缓冲液的配制方法

1、核酸电泳相关试剂、缓冲液的配制方法50TAE Buffer (pH8.5)组份浓度 2 M Tris-醋酸，100 mM EDTA配制量 1 L配制方法 1.称量下列试剂，置于1 L烧杯中。Tris242 gNa2EDTA2H2O37.2 g 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加入57.1 ml的乙酸，充分搅拌。 4.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。10TBE Buffer (pH8.3) 组份浓度 890 mM Tris-硼酸，20 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法 l.称量下列试剂，置于l L烧杯中。Tris108 gNa2EDTA2H2O7.

2、44 g硼酸55 g 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。10MOPS(3-吗啉基丙磺酸)Buffer 组份浓度 200 rnM MOPS，20 mM NaOAc，10 mM EDTA配制量 1 L配制方法 1.称41.8 g MOPS，置于1 L烧杯中。 2.加约700 ml DEPC处理水，搅拌溶解。 3.使用2 N NaOH调节pH值至7.0。 4.再向溶液中加入下列试剂。1 M NaOAc(DEPC处理)20 ml0.5 M EDTA(pH8.0)(DEPC处理)20 ml 5.用DEPC处理水将溶液定容至1 L。 6

3、.用0.45 m滤膜过滤除去杂质。 7.室温避光保存。注：溶液见光或高温灭菌后会变黄。变黄时也可使用，但变黑时不要使用。溴乙锭 (10 mg/ml)组份浓度 10 mg/ml溴乙锭配制量 100 ml配制方法 1.称量1 g溴乙锭，加入到100 ml容器中。 2.加入去离子水100 ml，充分搅拌数h完全溶解溴乙锭。 3.将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。 4.溴乙锭的工作浓度为0.5 g/ml。注意：溴乙锭是一种致癌物质，必须小心操作。Agarose凝胶 配制方法 1.配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(通常是0.5TBE或1TAE)。 2.根椐制胶量及凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉，加入适当的锥

4、形瓶中。 3.加入一定量的电泳缓冲液(总液体量不宜超过锥形瓶的50%容量)。 注：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。 4.在锥形瓶的瓶封上保鲜膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波炉中加热熔化琼脂糖。加热过程中，当溶液沸腾后，请戴上防热手套。小心摇动锥形瓶。使琼脂糖充分均匀熔化。此操作重复数次，直至琼脂糖完全熔化。必须注意，在微波炉中加热时间不宜过长，每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造成琼脂糖凝胶浓度不准，也会损坏微波炉。熔化琼脂糖时，必须保证琼脂糖充分完全熔化，否则，会造成电泳图像模糊不清。 5.使溶液冷却至60左右，如需要可在此时加入溴乙锭溶液(终浓度0.5 g/

5、ml)。并充分混匀。 注：溴乙锭是一种致癌物质。使用含有溴乙锭的溶液时，请戴好手套。 6.将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度 一般在35 min之间。 7.在室温下使胶凝固(大约30 min1 h)，然后放置于电泳槽中进行电泳。 注：凝胶不立即使用时，请用保鲜膜将凝胶包好后在4下保存，一 般可保存25天。 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围琼脂糖浓度最佳线形DNA分辨范围(bp) 0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0% 1,00030,000 80012,000 50010,000 4007,000 2003,000 502,0006 Loa

6、ding Buffer(DNA电泳用) 组份浓度30 mMEDTA36%(V/V)Glycerol0.05%(W/V)Xylene Cyanol FF0.05%(W/V)Bromophenol Blue 配制量 500 ml 配制方法 1.称量下列试剂，置于500 ml烧杯中。EDTA4.4gBromophenol Blue250 mgXylene Cyanol FF250 mg 2.向烧杯中加入约200 ml的去离子水后，加热搅拌充分溶解。 3.加入180 ml的甘油(Glycerol)后，使用2 N NaOH调节pH值至7.0。 4.用去离子水定容至500 ml后，室温保存。10 Load

7、lng Buffer (RNA电泳用)组份浓度10 mMEDTA50%(V/V)Glycerol0.25%(W/V)Xylene Cyanol FF0.25%(W/V)Bromophenol Blue配制置 10 ml配制方法 1.称量下列试剂，置于10 ml离心管中。0.5 M EDTA(pH8.0)200 lBromophenol Blue25 mgXylene Cyanol FF25 mg 2.向离心管中加入约4 ml的DEPC处理水后，充分搅拌溶解。 3.加入5 ml的甘油(Glycerol)后，充分混匀。 4.用DEPC处理水定容至10 ml后，室温保存。四、核酸、蛋白质杂交用相关试

8、剂、缓冲液的配制方法20SSC 组份浓度 3.0 M NaCl，0.3 M Na3citrate2H2O(柠檬酸钠)配制量 1 L配制方法 1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。NaCl175.3 gNa3citrate2H2O88.2 g 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3滴加14 N HCl，调节pH值至7.0后，加去离子水将溶液定容至1 L。 4.高温高压灭菌后，室温保存。20SSPE Buffer 组份浓度 3.0 M NaCl，0.2 M NaH2PO4，0.02 M EDTA配制量 1.L配制方法 1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。NaCl175.3 gN

9、aH2PO4H2O27.6 gNa2EDTA2H2O7.4 g 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加NaOH调节pH值至7.4(约6.5 ml的10 N NaOH)。 4.加去离子水将溶液定容至l L。 5.高温高压灭菌后，室温保存。50 X DenhardtS溶液 1%(W/V)Ficoll 400(菲可400/水溶性聚蔗糖400)1%(W/V)Polyvinylpyrrolidone(聚维酮/聚乙烯吡咯烷酮)1%(W/V)BSA组份浓度配制量 500 ml配制方法 1.称量下列试剂，置于500 ml烧杯中。Flcoll 4005 gPoLyvlnylpyrrol

10、ldone5 gBSA5 g 2.加去离子水约400 ml，充分搅拌溶解 3.加去离子水将溶液定容至500 ml。 4.用0.45m滤膜过滤后，分装成每份25 ml。 5.-20保存。0.5 M磷酸盐Buffer 组份浓度 0.5 M Na2HPO4。 配制量 l L 配制方法 1.称量134 g Na2HPO47H2O置于l L烧杯中。 2.加入约800 ml的去离子水充分搅拌溶解。 3.加入85%的H3PO4(浓磷酸)调节溶液pH值至7.2。 4.加去离子水定容至1 L。 5.高温高压灭菌后，室温保存。Salmon DNA (鲑鱼精DNA) 组份浓度 10 mg/ml Salmon DNA

11、配制量 约100 ml配制方法 1.称取鲑鱼精DNA 2 g置于500 ml烧杯中，加入约200 ml的TE Buffer。 2用磁力搅拌器室温搅拌24 h，溶解后加入4 ml的5 M NaCl，使其终浓度为0.1 M。 3.用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次。 4.回收水相溶液后，使用17号皮下注射针头快速吸打溶液约20次，以 切断DNA。 5.加入2倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀。 6.离心回收DNA后，溶解于100 ml的去离子水中。测定溶液的OD260值。 7.计算溶液的DNA浓度后，稀释DNA溶液至10 mg/ml。 8.煮沸10min后，分装成小份(1 ml/份)。-20保存。 9.使用前

12、在沸水浴中加热5min后，迅速冰浴冷却。DNA变性缓冲液 组份浓度 1.5 M NaCl，0.5 M NaOH 配制量 1 L 配制方法 1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。NaCl87.7 gNaOH20 g 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。预杂交液/杂交液 (DNA杂交用)6SSC(或SSPE)5Denhardts0.5%(W/V)SDS100 g/mlSalmon DNA 组份浓度 配制置 100 ml 配制方法 1.称量下列试剂，置于200 ml烧杯中。20SSC(或SSPE)30 ml50Denhardts10

13、ml10% SDS 5 ml10 mg/ml Salmon DNA1 mldH2O54 ml2.充分混匀后，使用0.45 m滤膜滤去杂质后使用。预杂交液/杂交液(RNA杂交用)6SSC(或SSPE)5Denhardts0.5%(W/V)SDS100 g/mlSalmon DNA50%(V/V)Formamlde组份浓度配制量 100 mL配制方法 1.称量下列试剂，置于200 ml烧杯中。20SSC(或SSPE)30 ml50Denhardts10 ml10% SDS 5 ml10 mg/ml Salmon DNA1 mlFormamide(甲酰胺)50 mldH2O4 ml 2.充分混匀后，

14、使用0.45m滤膜滤去杂质后使用。膜转移缓冲液(Western杂交用) 组份浓度 39 mM Glycine，48 mM Tris，0.037%(W/V)SDS，20%(V/V)甲醇配制量 1 L配制方法 1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。Glycine2.9 gTris5.8 gSDS0.37 g 2.向烧杯中加入约600 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加去离子水将溶液定溶至800 ml后，加入200 ml的甲醇。 4.室温保存。TBST Buffer(Western杂交膜清洗液) 组份浓度 20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.05%(V/V)Tween 20配

15、制量 1 L配制方法 1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。NaCl8.8 g1 M Tris-HCl(pH8.0)20 ml 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加入0.5 ml Tween 20后充分混匀。 4.加去离子水将溶液定容至l L后，4保存。封闭缓冲液(Western杂交用)组份浓度 5%(W/V)脱脂奶粉/TBST Buffer配制量 100 ml配制方法 1.称5 g脱脂奶粉加入到100 ml TBST Buffer中，充分搅拌溶解。 2.4保存待用(本封闭液应该现配现用)。五、实验室常用培养基的配制方法Ampicillin(氨卡青霉素)(100 mg

16、/ml)组份浓度 100 mg/ml Ampicillin配制量 50 ml配制方法 1.称量5 g Ampicillin置于50 ml离心管中。 2.加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。 3.用0.22 m过滤膜过滤除菌。 4.小份分装(1 ml/份)后，-20保存。IPTG(异丙基-D-硫代半乳糖苷)(24 mg/ml)组份浓度 24 mg/mL IPTG配制量 50 mL配制方法 1.称1.2 g IPTG置于50 ml离心管中。 2.加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。 3.用0 22 m过滤膜过滤除菌。 4小份分装(1 ml，份)后，-20保存

17、。X-Gal (20 mg/ml)组份浓度 20 mg/ml X-Gal配制量 50 ml配制方法 1.称量l g X-Gal置于50 ml离心管中。 2.加入40 ml DMF(二甲基甲酰胺)，充分混合溶解后，定容至50 ml。 3.小份分装(1 ml/份)后，-20避光保存。 LB培养基组份浓度 1%(W/V)Tryptone(胰蛋白胨)，0.5%(W/V)Yeast Extract(酵母提取物)，1%(W/V)NaCl配制量 1 L配制方法 1.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Tryptone10 gYeast Extract5 gNaCl10 g 2.加入约800 ml的去离子水，充分

18、搅拌溶解。 3.滴加5 N NaOH(约0.2 m1)，调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5高温高压灭菌后，4。C保存。LB/Amp培养基 组份浓度1%(W/V)Tryptone0.5%(W/V)Yeast Extract1%(W/V)NaCl0.1 mg/mlAmpicillin配制量 1 L配制方法 1.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Tryptone10 gYeast Extract5 gNaCl10 g 2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加5 N NaOH(约0.2 mL)。调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5.

19、高温高压灭菌后，冷却至室温。 6.加入1 ml Ampicillin(100 mg/ml)后均匀混合。 7.4保存。1.2%(W/V)Tryptone2.4%(W/V)Yeast Extract0.4%(V/V)Glycerol17mMKH2PO472mMK2HPOaTB培养基 组份浓度配制量 1.L配制方法 1.配制磷酸盐缓；中液(0.17 M KH2PO4，0.72 M K2HPO4)100 ml。 溶解2.31 g KH2PO4和l2.54 g K2HPO4于90 ml的去离子水中，搅拌溶解 后，加去离子水定容至100 ml，高温高压灭菌。 2.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Trypt

20、one12 gYeast Extract24 gGlycerol4 m 3.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 4.加去离子水将培养基定容至1 L后，高温高压灭菌。 5.待溶液冷却至60以下时，；加入100 ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液。 6.4保存。TB/Amp培养基 组份浓度1.2%(W/V)Tryptone2.4%(W/V)Yeast Extract0.4%(V/V)Glycerol17 mMKH2PO472 mMK2HPO40.1 mg/mlAmpicillin 配制量 1 L 配制方法 1.配制磷酸盐缓冲液(0.17 M KH2PO4，0.72 M K2HPO4)100 ml

21、。 溶解2.31 g KH2PO4,和12.54g K2HPO4于90 ml的去离子水中，搅拌溶解后，加去离子水定容至100 ml，高温高压灭菌。 2.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Tryptone12 gYeast Extract24 gGlycerol4 ml 3.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 4.加去离子水将培养基定容至l L后，高温高压灭菌。 5.待溶液冷却至60以下时， 加入100 ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液。6.均匀混合后4保存。SOB培养基 组份浓度2%(W/V)Tryptone0.5%(W/V)Yeast Extract0.05%(W/V)NaCl2.5mMK

22、Cl10 mMMgCl2配制量 1 L配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。 在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后，定容至100 ml。 2.配制2 M MgCl2溶液。 在90 ml去离子水中溶解19 g MgCl2后，定容至100 ml，高温高压灭菌。 3.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Tryptone20 gYeast Extract5 gNaCl0.5 g 4.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 5.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到烧杯中。 6.滴加5 N NaOH溶液(约0.2 m1)，调节pH值至7.0。 7.加入去离子水将培养基定容

23、至l L。 8.高温高压灭菌后，4保存。 9.使用前加入5 ml灭菌的2 M MgCl2溶液。SOC培养基 组份浓度2%(W/V)Tryptone0.5%(W/V)Yeast Extract0.05%(W/V)NaCl2.5 mMKCl10 mMMgCl220 mMGlucose配制量 100 mL配制方法 1.配制l M Glucose溶液。 将18 g Glucose溶于90 ml去离子水中，充分溶解后定容至100 ml。用0.22 m滤膜过滤除菌。 2.向l 00 ml SOB培养基中加入除菌的1 M Glucose溶液2 ml，均匀混合。 3.4保存。2YT培养基组份浓度 1.6%(W

24、V)Tryptone，1%(W/V)Yeast Extract，0.5%(W/V)NaCl配制量 1 L配制方法 1.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Tryptone16 gYeast Extract10 gNaCl5 g 2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加5 N NaOH，调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5.高温高压灭菌后，4保存。bbroth 组份浓度 2%(W/V)Tryptone，0.5%(W/V)Yeast Extract，o 5%(W/V)MgSO47H2O配制量 1 L配制方法 1.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Trypton

25、e20 gYeast Extract5 gMgSO47H2O 5 g 2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加1 N KOH。调节pH值至7.5。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5.高温高压灭菌后，4保存。NZCYM培养基 组份浓度0.5%(WV)Yeast Extract0.1%(WV)Casamino Acid（酪蛋白氨基酸）1%(WV)NZ胺0.5%(WV)NaCl0.2%(WV)MgSO47HO配制量 1 L配制方法 1.称取下列试剂。置于l L烧杯中。Yeast Extract5 gCasamino Acid1 gNZ胺10 gNaCl5 gMgSO47HO

26、2 g 2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加5 N NaOH(约0.2 m1)，调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5.高温高压灭菌后，4保存。NZYM培养基 组份浓度0.5%(WV)Yeast Extract1%(WV)NZ胺0.1%(WV)NaCl0.2%(WV)MgSO47HO 配制方法 NZYM培养基除不含Casamino Acid外，其他成份与 NZCYM培养基相同。NZM培养基 组份浓度1%(WV)NZ胺0.1%(WV)NaCl0.2%(WV)MgSO47HO 配制方法 NZM培养基除不含Yeast Extract(酵母提取物)外，其他

27、成份与NZYM培养基相同。一般固体培养基的配制 配制方法 1.按照液体培养基配方准备好液体培养基，在高温高压灭菌前，加入下列 试剂中的一种。Agar(琼脂；铺制平板用) 15 g/LAgar(琼脂；配制顶层琼脂用) 7 g/LAgarose(琼脂糖；铺制平板用) 15 g/LAgarose(琼脂糖；配制顶层琼脂用) 7 g/L 2.高温高压灭菌后，戴上手套取出培养基，摇动容器使琼脂或琼脂糖充分混匀(此时培养基温度很高，小心烫伤)。 3.待培养基冷却至5060时，加入热不稳定物质(如抗生素等)，摇动容器充分混匀。 4.铺制平板(3035 ml培养基/90 mm培养皿)。LB/Amp/X-Gal/

28、LPTG平板培养基 组份浓度1%(W/V)Tryptone0.5%(W/V)Yeast Extract1%(W/V)NaCl0.1 mg/mlAmpicillin0.024mg/mlIPTG0.04 mg/mlX-GaL1.5%(W/V)Agar配制量 1 L配制方法 1.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Tryptone10 gYeast Extract5 gNaCl10 g 2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加5 N NaOH(约0.2 mL)，调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L后，加入15 g Agar。 5.高温高压灭菌后，冷却至60左右。 6

29、.加入1 ml Ampicillin(100 mg/ml)、1 ml IPTG(24 mg/ml)、2 ml X-Gal(20 mg/mL)后均匀混合。 7.铺制平板(3035 ml培养基/90 mm培养皿)。 8.4避光保存。TB/Amp/X-Gal/LPTG平板培养基 组份浓度1.2%(W/V)Tryptone2.4%(W/V)Yeast Extract0.4%(V/V)Glycerol17 mMKH2PO472 mMK2HPO40.1 mg/mlAmpicillin0.024 mg/mlIPTG0.04mg/mLX-GaL1.5%(W/V)Agar配制量 1 L配制方法 1.配制磷酸盐缓

30、冲液(0.17 M KH2PO4，0.72 M K2HPO4)100 ml。 溶解2.31 g KH2PO4和12.54 g K2HPO4于90 ml的去离子水中，搅拌溶解后，加去离子水定容至100 ml，高温高压灭菌。 2.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Tryptone12 gYeast Extract24 gGlycerol4 ml 3.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 4.加去离子水将培养基定容至1 L后。加入l 5 g Agar。 5.高温高压灭菌后，冷却至60左右。 6.加入100 ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液、l ml Ampicillin (100mg/ml)、1 m

31、l IPTG(24mg/mL)、2 ml X-Gal(20 mg/ml)后均匀混合。 7.铺制平板(3035 ml培养基/90 mm培养皿)。 8 4避光保存。六、抗生素的贮存溶液及其工作浓度抗生素 贮存液*1 工作浓度 浓度 保存条件 严紧型质粒 松弛型质粒 氨苄青霉素 羧苄青霉素 氯霉素 卡那霉素 链霉素 四环素*2 50 mg/ml(溶于水) -20 50 mg/mL(溶于水) -20 34 mg/mL(溶于乙醇) -20 10 mg/mL(溶于水) -20 10 mg/mL(溶于水) -20 5 mg/mL(溶于乙醇) -20 20 g/ml 60 g/ml 20 g/ml 60 g/

32、ml 25 g/ml l70 g/mL 10 g/ml 50 g/ml 10 g/ml 50 g/ml 10 g/ml 50 g/mL*1以水为溶剂的抗生素贮存液应通过0.22 m滤器过滤除菌。以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。所有抗生素溶液均应保存于不透光的容器中。*2镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基(如LB培养基)。七、SDS-PAGE浓缩胶(5%Acrylamide)配方表 各种组份名称各种凝胶体积所对应的各种组份的取样量 1 m1 2 m1 3 m1 4 ml 5 ml 6 m1 8 m1 10 mL H2O 30%Acrylamide 1.0M T

33、ris-HCl(pH6.8) 10%SDS 10%过硫酸铵 TEMED. 0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0 1.3 17 0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 0 75 1.0 l.25 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0 06 0.08 0.1 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.008 0.01八、SDS-PAGE分离胶配方表各种组份名称各种凝胶体积所对应的各

34、种组份的取样量5m1 10m1 15m1 20 ml 25m1 30m1 40m1 50 ml6%GelH2O30%Acrylamide1.5 M Tris-HCl(pH8.8)10%SDS10%过硫酸铵TEMED8%GelH2O30%Acrylamide1.5M Tris-HCl(pH8 8)10%SDS10%过硫酸铵TEMED10%GeLH2O30%Acrylamide1.5 M Tris+HCl(pH8.8)10%SDS10%过硫酸铵TEMED12%GeLH2O30%Acrylamide1.5 M Tris-HCl(pH8.8)10%SDS10%过硫酸铵TEMED15%GelH2O30%Acrylamide1.5M Tris-HCl(pH8.8)10%SD