第二章 核酸化学

1、第二章 核 酸 化 学,第一节 概述,一、核酸的发现,早先，人们认为遗传物质是蛋白质 1868年，瑞士科学家Miescher从外科绷带上脓细胞的核中分离出了一种富含磷的有机物质，称为“核素” 1889年，Altman等人又从酵母和动物的细胞核中得到了不含蛋白质的核酸,并命名为核酸,1944年，Avery等人通过肺炎双球菌转化实验证明DNA是遗传物质 1952年，Hershey and Chase 通过噬菌体侵染实验，证明进入细菌体内进行复制的是DNA而非蛋白质 1953年，DNA的双螺旋结构模型，从此核酸的研究成了生命科学中最活跃的领域,核酸分为两大类： 脱氧核糖核酸（DNA） Deoxynu

2、cleic Acid 核糖核酸（RNA） Ribonucleic Acid,二、核酸的种类和分布,RNA的种类、分布、功能,除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA,核糖体,RNA,核内不均一,RNA,核内小,RNA,细胞核和胞液,线粒体,功,能,rRNA,mRNA,mt,rRNA,tRNA,mt,mRNA,mt,tRNA,HnRNA,SnRNA,SnoRNA,scRNA/7SL,-,RNA,核糖体组分,蛋白质合成模板,转运氨基酸,成熟,mRNA,的前体,参与,hnRNA,的剪接、转运,rRNA,的加工、修饰,蛋白质内质网定位合成,的信号识别体的组分,RNA,信使R

3、NA,转运RNA,RNA,核内小,胞浆小RNA,细胞核和胞液,线粒体,功,能,rRNA,mRNA,mt,rRNA,tRNA,mt,mRNA,mt,tRNA,HnRNA,SnRNA,SnoRNA,scRNA/7SL,-,RNA,蛋白质合成模板,转运氨基酸,的前体,的加工、修饰,蛋白质内质网定位合成,的信号识别体的组分,核仁小RNA,含量,80 5 10-15,三、核酸的生物功能,（一）DNA是主要的遗传物质 （二）RNA功能的多样性 1、参与蛋白质的合成 2、RNA的转录后加工与修饰 3、参与基因表达的调控 4、生物催化作用 5. 遗传物质 （RNA病毒）,第二节 核酸的化学组成,一、核酸的元素

4、组成,由碳、氢、氧、氮、磷组成 含磷量：DNA平均为9.9% RNA平均为9.5% 可通过测定核酸样品的含磷量来计算核酸的含量,核酸是多聚核苷酸(polynucleotide)，基本结构单位是核苷酸 DNA与RNA结构相似，组成成份上略有不同,二、核酸的分子组成,核酸的组成,核酸,核苷酸,水 解,核 酸,代表戊糖，对DNA而言为脱氧核糖，对RNA而言为核糖；,代表碱基,代表磷酸基,核苷酸,（一）碱基,嘌呤碱：腺嘌呤、鸟嘌呤 嘧啶碱：胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶 稀有碱基：,嘌呤环,嘧啶环,1. 嘌呤碱,2. 嘧啶碱,(uracil),(cytosine),(thymine),RNA,DNA,尿嘧啶

5、 U,胸腺嘧啶 T,胞嘧啶 C,鸟嘌呤 G,腺嘌呤 A,3. 稀有碱基,嘌呤次黄嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、 N2、N2-二甲基鸟嘌呤 嘧啶5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、 二氢尿嘧啶、4-巯尿嘧啶 都是基本碱基的化学修饰型，以甲基化碱基居多,（二）戊糖,DNA含-D-2-脱氧核糖 RNA含-D-核糖,均以呋喃糖态存在,（三）核苷 nucleoside,戊糖和碱基缩合成的糖苷称为核苷 糖与碱基之间的C-N键：C-N糖苷键 C1N1（嘧啶） C1N9（嘌呤） 碱基与糖环平面垂直,核苷 nucleoside,核苷 nucleoside,分类：（所含戊糖不同） 核糖核苷：RNA的组成成分 脱氧核糖核苷

6、：DNA的组成成分,核苷 nucleoside,稀有核苷： 包括碱基的修饰和核糖的修饰（主要指甲基化） 如tRNA和rRNA中的假尿嘧啶核苷,假尿苷，pseudouridine， ,（四） 核苷酸,磷酸,碱基,戊糖,H2O,H2O,碱基,磷酸,戊糖,糖苷键,酯键,核苷酸,碱基连接（糖苷键）,酯 键,（对DNA为H）,1,2,3,4,5,八种核苷酸,M/单，D/二，T/三；P-磷酸 RNA的名称为单/二/三苷酸， DNA在单/二/三前加脱氧两字 如AMP称腺苷一磷酸(或腺苷酸） dAMP称为脱氧腺苷一磷酸（脱氧腺苷酸）,（五）核苷酸的衍生物,ATP (腺嘌呤核糖核苷三磷酸) 生物体内分布最广和最

7、重要的一种核苷酸衍生物,1. 多磷酸核苷酸（ATP、GTP、）,ATP的性质,是重要的能量转换中间体 ATP含两个高能磷酸键：水解时 可释放大量自由能，推动体内各种需能反应,GTP (鸟嘌呤核糖核苷三磷酸),生物体内游离存在，也是一种高能化合物 具有类似ATP的结构 参与蛋白质生物合成 在许多情况下, ATP 和 GTP 可以相互转换,2. 环化核苷酸（cAMP 和 cGMP）,cAMP 3,5环腺嘌呤核苷一磷酸 cGMP 3,5-环鸟嘌呤核苷一磷酸 细胞功能的调节分子和信号分子 cAMP 和 cGMP 的环状磷酯键是一个高能键：pH 7.4时水解能约为43.9 kJ /mol，比 ATP 水

8、解能高得多,NAD+ (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸) NADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸) FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）,3. 辅酶类核苷酸,第三节 核酸的分子结构,一、DNA的分子结构,核酸是由核苷酸聚合而成的生物大分子 核酸的一级结构就是核酸的共价结构，即核酸的核苷酸序列,（一）DNA的一级结构,DNA的一级结构即DNA分子中脱氧 核糖核苷酸的排列顺序，也即碱基排列顺序,脱H2O 脂键相连,3，5-磷酸二酯键,首,尾,DNA一级结构的简写形式,A,核苷酸,首端,末端,(5)pApCpTpG(3) (5)pA-C-T-GOH(3) (5)ACTG(3),核苷酸顺序又称碱基顺序,1. DNA双螺旋

9、结构的研究背景,碱基组成分析 Chargaff 规则：A = T G C 嘌呤碱 = 嘧啶碱,DNA的碱基物化数据测定,DNA纤维的X-射线衍射图谱分析 戊糖环与DNA分子纵轴平行，碱基平面与纵轴垂直,（二）DNA的二级结构,Franklin, Rosalind Elsie (1920-58), British biophysicist. Born in London, she was educated in physical chemistry at Newnham College, Cambridge. Franklin conducted X-ray diffraction studie

10、s on the structure of the DNA molecule, the carrier of hereditary information, while working in the laboratory of British biophysicist Maurice Wilkins. This work enabled American biochemist James Dewey Watson and the British Francis Crick to determine the helical structure of the DNA molecule.,2. DN

11、A二级结构,James Watson (left) and Francis Crick, 1953,DNA的二级结构是指DNA的双螺旋结构,a. 两条反向平行的 多核苷酸链围绕 同一中心轴缠绕， 均为右手螺旋,(1)结构特征,b. 双螺旋表面形成两种凹槽：较浅的叫小沟，另一条叫大沟 大沟：宽1.2nm，深0.85nm小沟：宽0.6nm，深0.75nm,c. 碱基位于双螺旋的内侧， 磷酸和核糖在外侧， 通过3，5磷酸二酯键构成骨架 碱基平面与纵轴垂直， 糖环平面与纵轴平行,d. 主要参数,双螺旋的直径为2nm， 碱基堆积距离为0.34nm， 两个核苷酸之间的夹角36， 每圈螺旋含10个碱基，螺距

12、3.4nm,e.两条核苷酸链依靠碱基间形成的氢键而结合 AT GC f. 碱基在一条链上的排列顺序不受任何限制。但根据碱基配对原则，一条核苷酸链序列可决定另一条互补链的序列,A = T,碱基堆积力（主要因素） 双螺旋中垂直方向的作用力 碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定 水平方向的作用力 离子键,3. 稳定双螺旋结构的因素,类型 旋转方向 螺旋直径 螺距 每转碱基对数 碱基对间距 碱基倾角 A-DNA 右 2.5 2.8 11 0.255 20 B-DNA 右 2.0 3.4 10 0.34 0 Z-DNA 左 1.8 4.5 12 0.37 7,4. DNA双螺旋结构的多样性,三股螺旋DN

13、A K. Hoogsteen 1963,通常多聚嘧啶（polyPy）和多聚嘌呤（polyPu）组成的DNA螺旋区段均可转变为三链结构 其中两股形成反向平行的双螺旋，碱基按watson-Crick方式配对，第三股多聚嘧啶则以正向平行结合于双螺旋的大沟中，碱基通过Hoogsten方式配对,三链DNA的碱基配对,Hoogsten 氢键 G C+(质子化 ),Watson-Crick A T G C,DNA双螺旋通过扭曲和折叠所形成的特定构象 超螺旋是DNA三级结构的主要形式,（三）DNA的三级结构,正超螺旋（ positive supercoil）,负超螺旋（ negative supercoil）

14、,二、 RNA的分子结构,核糖核苷酸通过磷酸二酯键相连形成的长链(一级结构) 研究最多：tRNA、rRNA、mRNA,RNA通常是单链线形分子 自身回折形成局部双螺旋（二级结构） 进而折叠（三级结构） 多数形成核蛋白复合物（四级结构），如核糖体,RNA中的碱基配对原则 A-U G-C,1. tRNA一级结构特点： 约由7090个核苷酸组成 分子中含有较多的稀有碱基（10-20%） 3-末端都具有CCAOH的结构 5-末端磷酸化，常为pG或pC,（一）tRNA的分子结构,2. tRNA的三叶草型二级结构,1,2,3,叶子,反密码子环,反密码子,载运氨基酸,臂,稀有碱基,四环四臂,3. tRNA的

15、三级结构,tRNA的三级结构：倒“L”形,tRNA的功能： 结合活化氨基酸（ 3-CCA-OH ） 搬运氨基酸到核糖体 识别mRNA密码子 参与蛋白质的翻译,5末端帽子结构：m7GpppN 3末端有多聚腺苷酸尾巴结构(polyA) 单顺反子（一条mRNA链上有一个编码区）,（二）mRNA的分子结构,1. 真核细胞mRNA一级结构,真核生物mRNA的共价结构,帽子结构,帽子结构：识别翻译起始，即有助于核糖体对mRNA的识别与结合 polyA：维持mRNA的稳定性,功能,原核生物mRNA为多顺反子，无修饰碱基 多顺反子mRNA(polycistronic mRNA)：一条mRNA链上有多个编码区,

16、2. 原核细胞mRNA的一级结构,mRNA的功能 蛋白质合成的模板,rRNA的一级结构 种类（根据沉降系数）,真核生物 5S rRNA 28S rRNA 5.8S rRNA 18S rRNA,原核生物 5S rRNA 23S rRNA 16S rRNA,（三）rRNA的分子结构,核糖体：rRNA+蛋白质 催化肽键合成的是rRNA ， 蛋白质维持rRNA构象，起辅助作用,2. rRNA的高级结构,大肠杆菌16s rRNA,rRNA的功能 作为核糖体的骨架； 催化肽键的形成,三、核酸与蛋白质复合物体,1. 真核生物的染色体,（H2A、H2B、H3、H4）2,2. 细菌的拟核 拟核：细菌的染色体在细

17、胞内紧密缠绕成的小体结构 由双环DNA、少量的RNA、一些碱性蛋白构成,3. 病毒 由核酸和蛋白质组成 核酸：核心、基因组 蛋白质：衣壳，保护核酸 病毒的核酸可以是DNA或RNA 尚未发现两者兼有的病毒核酸,第四节 核酸的理化性质,一、核酸的一般物理性质,1、形态 2、溶解性 3、粘度 4、密度及沉降特性,核酸、核苷酸均为两性电解质,二、核酸的两性解离,核酸表现为酸性 有等电点，可电泳 DNA等电点为44.5；RNA等电点为22.5,利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的PH来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,三、核酸的紫外吸收性质,嘌呤和嘧啶具有共轭双

18、键，因而碱基、核苷、核苷酸、核酸能强烈吸收紫外光 最大吸收峰260nm左右 紫外吸收值大小比较,A260的应用： 1. DNA或RNA的定量（纯样品） 2.判断核酸样品的纯度 3.判断DNA是否变性,四、核酸的变性、复性与杂交,(一) 核酸的变性（denaturation） 1、定义： 在某些理化因素作用下，核酸分子中碱基对之间的氢键断裂，双螺旋结构变成无规律的“线团”，空间结构被破坏，一级结构不变，理化性质及生物活性发生改变的现象。,某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力， 使核酸分子高级结构改变、理化性质及 生物活性发生改变 不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变,变性的实质,降解：核酸骨架上3，5 -磷酸二酯键的断裂,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,高温（一般75） 热变性 强酸、碱 酸碱变性 甲醛 尿素,2、变性因素,OD260增高 粘度下降 浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失,3、变性后理化性