精讲册第24章　基因工程

第5部分生物技术与工程第24章基因工程高考生物学新高考适用目录

考情清单第1节重组DNA技术的基本工具和DNA的粗提取

考点清单

即练即清

第2节PCR与电泳

考点清单

即练即清

考法清单第3节基因工程和蛋白质工程

考点清单

即练即清

考法清单提升提升

考题重组DNA技术的基本工具和DNA的粗提取(2024山东,13)(2024湖南,5)(2023广东,11)(2023重庆,12)[2022福建,24(一)]PCR与电泳(2024河北,13)(2024黑、吉、辽,7)(2024贵州,21)(2024山东,5)(2023河北,22)(2023福建,4)(2023山东,25)(2022辽宁,12)基因工程和蛋白质工程(2024新课标,35)(2024安徽,20)(2024黑、吉、辽,25)(2024全国甲,38)(2024湖南,21)(2023辽宁,8)(2023辽宁,25)(2022湖北,24)(2020北京,17)考情分析(1)考查内容与题型:主要集中在基因工程基本操作程序中目的基因的获取(PCR)及基因表达载体的构建等内容上;选择题与非选择题都有出现,但以非选择题的考查形式为主。(2)命题特点与难度:试题常以新品种的培育、药品等物质生产的基因工程应用情境为

信息载体,旨在考查考生归纳与概括、分析与推理等科学思维,实验分析和实验设计等

科学探究能力及由药品等的生产所激发的社会责任;试题一般难度偏大。(3)新风向:PCR过程中引物的选择,如(2024黑、吉、辽,25)(2023山东,25);琼脂糖凝胶电

泳,如(2024黑、吉、辽,7)(2023河北,22);考查基因工程的新技术,如(2024新课标,35)利

用了CRISPR/Cas9基因组编辑技术。第1节重组DNA技术的基本

工具和DNA的粗提取一、重组DNA技术的基本工具“分子手术刀”——限制性内切核酸酶(限制酶)来源主要是原核生物作用具体作用识别并切割双链DNA分子的特定核苷酸序列作用化学键磷酸二酯键作用结果限制酶切割DNA分子产生的末端通常有两种形式(如图所示):

“分子缝合针”——DNA连接酶作用将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键分类E.coliDNA连接酶来自大肠杆菌,可高效连接具有互补黏性末端的DNA片段,连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于T4DNA连接酶T4DNA连接酶来自T4噬菌体,能连接互补的黏性末端和平末端“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体作用将外源DNA片段(目的基因)导入受体细胞种类质粒(最常用)定义裸露的(不与组蛋白结合)、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外,并具有自我复制能力的环状双链DNA分子结构特点具有复制原点(在细胞中能够自我复制)、标记基因(便于重组DNA分子的筛选)、一个至多个限制酶切割位点(供目的基因插入)其他载体噬菌体、动植物病毒等教材深挖

同尾酶【链接高考】(2024贵州,13)使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。

(

)【溯源教材】选必3P74—75“练习与应用”同尾酶是指识别DNA分子中不同核苷酸序列,但能切割产生相同末端的限制酶,如图:由同尾酶切割DNA分子产生的黏性末端,能通过碱基互补配对彼此连接,可用于基因表

达载体的构建。同尾酶使构建载体时,切割位点的选择范围扩大。【答案】√错与DNA相关的酶的比较酶种类作用部位底物产物作用过程限制酶磷酸二酯键DNADNA片段基因表达载体的构建DNA连接酶DNA片段DNARNA聚合酶核糖核苷酸RNARNA合成逆转录酶脱氧核苷酸DNA逆转录DNA酶DNA脱氧核苷酸DNA水解DNA聚合酶脱氧核苷酸DNADNA复制解旋酶氢键双链DNADNA的两条单链DNA复制注:RNA聚合酶也能作用于DNA双链的氢键使其解旋。二、DNA的粗提取实验原理(1)DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理,可以初步分离DNA与蛋白质;(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2mol/L的NaCl溶液;(3)DNA+二苯胺试剂

蓝色实验步骤

注意事项(1)过滤时应选用纱布而不是滤纸,如果用滤纸,可能会把DNA分子吸附在滤纸上。(2)低能防止DNA酶降解DNA。(3)粗提取的DNA中可能含有核蛋白、多糖等杂质知识拓展本实验的研磨液中含SDS(可使蛋白质变性与DNA分离)、EDTA(为DNA酶抑制剂,可

防止细胞破碎后DNA酶降解DNA)、Tris(提供缓冲体系,使DNA呈稳定状态)。实验中

若遇到实验试剂缺乏的情况,可以用家用洗洁精(含SDS)或质量分数为10%的洗衣粉水

溶液(含有蛋白酶和表面活性剂,可用解洗衣粉)替代研磨液,也能达到裂解细胞

膜、让蛋白质变性的目的。真题选改判1.(2024山东,13)“DNA的粗提取与鉴定”实验,鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改

变。(

)解析

鉴定过程需要沸水浴加热,DNA分子在高解螺旋,双螺旋结构会发生

改变。2.(2024安徽,14)“DNA粗提取与鉴定”实验中,如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取

的效率会降低。

(

)即练即清✕√3.(2023福建,4)“DNA的粗提取与鉴定”实验中,将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中

并进行沸水浴,用于鉴定DNA。

(

)解析

鉴定DNA时,需要把白色丝状物溶解在2mol·L-1的NaCl溶液中,再加入二苯

胺试剂进行沸水浴。4.(2022山东,13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验中,过滤液沉淀过程在4℃冰箱中

进行是为了防止DNA降解。

(

)5.(2022山东,13)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中,离心研磨液是为了加速DNA的沉

淀。(

)解析

离心研磨液是为了使细胞碎片等沉淀,得到含DNA的上清液。✕√✕从真题到教材6.在基因工程操作中,DNA连接酶主要有两类,一类是从大肠杆菌中分离得到的,称为

DNA连接酶;另一类是从T4噬菌体中分离出来的,称为

DNA连接酶,这

两类酶都能将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的

键,但

DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于

DNA连接酶。(选必3P72)(2023新课标,6)(2023重庆,12)E.coliT4磷酸二酯E.coliT47.DNA粗提取实验中涉及的主要试剂及作用:主要试剂作用体积分数为95%的冷酒精溶液溶解蛋白质,提取DNA2mol/L的NaCl溶液

二苯胺试剂鉴定DNA(选必3P74—75)(2024黑、吉、辽,25)(2024安徽,14)(2024山东,13)(2023福建,4)(2022山东,13)溶解DNA8.DNA的鉴定:在

条件下,DNA遇二苯胺试剂呈现

色(选必3P74—75)

(2024安徽,14)(2024山东,13)(2023广东,11)(2023福建,4)(2022山东,13)。沸水浴蓝第2节PCR与电泳提升一、PCR技术原理DNA半保留复制和DNA的热变性PCR的条件模板一般为含目的基因的双链DNA片段(或含目的基因的基因组DNA)原料四种游离的脱氧核苷酸或脱氧核苷三磷酸(dNTP)引物一般为根据目的基因两端序列设计的能与之互补配对的短单链核酸片段(一般需要选择2种引物分别扩增两条模板链)酶耐高DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)缓冲液需含有Mg2+,以激活DNA聚合酶PCR的步骤和结果

二、琼脂糖凝胶电泳电泳的定义DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极某著名企业检测原理在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来电泳结果及初步分析电泳结果示意图(常规结果)

电泳结果及初步分析结果初步分析根据条带位置判断DNA分子大小(1)以泳道1为参考系可推知其他泳道DNA片段的大小范围,如泳道4中的DNA片段在3000bp~5000bp。(2)当DNA构象相同、电泳条件基本一致时,相对分子质量大的DNA分子迁移速率较小,距点样孔较近;相对分子质量小的DNA分子迁移速率较大,距点样孔较远;故泳道3的片段①的相对分子质量>片段②的相对分子质量根据电泳条带判断限制酶酶切位点数量泳道2和泳道3为同一个质粒经不同限制酶处理得到的结果。泳道2只有1条条带,说明质粒含0个或1个相应限制酶切割位点。泳道3含2条条带,说明质粒含2个相应限制酶切割位点。假设泳道2中DNA分子为4800bp,则泳道3中DNA分子的大小分别为3000bp(片段①)和1800bp(片段②)真题选改判1.(2024河北,13)利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后,在紫外灯下观察结

果。

(

)2.(2024湖南,15)电泳时PCR产物的片段越小,迁移速率越慢。

(

)解析

电泳时,PCR产物的片段越大,迁移速率一般越慢。3.(2024黑、吉、辽,7)采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验中,琼脂糖凝胶浓度的

选择需考虑待分离DNA片段的大小。

(

)即练即清√✕√4.(2024广东,4)RNA聚合酶的发现促进了PCR技术的发明。 (

)解析

耐高DNA聚合酶的发现促进了PCR技术的成熟。5.(2022辽宁,12)采用PCR方法进行目的基因扩增,延伸过程无需引物参与即可完成半保

留复制。 (

)解析

由于耐高DNA聚合酶只能催化单个的脱氧核苷酸添加到已有的核酸

片段(如引物)的3'端,不能从头合成DNA,故延伸过程中需要引物参与。✕✕从真题到教材6.利用PCR获取目的基因:需要

作为原料,通过

方式打开

DNA双链,利用

催化合成DNA子链,同时要加入一对引物,引物的作用是

(选必3P77—78、P84)(2024河北,13)(2022辽宁,12)。4种脱氧核苷酸加热

耐高DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)

使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸考法PCR引物的特点与选择引物的特点(1)是一段短单链核酸,且能与DNA母链的一段碱基序列互补配对;(2)一般3'端需与DNA模板链严格互补配对,不可被修饰;引物的5'端可以被修饰,5'端常见的修饰有加酶切位点、加荧光标记、引入突变位点等;(3)PCR过程中,引物一般成对存在且成对的引物不能碱基互补配对判断引物的方向(1)判断引物的3'端、5'端:引物与DNA模板链的3'端互补,方向相反;(2)DNA复制:子链沿引物从5'→3'延伸;(3)由此可知,甲、乙、丙、丁四个引物的扩增方向

如图1所示。图1根据扩增目的选择引物

图2(1)若扩增目的基因序列,则应选择图1中的引物乙、丙;(2)若要检验目的基因是否以正确方向插入质粒相应位点,应设计一个引物与目的基因外部序列(即质粒序列)碱基互补配对,另一个引物与目的基因序列碱基互补配对,如图2所示的引物1、2。典例

(2023山东,25节选)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了

检测,该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。

(1)与图甲中启动子结合的酶是

。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有

(答出2个结构即可)。(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若

仅用一对引物,应选择图甲中的引物

。RNA聚合酶标记基因、复制原点(或限制性酶切位点)F2和R1(或“F1和R2”)解析

(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因的转录。质粒

作为载体,需要有复制原点、一个至多个限制酶切割位点和便于重组质粒筛选的标记

基因等。(2)用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时,常设计

一对引物,一个引物与目的基因序列互补(如F1或R1),另一个引物与质粒序列互补(如F2

和R2),两引物延伸方向相反,以扩增出两引物间的序列,若插入方向正确,则可扩增出相

应序列,反之,则不能扩增出相应序列,故选用的引物应为F2、R1或F1、R2,若选用引物

F1、R1,不论目的基因插入方向是否正确,都可扩增出目的基因序列,无法达到检测目

的。变式

同考法不同考查角度引物的延伸方向未知、引物的修饰(2025届河北沧州阶段考,22节选)苹果生长过程中菌感染,科研人员将在其他植

物中发现的BG2基因转入苹果中,该基因控制合成的β-1,3-葡聚糖酶可降解原真

菌的细胞壁,从而抑制真菌的生长与繁殖。请回答下列问题:(1)利用PCR技术克隆BG2基因时,应选择图1中的引物

(填序号),引物的作用是

。2和3使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸(2)如图2为构建含BG2基因重组质粒的过程。研究人员用XbaⅠ和NotⅠ切割质粒,用

NotⅠ和SpeⅠ切割目的基因后,二者可连接在一起构成重组质粒,原因是

。若BG2基因两端没有NotⅠ识别序列,PCR时可在引物

(填序号)的

(填“3'”或“5'”)端加上NotⅠ识别序列。图2中增强子是一段

能使基因转录频率明显增加的DNA序列,其参与构成的复合启动子的作用是:①

,②增强转录活性。

酶切后产生的黏性末端相同25'

驱动基因的转录(或RNA聚合酶识别和结合位点)解析

(1)引物与和它互补配对的DNA单链反向平行,故引物的5'端和3'端如图所示:

子链沿引物从5'→3'延伸,故图中引物1和2的延伸方向为“←”,引物3和4的延伸方向

为“→”,故扩增BG2基因应选择引物2和引物3。(2)XbaⅠ酶切后的末端与SpeⅠ酶切

后的末端能连接,即黏性末端能发生碱基互补配对,是因为XbaⅠ与SpeⅠ酶切后产生的

黏性末端相同。启动子位于基因上游,可驱动基因的转录,转录方向为启动子→终止子,

根据目的基因的转录方向及题图2中NotⅠ的位置可知,在引物2添加NotⅠ识别序列,且需添加在5’端。第3节基因工程和蛋白质工程提升一、基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取目的基因用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因,主要是指编码蛋白质的基因(也可能是基因调控序列等)较为有效的筛选方法从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选目的基因的获取方法PCR、人工合成法、法等2.基因表达载体的构建(基因工程的核心步骤)构建目的(1)让目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代;(2)使目的基因能够表达和发挥作用基因表达载体的组成

启动子的分类组成型启动子在多数或全部组织中保持持续的驱动转录活性诱导型启动子受外界化学或物理信号调控驱动下游基因转录,如乳糖操纵子特异型启动子具有组织特异性(在特定的组织或器官中驱动下游基因转录)或者发育时期特异性(在特定发育时期驱动下游基因转录),如水稻胚乳细胞启动子构建基因表达载体过程示意图

错启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比

启动子终止子起始密码子终止密码子位置DNADNAmRNAmRNA作用RNA聚合酶识别和

结合的部位,驱动基

因的转录使转录停止翻译的起始信号

(编码氨基酸:甲硫

氨酸)翻译的结束信号

(一般不编码氨基

酸)知识拓展标记基因的常见类型及相应筛选方法标记基因常见类型筛选方法标记基因为抗生素的抗性基因基因表达载体上携带的抗生素抗性基因进入受体细胞并表达后,可以使受体细胞表现出对相应抗生素的抗性,在受体细胞的培养体系中加入致死浓度的相应抗生素后,存活的便是转化成功的细胞标记基因为必需营养物质合成基因基因表达载体上携带某种必需营养物质的合成基因,而受体细胞本身不能合成这一营养组分。将细胞在不含有此营养组分的培养基中培养,存活的便是转化成功的细胞标记基因为报告基因[如绿色荧光蛋白(GFP)基因]基因表达载体上携带的GFP基因表达的绿色荧光蛋白,在一定条件下可发出绿色荧光。将携带该标记基因的重组质粒导入细胞后,若细胞可发出绿色荧光,则说明转化成功3.将目的基因导入受体细胞受体细胞的种类及方法植物细胞花粉管通道法我国科学家独创。可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。也可以在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊农杆菌转化法农杆菌细胞内含Ti质粒。当农杆菌侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞,并将其整合到该细胞的染色体DNA上。将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中(T-DNA不会因目的基因的插入而丧失转移功能),通过农杆菌的转化作用,就可以使目的基因进入植物细胞动物细胞显微注射法利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中微生物细胞Ca2+处理法先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中4.目的基因的检测与鉴定分子水平的检测检测目的基因是否导入受体细胞PCR操作方法:设计目的基因特异性引物,提取受体细胞内的基因组DNA进行PCR扩增,如果能够扩增出目的基因片段,说明该基因已经导入受体细胞DNA分子杂交操作方法:把目的基因片段用放射性同位素、生物素或荧光进行标记,与受体细胞的基因组DNA进行杂交,如果目的基因已经导入受体细胞,那么标记的基因片段就会与其结合,通过特殊的仪器就能够检测出来检测目的基因是否转录逆转录-PCR(RT-PCR)操作方法:提取受体细胞内的总RNA进行逆转录,得到cDNA,以获得的cDNA为模板,设计目的基因特异性引物进行PCR核酸分子杂交操作方法:从待测转基因生物细胞中提取mRNA分子,用已标记的目的基因片段作为探针与mR-NA杂交检测目的基因是否翻译抗原—抗体杂交操作方法:从受体细胞中提取蛋白质后,进行电泳分离,然后利用目的蛋白的抗体进行检测个体生物学水平的鉴定检测目标性状的有无等,如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定抗虫基

因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度教材深挖

农杆菌转化法【链接高考】1.[2024河北,22(2)]利用

方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。

为检测r2HN表达情况,可通过PCR技术检测

,通过

技术检测是否翻译出r2HN蛋白。2.[2023海南,20(3)]农杆菌侵染植物细胞时,可将外源基因递送到植物细胞中的原因是

。3.[2022河北,24(3)]利用农杆菌转化法时,必须将目的基因插入质粒的

上。(1)两次重组①第一次重组:目的基因与Ti质粒构建重组载体。②第二次重组:重组Ti质粒上的T-DNA插入染色体DNA。(2)两次导入①第一次导入:将重组Ti质粒导入经Ca2+处理的农杆菌细胞。②第二次导入:将T-DNA导入植物细胞染色体DNA上。【溯源教材】选必3P81“资料卡”【答案】1.农杆菌转化

r2HNmRNA抗原—抗体杂交2.农杆菌细胞内含Ti质

粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上

3.T-DNA二、基因工程的应用三、蛋白质工程简介设计基础以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础目的改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质改造方法由于基因决定蛋白质,因此要对蛋白质的结构进行设计改造,最终还必须通过改造或合成基因来完成基本思路从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质应用速效胰岛素类似物的研发、延长干扰素的体外保存时间、枯草杆菌蛋白酶的改进等小表达蛋白质工程中为什么通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造?

。蛋白质一般具有十分复杂的空间结构,基因的结构相对简单,容;改造后的基因可以遗传给下一代,而直接改造的蛋白质无法遗传即练即清从真题到教材1.基因表达载体的构建:基因表达载体由目的基因、复制原点、

、启动

子、

等组成。启动子位于基因的

,作用是

。诱导型启动子的作用是

。(选必3P80)(2024黑、吉、辽,25)(2023河北,22)(2023广东,20)(2023山东,25)标记基因终止子上游

RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因的转录

当诱导物存在时,可以激活或抑制目的基因的表达

2.将目的基因导入受体细胞:植物常采用农杆菌转化法,需将目的基因插入Ti质粒的

中(选必3P81)(2023广东,20)(2022河北,24)。动物常采用显微注射技术将目的基

因导入

;将目的基因导入大肠杆菌时需先用

处理,使之处于一种能吸

收境中DNA分子的生理状态(选必3P82)(2021辽宁,24)。3.目的基因的检测与鉴定:分子水平的检测,常采用

等技术检测DNA和RNA,检测

是否表达出相应的蛋白质常采用

;最终还要进行

水平的鉴定(选必3P82)(2023全国甲,38)(2022河北,24)。T-DNA受精卵Ca2+PCR抗原—抗体杂交技术个体生物学考法1限制酶的选择1.限制酶不能破坏目的基因的完整结构,也不能破坏载体上的启动子、终止子、复制

原点等必要元件。结合两图可知:最宜选用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切。注:若用Ti质粒,目的基因必须插入T-DNA序列。2.应使目的基因按照正确的转录方向插入载体的启动子和终止子之间。3.为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,尽量选用不同的限制酶切割目的基

因和质粒,即双酶切。典例1

(2022湖北,24节选)如图1、2是载体的限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶)

酶谱和S基因的cDNA。为了成功构建重组表达载体,确保目的基因插入载体中方向正

确,最好选用

酶切割S基因的cDNA和载体。XbaⅠ和HindⅢ解析为确保目的基因和载体正向连接,最好用两种限制酶切割,因此不宜选用EcoR

Ⅰ;观察S基因,不能选用BamHⅠ,会切断S基因;观察载体,不能选用SalⅠ(不在启动子和

终止子之间)。综合分析,选用的两种限制酶为XbaⅠ和HindⅢ。变式1

同考法不同考查角度根据转录模板链判断基因的上下游,进而选择限制酶(2020北京,17节选)C1酶基因以B链为转录模板链,转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接,克隆C1酶基因时在其两

端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位点。该基因没有这两种酶切位点。图中酶切

位点1和2所对应的酶分别是

。

BamHⅠ、SmaⅠ解析由“C1酶基因以B链为转录模板链,转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'”可

知,转录时从B链的3'端开始,结合质粒上启动子的位置分析,B链3'端应该用BamHⅠ进

行切割,而其5'端应该用SmaⅠ进行切割。考法2转基因“受体细胞”的筛选1.用含抗生素的培养基筛选(1)载体只有一种标记基因:利用该标记基因控制的性状进行筛选。如质粒有四环素抗

性基因,则需将完成转化后的受体细胞接种在含四环素的培养基中培养,能生长的细胞

即为导入(重组)质粒的受体细胞。(2)载体有两种标记基因:可利用两种标记基因相对应进行“反向”选择,如图:①质粒特点:质粒有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因,且目的基因插入了一种抗

性基因(四环素抗性基因)。②转化后的受体细胞:不含质粒的细胞、含重组质粒(插入了目的基因)的细胞、含质粒载体(未插入目的基因,即空质粒)的细胞。③筛选方法:将转化后的受体细胞先接种在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是

含重组质粒的细胞和含空质粒的细胞,如图中1、2、3、4、5,可再利用灭菌的绒布影

印到含有四环素的培养基上,能在含氨苄青霉素的培养基上生长,但不能在含四环素培

养基上生长的即含重组质粒的受体细胞,如图中1、5即含重组质粒的受体细胞。知识拓展对空质粒的筛选——蓝白斑筛选法:载体上携带有抗生素抗性基因及lacZ基因。lacZ

基因表达产物可分解X-gal产生蓝色物质,使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。该载体上

仅在lacZ基因中存在目的基因插入位点,若目的基因插入lacZ基因,则lacZ基因失去相

应功能。在大肠杆菌的培养基中加入相应抗生素和X-gal后,未导入质粒的菌株不能生

长,白色的菌落便是成功导入目的基因的大肠杆菌,呈现蓝色的菌落则是转入空质粒的

大肠杆菌。2.利用其他技术筛选目的基因:如提取受体细胞中的质粒进行PCR并电泳,根据电泳条

带进行判断或提取受体细胞中的质粒进行酶切并电泳,根据电泳条带进行判断。典例2

(2024安徽,20,11分)丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改

造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X,以提高丁二醇的产量。回答下列问题。(1)扩增X基因时,PCR的反应中需要使用TaqDNA聚合酶,原因是

。(2)使用BamHⅠ和SalⅠ限制酶处理质粒和X基因,连接后转化大肠杆菌,并涂布在无抗

生素平板上(如图)。在此基础上,进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是

。

TaqDNA聚合酶能耐高化合成DNA子链

将无抗生素平板上生长的每个菌落分别依次接种到含四环素的平板和含氯霉素的平板上,在含四环素的平板上不能生长而在含氯霉素的平板上能生长的菌落,即含目的基因的菌株形成的菌落

(3)研究表明,碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。

如果培养基中碳源相对过多,容氧化不彻底,形成较多的

,引乳酸等有机酸起发酵液pH下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分

别为100g·L-1和15g·L-1。在此基础上,设置不同浓度的木薯淀粉(90g·L-1、100g·L-1、11

0g·L-1)和酵母粉(12g·L-1、15g·L-1、18g·L-1)筛选碳源和氮源浓度的最佳组合,以获得

较高发酵产量,理论上应设置

(填数字)组实验(重复组不计算在内)。(4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时,升高,其原因是

。(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后,再经

,最终获得发酵产品。9分离、提纯产物

高密度发酵时大量大肠杆菌进行细胞呼吸,释放的能量大部分以热能形式散失,从而使发酵罐内高解析

(1)在PCR中,需要利用高DNA双链解旋,普通的DNA聚合酶在高变

性失活,而TaqDNA聚合酶能够耐高温(在高然具有活性),并催化合成DNA子

链。(2)据题图可知,使用BamHⅠ和SalⅠ限制酶处理质粒和X基因,质粒中的四环素抗

性基因被破坏,氯霉素抗性基因保留,因此能在含氯霉素的培养基上生存且不能在含四

环素的培养基上生存的大肠杆菌即含目的基因菌株,实验具体思路见答案。(3)碳源是

微生物生长所需的主要能量来源,培养基中碳源氧化不彻底说明大肠杆菌进行无氧呼

吸产生乳酸