饰:加酶切位点、加荧光标记、引入突变位点等;(3)PCR过程中,引物一般成对存在且成对的引物不能碱基互补配对判断引物的方向(1)判断引物的3'端、5'端:引物与DNA模板链的3'端互补,方向相反;(2)DNA复制:子链沿引物的5'→3'方向延伸;(3)由此可知,甲、乙、丙、丁四个引物的扩增方向如图1所示

根据扩增目的选择引物(1)若扩增目的基因序列,则应选择图1中的引物乙、丙;(2)若要检验目的基因是否以正确方向插入质粒相应位点,应设计一个引物与目的基因外部序列(即

质粒序列)碱基互补配对,另一个引物与目的基因序列碱基互补配对,如图2所示的引物1、2

2.结果分析(1)DNA分子数分析(以1个DNA分子为例)复制次数1次2次3次n次DNA分子数2482n含引物的DNA分子数2482n含引物A(或B)的DNA分子数1=21-13=22-17=23-12n-1同时含引物A、B的DNA分子数0=21-22=22-26=23-22n-2共消耗的引物(A和B)数量2=22-26=23-214=24-2

-2两条单链等长的DNA分子数(2个引物均与模板链碱基互补配对)0=21-20=22-42=23-62n-2n(2)电泳图像分析

根据条带位置判断DNA分子大小①泳道1为Marker,由一些分子大小已知的DNA片段组成,可以作

为电泳结果中的参考系,以反映出待测片段的分子大小。如泳道

4中的DNA片段在3000bp~5000bp。②当DNA构象相同、电泳条件基本一致时,相对分子质量大的DNA分子迁移速率较小,相对分子质量小的DNA分子迁移速率较大,故泳道3的片段①的相对分子质量>片段②的相对分子质量根据电泳条带判断限制酶酶切位点数量泳道2和泳道3为同一个质粒经不同限制酶处理得到的结果。泳道2只有1条条带,说明质粒含0或1个相应限制酶切割位点。泳道3含2条条带,说明质粒含2个相应限制酶切割位点。假设泳道2中

DNA分子为4800bp,则泳道3中DNA分子的大小分别为3000bp

(片段①)和1800bp(片段②)典例1

(2024届南京、盐城一模,14)稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现,水稻蜡质基因(Wx)编码直链淀粉合成酶。若Wx基因中第226位碱基是正常

的G,该位点所在内含子能被正常剪切,胚乳中直链淀粉含量最高,基因型记作GG;若该

位点突变成T,则不能被正常剪切,胚乳中直链淀粉合成水平会降低,基因型记作TT。为

检测Wx基因该位点碱基是G或T,研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料,以Wx基因片

段设计引物如图所示,对PCR扩增产物经AccⅠ酶切后电泳。已知引物1为5'-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3',两引物之间无另外的AccⅠ的识别位点。下列说法

正确的是

(

)A.该实验中需设计的引物2为5'-TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3'B.若酶切产物只能观察到460bp的DNA条带,则表明该水稻品种为GG型C.GT杂合型水稻品种酶切电泳结果为3条条带D.组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸种类不同,数目相同答案

C解析

题干中给出的引物1序列和图中引物1设计区序列相同,且引物1设计区和引物2

设计区位于一条DNA链上,分析可知:故引物2的碱基序列应与引物2设计区碱基序列互补配对,则该实验中需设计的引物2为

5‘-ATGATTTAACGAGAGTTGAA-3’,A错误。据图可知,PCR产物从71bp开始,到530bp为止,共460bp,若酶切产物只能观察到460bp的DNA条带,说明内含子未被剪切,第226位碱基是T,该水稻品种为TT型;GT杂合型水稻品种含正常基因和突变基因,正常基因中有一个限制酶识别位点,而突变基因中无限制酶识别位点,因此GT杂合型水稻品种酶切电泳结果为3条条带,B错误,C正确。组成题述两种淀粉合成酶的氨基酸的数目不同,D错误。典例2

(2024届淮安六校联盟学情调研,13)一种双链DNA分子被三种不同的限制酶切

割,切割产物通过电泳分离,用大小已知的DNA片段的电泳结果作为分子量标记(图中

左边一列)。关于该双链DNA,下列说法错误的是

(

)A.呈环状结构B.分子质量大小为10kbC.有一个NotⅠ和两个EcoRⅠ切点D.其NotⅠ切点与EcoRⅠ切点的最短距离为2kbD解析

用EcoRⅠ处理和利用NotⅠ+EcoRⅠ双酶切时产生的结果不同,且酶切后的DNA分子质量之和均为10kb,再结合用NotⅠ处理只产生了一个10kb的条带,推测该分

子是环状的,且分子质量大小是10kb,A、B正确;该分子为环状结构,用NotⅠ处理只产

生了一个10kb的条带,说明该环状DNA上含有一个NotⅠ切割位点,单用EcoRⅠ处理后

产生了4kb和6kb两个条带,说明该环状DNA上含有2个EcoRⅠ切割位点,C正确;分析

可知,用EcoRⅠ处理后产生的4kb的片段,进一步被NotⅠ酶切为3kb和1kb的片段,可知NotⅠ切点与EcoRⅠ切点的最短距离为1kb,最大距离为3kb,D错误。变式

同考法不同考查角度引物判断、酶切结果综合

(2023山东,25,10分)科研人

员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所

示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。

(1)与图甲中启动子结合的酶是

。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有

(答出2个结构即可)。(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若

仅用一对引物,应选择图甲中的引物

。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的

(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白

是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了

,条带2所检出的蛋白

(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表

达的。RNA聚合酶标记基因、复制原点(或限制性酶切位点)

F2和R1(或“F1和R2”)a链J-V5融合蛋白不是解析

(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因的转录。质粒

作为载体,需要有复制原点、一个至多个限制酶切割位点和便于重组质粒筛选的标记

基因等。(2)用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时,常设计

一对引物,一个引物与目的基因序列互补,另一个引物与质粒序列互补,两引物延伸方向

相反,以扩增出两引物间的序列,若插入方向正确,则可扩增出相应序列,反之,则不能扩

增出相应序列,故选用的引物应为F2、R1或F1、R2,若选用引物F1、R1,不论目的基因

插入方向是否正确,都可扩增出目的基因序列。因为J基因的b链为转录的模板链,启动

子在左侧,所以转录方向为从左到右,由于转录沿模板链3'端到5'端方向合成RNA,因此J

基因b链左侧为3'端,引物要与DNA的3'端互补配对,所以F1与b链互补,a链也与b链互补,

由此推知引物F1与a链相应部分序列相同。(3)抗J蛋白抗体和抗V5抗体均能检测到条带1,说明条带1为J-V5融合蛋白,条带2仅能由抗J蛋白抗体检测到,说明该蛋白仅含J蛋

白,不含标签短肽V5,故条带2检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。第3节基因工程的基本操作程序和蛋白质工程提升一、基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取目的基因用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因,主要是指编码蛋白质的基因(也可能是基因调控序列等)较为有效的筛选方法从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选目的基因的获取方法PCR、人工合成法、法等苏教速览

(1)从基中筛选某目的基因,一般采用核酸探针杂交的方法,将某基因的已知片

段作为筛选的探针,在基中筛选含有目的基因的菌落,进行扩增、分离、回收

而获得目的基因。(2)cD的构建:构建cD主要包括从组织细胞中提取mRNA,逆转录成cDNA,与适当载体连接后转化宿主,这种包含细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cD。2.基因表达载体的构建(基因工程的核心步骤)构建目的(1)让目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代;(2)使目的基因能够表达和发挥作用基因表达载体的组成

启动子的分类组成型启动子在多数或全部组织中保持持续的驱动转录活性诱导型启动子受外界化学或物理信号调控驱动下游基因转录,如乳糖操纵子特异型启动子具有组织特异性(在特定的组织或器官中驱动下游基因转录)或者发育时

期特异性(在特定发育时期驱动下游基因转录),如水稻胚乳细胞启动子构建基因表达载体过程示意图

错

启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比

启动子终止子起始密码子终止密码子位置DNADNAmRNAmRNA作用RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因的转录使转录停止翻译的起始信号(编码氨基酸:甲硫氨酸)翻译的结束信号(一般不编码氨基酸)知识拓展

(1)标记基因的常见类型及相应筛选方法标记基因常见类型筛选方法标记基因为抗生素的抗性基因基因表达载体上携带的抗生素抗性基因进入受体细胞并表达后,可以使受体细胞表现出对相应抗生素的抗性,在受体细胞的培养体系中加入致死浓度的相应抗生素后,存活的便是转化成功的细胞标记基因为必需营养物质合成基因基因表达载体上携带某种必需营养物质的合成基因,而受体细胞本身不能合成这一营养组分。将细胞在不含有此营养组分的培养基中培养,存活的便是转化成功的细胞标记基因为报告基因[如绿色荧光蛋白(GFP)基因]基因表达载体上携带的GFP基因表达的绿色荧光蛋白,在一定条件下可发出绿色荧光。将携带该标记基因的重组质粒导入细胞后,若细胞可发出绿色荧光,则说明转化成功(2)对空质粒的筛选——蓝白斑筛选法:载体上携带有抗生素抗性基因及LacZ基因。

LacZ基因表达产物可分解X-gal产生蓝色物质,使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。该

载体上仅在LacZ基因中存在目的基因插入位点,若目的基因插入LacZ基因,则LacZ基因

失去相应功能。在大肠杆菌的培养基中加入相应抗生素和X-gal后,未导入质粒的菌株

不能生长,白色的菌落便是成功导入目的基因的大肠杆菌,呈现蓝色的菌落则是转入空

质粒的大肠杆菌。3.将目的基因导入受体细胞受体细胞的种类及方法植物细胞花粉管通道法我国科学家独创。可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。也可以在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊农杆菌转化法农杆菌细胞内含Ti质粒。当农杆菌侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞,并将其整合到该细胞的染色体DNA上。将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中(T-DNA不会因目的基因的插入而丧失转移功能),通过农杆菌的转化作用,就可以使目的基因进入植物细胞动物细胞显微注射法利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中微生物细胞Ca2+处理法先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中知识拓展

农杆菌转化法示意图

(1)两次重组①第一次重组:目的基因与Ti质粒构建重组载体。②第二次重组:重组Ti质粒上的T-DNA插入染色体DNA。(2)两次导入①第一次导入:将重组Ti质粒导入经Ca2+处理的农杆菌细胞。②第二次导入:将T-DNA导入植物细胞染色体DNA上。4.目的基因的检测与鉴定分子水平的检测检测目的基因是否导入受体细胞PCR操作方法:设计目的基因特异性引物,提取受体细胞内的基因组DNA进行PCR扩增,如果能够扩增出目的基因片段,说明该基因已经导入受体细胞DNA分子杂交操作方法:把目的基因片段用放射性同位素、生物素或荧光进行标记,与受体细胞的基因组DNA进行杂交,如果目的基因已经导入受体细胞,那么标记的基因片段就会与其结合,通过特殊的仪器就能够检测出来检测目的基因是否转录逆转录-PCR(RT-PCR)操作方法:提取受体细胞内的总RNA进行逆转录,得到cDNA,以获得的cDNA为模板,设计待测目的基因特异性引物进行PCR核酸分子杂交操作方法:从待测转基因生物细胞中提取mRNA分子,用已标记的目的基因片段作为探针与mR-NA杂交检测目的基因是否翻译抗原—抗体杂交操作方法:从受体细胞中提取蛋白质后,进行电泳分离,然后利用目的蛋白的抗体进行检测个体生物学水平的鉴定检测目标性状的有无等,如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定抗虫基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度二、基因工程的应用

三、蛋白质工程简介设计基础以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础目的改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质改造方法由于基因决定蛋白质,因此要对蛋白质的结构进行设计改造,最终还必须通过改造或合成基因来完成基本思路从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质应用速效胰岛素类似物的研发、延长干扰素的体外保存时间、枯草杆菌蛋白酶的改进等小表达蛋白质工程中为什么通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造?

。蛋白质一般具有十分复杂的空间结构,基因的结构相对简单,容;改造后的基因可以遗传给下一代,而直接改造的蛋白质无法遗传即练即清真题选改判1.(2021北京,14)转基因抗虫棉能杀死害虫就一定对人有毒。

(

)×解析

转基因抗虫棉能产生Bt抗虫蛋白杀死害虫,但对人畜无害。2.(2021辽宁,14)利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热

稳定的融合型腈水合酶(N1),加入连接肽需要通过改造基因实现。

(

)√从真题到教材3.基因表达载体的构建:基因表达载体由目的基因、复制原点、

、启动

子、

等组成。启动子位于基因的

,作用是

。诱导型启动子的作用是

(2024黑、吉、辽,25)(2023广东,20)(2023山东,25)。标记基因终止子(以上两空可调换)上游RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因的转录当诱导物存在时,可以激活或抑制目的基因的表达4.将目的基因导入受体细胞:植物常采用农杆菌转化法,需将目的基因插入Ti质粒的

中(2023海南,20)(2023广东,20)。动物常采用显微注射技术将目的基因导入

;将目的基因导入大肠杆菌时需先用

处理,使之处于一种能吸收

环境中DNA分子的生理状态。(2024江苏,23)。T-DNA受精卵Ca2+5.目的基因的检测与鉴定:分子水平的检测,常采用

等技术检测DNA和RNA,检测

是否表达出相应的蛋白质常采用

;最终还要进行

水平的鉴定(2022江苏,24)(2021江苏,23)。PCR抗原—抗体杂交技术个体生物学一、限制酶选择的原则1.同尾酶同尾酶是指识别DNA分子中不同核苷酸序列,但能切割产生相同末端的限制酶,如

图:

由同尾酶产生的黏性末端,能够通过碱基互补配对彼此连接,可用于基因表达载体

的构建。2.限制酶选择的原则(1)限制酶不能破坏目的基因的完整结构,也不能破坏载体上的启动子、终止子、复制

原点等必要元件。(2)限制酶识别位点应位于启动子和终止子之间,且能使目的基因按照正确的转录方向

插入。(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,尽量选用不同的限制酶切割目的基

因和质粒,即双酶切。

注:①W基因以乙链为转录模板链;②MfeⅠ和EcoRⅠ为同尾酶,可切出相同的黏性末端分析质粒①质粒中含2个EcoRⅠ识别位点,选用EcoRⅠ会切去终止子,选用BamHⅠ会破坏启动子,故可选用的限制酶有MfeⅠ、HindⅢ、KpnⅠ。②W基因以乙链为转录模板链,RNA聚合酶从模板链的3‘端开始转录,故W基因乙链的3’端与启动子相连,5‘端与终止子相连,为保证W基因与质粒正确连接,质粒的终止子一侧应选用与W基因右侧相同的HindⅢ,故切割质粒可选的限制酶为MfeⅠ、HindⅢ分析目的基因选用MfeⅠ会破坏W基因,故只能选择同尾酶EcoRⅠ,因此选用EcoRⅠ、HindⅢ切割含W基因的DNA(4)实例分析典例1

(2024全国甲,38节选)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回

答下列问题。(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点,限制酶的切割位点如图所示。构建重组质

粒时,与用酶a单酶切相比,用酶a和酶b双酶切的优点体现在

(答出2点即可);使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是

。

避免载体自连,保证目的基因连接方向正确T4DNA连接酶解析

(2)用酶a单酶切目的基因和质粒时,目的基因与质粒两端形成的黏性末端相同,

在连接时容载体自连及目的基因反向连接到质粒上的情况。用酶a和酶b双酶

切目的基因和质粒时,目的基因及质粒两端形成的黏性末端不同,避免载体自连,保证目

的基因连接方向正确。T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末

端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端,E.coliDNA连接酶连接具有平末端的DNA

片段的效率要远远低于T4DNA连接酶,故使用酶c单酶切构建重组质粒时应该用T4DNA连接酶。二、基因工程的操作程序分析典例2

(2025届常州前黄高级中学学情检测,24)如图是将乙肝病毒表面主蛋白基因

HBsAg导入巴斯德毕赤酵母生产乙肝疫苗的过程图。巴斯德毕赤酵母是一种甲基营

养型酵母,能将甲醇作为其唯一碳源。该酵母菌体内无天然质粒,科学家改造出了图中

所示的pPIC9K质粒用作载体,其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染

色体发生同源重组,将目的基因整合于染色体中以实现表达。已知当甲醇作为唯一碳

源时,该酵母菌中AOX1基因受到诱导而表达,5'AOX1和3'AOX1(TT)分别是基因AOX1

的启动子和终止子。请分析回答:

(1)与大肠杆菌等原核生物相比,用巴斯德毕赤酵母作为基因工程的受体细胞,其优点是

。蛋白质合成后,酵母细胞可以在内质网和高尔基体中对其进行加工和修饰并分泌到细胞外,便于提取(2)要获取HBsAg基因,可采取PCR技术进行大量扩增,其前提是

。将HBsAg基因导入酵母菌前需完成基因表达载体的构建获取重组质粒,一是因为HBsAg基因片段小,在细胞中容;二是因为缺少

,HBsAg基因在细胞中不能复制。(3)为实现HBsAg基因和pPIC9K质粒重组,应该选择

切割质粒,并

在HBsAg基因两侧的A和B位置接上

,确保定向连接。(4)酶切获取HBsAg基因后,需用

酶将其连接到pPIC9K质粒上,形成重组质

粒,并将其导入大肠杆菌以获取

。(5)步骤3中应选用

酶来切割重组质粒以获得重组DNA,然后再将其导

入巴斯德毕赤酵母细胞。有一段已知的HBsAg基因的核苷酸序列来合成引物复制原点限制酶SnaBⅠ和rⅡSnaBⅠ、rⅡ限制酶识别序列DNA连接大量重组质粒限制酶BglⅡ

(6)为了确认巴斯德毕赤酵母转化是否成功,在培养基中应该加入

以便筛

选。若要检测转化后的细胞中是否含有HBsAg基因转录产物,可以用

方法进行检测。转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后,需要向其中加入

以维持其生活,同时诱导HBsAg基因表达。卡那霉素PCR/RT-PCR分子杂交/甲醇解析

(1)巴斯德毕赤酵母为真核细胞,与原核细胞生物相比,真核细胞中蛋白质合成后

可以在内质网和高尔基体中对其进行加工、修饰并分泌到细胞外,便于提取。(2)采取

PCR技术扩增目的基因,需要有一段已知的HBsAg基因的核苷酸序列来合成引物。HB-

sAg基因缺少复制原点,使其不能在细胞中复制,因此需要构建基因表达载体。(3)图中

质粒含有SnaBⅠ、rⅡ、BglⅡ和SacⅠ的切割位点,再结合“5'AOX1和3'AOX1(TT)

……终止子”分析,SacⅠ的识别位点位于启动子上,BglⅡ的识别位点有两处且均不位

于启动子和终止子之间,故不能选用SacⅠ和BglⅡ。为了避免质粒和目的基因自身环

化并确保二者定向连接,应选用不同的限制酶切割质粒和目的基因,故用限制酶SnaBⅠ

和rⅡ切割质粒,并在HBsAg基因两侧的A和B位置接上SnaBⅠ、rⅡ限制酶识别序

列,以实现HBsAg基因和pPIC9K质粒重组。(4)DNA连接酶可将目的基因和载体连接形成重组质粒。将重组质粒导入大肠杆菌后,随着转化成功的大肠杆菌的增殖,可获取大

量重组质粒。(5)步骤3是要获取含有5'AOX1和3'AOX1的一段基因,再结合BglⅡ在启

动子和终止子的位置分析,可用限制酶BglⅡ来切割重组质粒获得重组DNA。(6)含有5'

AOX1和3'AOX1的一段基因内含有卡那霉素抗性基因,因此可在培养基中加入卡那霉

素以便筛选转化成功的酵母菌。若要检测转化后的酵母菌细胞中是否含有HBsAg基

因转录产物,可以用分子杂交方法(或PCR或RT-PCR)进行检测。巴斯德毕赤酵母是一

种甲基营养型酵母菌,能将甲醇作为其唯一碳源,同时甲醇能诱导AOX1基因表达,推测

甲醇诱导5'AOX1(启动子)驱动下游基因的转录,因此转化的酵母菌在培养基上培养一

段时间后,需要向其中加入甲醇以维持其生活,同时诱导HBsAg基因表达。知识归纳

转基因“受体细胞”的筛选(1)用含抗生素的培养基筛选①载体只有一种标记基因,如四环素抗性基因,需将完成转化后的受体细胞接种在含四

环素的培养基中培养,能生长的细胞为导入质粒(包括重组质粒和空质粒)的受体细胞。②载体有两种标记基因,如四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。将转化后的受体细胞先接种在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是含重组质粒

的细胞和含空质粒的细胞,如图中1、2、3、4、5处,在1~5处位置上分别挑取细菌,置于含四环素的培养基上相应位置,标记出形成的菌落的位置,能在含氨苄青霉素的培养基上生长,且不能在含四环素的培养基上生长的为含重组质粒的受体细胞,如图中1、5处细菌是含重组质粒的受体细胞。(2)利用其他技术筛选目的基因:如提取受体细胞中的质粒进行酶切并电泳,根据电泳条带进行判断,或提取受体细胞中的质粒,依据目的基因序列设计引物进行PCR并电泳,若出现条带,则说明已成功导入目的基因。变式

同考法不同情境

(2024黑、吉、辽,25,12分)将天然Ti质粒改造成含有Vir基