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文档简介

课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段第1页自学提要：知识回顾：1.DNA分子结构（外侧、内侧、基本单位）；2.DNA复制过程和特点；3.PCR技术概念及应用。基本概念：变性、复性、TaqDNA聚合酶、引物了解PCR技术原理掌握PCR技术全过程比较PCR技术和体内DNA复制异同点。第2页1、DNA分子3’

端与5’

端-OH端为3’;磷酸基团末端为5’

。2、DNA分子由两条反向平行脱氧核苷酸链依据碱基互补配对标准形成氢键连接而成。第3页解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打开DNA双链模板合成子链原料催化子链合成使DNA聚合酶能从引物3’端开始连接脱氧核苷酸

思索：3、体内DNA复制条件是什么？体外扩增DNA怎样提供相同环境？变性（80-100℃

）Taq聚合酶（耐高温）15—30个核苷酸组成DNA或RNA第4页DNA双链单链变性（加热80-100℃

）复性（迟缓冷却）4、DNA分子热变性原理：变性目标：复性目标：解开双链有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链结合第5页一、PCR技术原理利用DNA分子热变性原理，经过控制温度来控制双链解聚与结合，从而完成体外DAN分子扩增。体外DNA复制条件：

四种脱氧核苷酸、耐高温聚合酶、引物、模板；缓冲溶液和严格控制温度温控设备。复制方向：子链5’端向3’端延伸。第6页二、PCR反应过程每个循环包含：变性——复性——延伸

从第二轮循环开始，上一次循环产物也能够作为模板参加反应，而且由引物Ⅰ延伸而成DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA延伸，这么，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间DNA序列，使这段固定长度序列呈指数扩增。第7页三、试验步骤：准备好PCR反应体系配方用微量移液器按配方在往微量离心管中加入各组分盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液离心10分钟将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序进行反应第8页注意事项：详见操作提醒

四、结果分析与评价DNA含量测定：稀释→对照调零→测定→计算（公式见P63）波长260nm处读数蒸馏水做对照50倍第9页PCR技术与体内DNA复制区分：

1.PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；

2.PCR需要耐热DNA聚合酶（惯用TaqDNA聚合酶），而生物体内聚合酶在高温时会变性；

3.PCR普通要经历三十屡次循环，而生物体内DNA复制需要生物体本身复制。第10页练习巩固1、关于PCR技术应用，错误一项是A古生物学、刑侦破案、DNA序列测定B诊疗遗传疾病、基因克隆、古生物学CDNA序列测定、基因克隆、刑侦破案‘D诊疗遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定第11页2、DNA合成方向总是从子链哪一端向哪一端延伸？3、PCR技术最突出优点是A原理简单B原料易找CTaqDNA聚合酶有耐热性D快速、高效、灵活、易于操作第12页4、做PCR使用微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行关键步骤是A重复洗涤

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