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文档简介

1、组员:陈忠浩 、赵静杰、郭献贵、于芳萍 发言人:郭献贵,血清球蛋白的分离纯化与鉴定,2,Contents,材料与方法,结果与讨论,总结与感想,3,一、材料与方法,(一)试验材料,1、供试材料,采用猪血为实验材料,采自宁波方兴食品有限公司屠宰场。收集健康肉猪颈动脉血液,室温下放置1-2h,析出血清,于4、8000r/min离心10min,除去血球和纤维蛋白原后,取上层血清,-20冰箱内保存备用。,4,2、主要试剂,5,6,3、仪器设备,7,(二)试验方法,8,1、猪血清IgG的提取正辛酸法,准确量取猪血清40mL于500mL烧杯中,加入60mmol/L pH4.0醋酸缓冲液160mL,用氢氧化钠

2、溶液调pH4.5。 以每毫升稀释液加入25L正辛酸的比例,在磁力搅拌条件下缓慢加入正辛酸,室温搅拌30min,4,5000 r/min离心30min,弃去沉淀。 上清液4预冷,以1mL上清液加0.227g硫酸铵的比例,缓慢加入硫酸铵粉末,边加边搅拌,室温下继续搅拌30min,5000r/min离心15min。 将沉淀溶于20mL生理盐水中,透析过夜,离心去沉淀,上清液即为粗提IgG。,9,2、猪血清IgG的纯化,将上述IgG粗品溶于少量生理盐水后装入透析袋,悬于装有0.01mol/L,pH7.4的PBS的大烧杯中,于磁力搅拌器上4透析24h,每6h换一次液。,(1)透析脱盐,10,取2g预处理

3、的DEAE-52纤维素、装成1.530cm,柱床高25cm层析柱。 缓冲液A(25mmol/L Tris-HCl,pH8.8,35mmol/L NaCl)平衡。 取2mL上述透析去盐母液进层析柱,上样后先用缓冲液A平衡,至流出液在280nm波长洗脱曲线变得平直止。 以等量缓冲液A和缓冲液C(25mmol/L Tris-HCl,pH8.8, 500mmol/L NaCl)连续梯度洗脱;控制流速1mL/min。 上样15min后分步收集并记录波峰,2mL/管,合并同一波峰收集管。再用PBS溶液透析,并进行分析鉴定。,(2)DEAE-52纤维素离子交换层析纯化IgG,11,3、提取液蛋白含量测定Fo

4、lin-酚法,配制标准牛血清白蛋白进行Folin-酚法实验,用分光光度计测定梯度浓度标准蛋白的OD280。 以蛋白质的浓度为横坐标,OD280值为纵坐标,绘制标准曲线。 各粗IgG样品液定容至100mL,按Folin-酚法操作,通过标准曲线计算样品的蛋白质浓度。,12,4、猪血清IgG分子量测定SDS-PAGE,配制SDS-PAGE凝胶。 将透析过的IgG样品液和标准蛋白液与上样缓冲液混合后在沸水浴中加热5min,各取20L加入凝胶板的样品槽中,进行电泳。 取出凝胶平板,将凝胶浸泡在染色液中,20min后用脱色液脱色。 脱色后的凝胶在凝胶成像仪上拍照,分析,根据标样做出标准曲线计算样品IgG分

5、子量。,13,电泳设备,14,二、结果与讨论,(一)正辛酸提取猪血清IgG试验结果,血清提取出的球蛋白粗品为浅黄色胶状物质。,(二)猪血清IgG纯化结果,透析后的蛋白质颜色明显变浅,呈透明状。,1、IgG的透析结果,15,保留时间0-1.6h为缓冲液A洗脱第一峰; 1.6h开启缓冲液A-C线性梯度洗脱,获得第二峰; 图示两色谱峰分离效果较好,分辨率高,无重叠。,2、DEAE-52纤维素层析纯化IgG结果,用DEAE纤维素离子交换柱进行纯化,以OD280nm为纵坐标,洗脱时间为横坐标,绘制洗脱色谱图:,16,图 福林酚试剂法测蛋白质浓度标准曲线,(三)提取液蛋白含量测定结果,1、标准曲线,17,

6、分别将低盐峰和高盐峰样品吸光度代入蛋白质标准曲线,计算求得低盐峰样品蛋白质含量1.45mg/mL,高盐峰样品蛋白质含量为.74mg/mL。,2、样品IgG含量测定,18,(四)SDS-PAGE测IgG分子量结果,猪血清、纯化的IgG样品经SDS-PAGE电泳结果如下:,1标准蛋白 2 猪血清 3 纯化的IgG样品,19,IgG样品经预处理过程中巯基乙醇的作用而打开二硫键,还原成两条单链,再进一步与SDS结合成带大量负电荷的SDS-蛋白复合物,SDS-PAGE电泳呈现两条较浓的条带。 猪血清球蛋白经正辛酸法提取,DEAE纯化后,所得IgG较纯净,基本无其它杂蛋白,表明该提取纯化工艺能得到较纯净的

7、免疫球蛋白。,20,1、标准曲线制作,以标准蛋白质相对分子质量的对数(lgMw)为纵坐标,蛋白质迁移距离为横坐标,得到以下标准曲线。,21,2、IgG样品分子量测定结果,根据样品IgG的迁移距离从标准曲线上查出其相对分子质量如下:重链约55000,轻链约24000。即猪血清IgG球蛋分子量为16万左右,与文献蛋白质技术手册报道结果一致。,22,四、总结与感想,总的来说,本次试验还是成功的,虽然说试验方法在细节上还有很多需要改进的地方,但实验目的已经达到。 本次实验课是一次不同于以往的自主性实验课程,需要我们自己查找资料、设计实验方案,更需要我们独立思考、通过团队合作完成实验。,23,这种以学生为主,老师

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