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文档简介

1、第6章酶的分子修饰,酶的化学修饰2。酶的分子定向进化,什么是酶的分子修饰?通过各种方法改变酶分子结构,从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。第一节酶的化学修饰,广义上:任何涉及共价部分或共价形成或破坏部分的转化。狭义:在温和的条件下,蛋白质以可控的方式与某些化学试剂发生特异性反应,从而引起单个氨基酸或其功能基团的共价化学变化。酶的化学修饰功能;1)催化机理研究。通过对特定基团的侧链进行化学修饰,可以方便地获得必需基团的性质,并且通过保护也可以知道活性位点的信息。2)靶向基团修饰或保护可以有目的地改变酶的活性。3)改变酶的生理生化特性,如稳定性、最适酸碱度、抗原性,达到特定的研究或

2、应用目的。1.酶化学改性方法和改性剂,改性剂的要求,反应条件的选择,酶的性质,1。影响酶化学修饰的主要因素:(1)影响酶蛋白官能团反应性的因素在微区极性蛋白中酚基与羧基的相互作用中,羧基的pKa比正常低,而酚基的pKa比正常高。静电效应和空间效应;2.改性剂的反应性选择吸附静电相互作用空间因子和催化因子;2.修饰反应特异性的控制;(1)试剂选择的不同实验目的对特异性有不同的要求。(2)反应条件的选择:不会引起蛋白质的不可逆变性。它有利于蛋白质的特异性修饰。(3)反应特异性,利用蛋白质分子中某些基团的特殊性来选择不同的反应酸碱度,利用某些产物的不稳定亲和标记,利用蛋白质状态的差异,(3)修饰程度

3、和修饰位点的确定,(1)光谱学,(2)化学修饰数据的分析,化学修饰的时程分析,以及必要基团的性质和数目的确定。设计酶促化学反应时,应注意了解酶的性质、酶的活性位点和酶的催化活性主要取决于什么。因此,有必要了解酶活性中心的组成,例如,酶蛋白中哪些氨基酸残基或侧链基团参与了酶的活性中心,是否需要辅因子,需要什么辅因子等。此外,有必要了解酶的分子大小和形状、寡聚酶的亚基组成等。酶的稳定性条件、酶反应的最佳条件、改性酶对热、酸和碱的稳定性、工作温度和酸碱度范围、最佳温度和酸碱度、酶蛋白解离的电性质、酶蛋白的水解位点、抑制剂的性质等。酶分子侧链基团的化学性质和反应性酶和反应性选择性修饰试剂的侧链基团的性

4、质必须与多肽链中特定氨基酸残基的侧链基团发生化学反应,并形成紧密的共价键。酶分子中经常被修饰的氨基酸残基的侧链基团包括巯基、氨基、羧基、咪唑、羟基、苯酚、胍、吲哚、硫醚和二硫键。反应体系中酶与改性剂的分子比。反应体系的溶剂性质、盐浓度和酸碱度条件。反应温度和时间。它有利于蛋白质的特异性修饰而不发生不可逆的变性。要求:3 .反应条件的选择;2.酶分子侧链基团的化学修饰。酶分子侧链基团的修饰是通过选择性试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上的特定官能团之间的化学反应实现的。1.几个重要的修饰反应。(1)酰化反应及其相关试剂的特点是具有酰基结构和部分正电荷。这类试剂作用于侧链基团上的亲核基团,使其酰化,酰

5、基与亲核原子相连。官能团包括:氨基(2)烷基化反应,试剂特性:烷基有活性卤素,由于卤素原子的电负性,烷基有部分正电荷。这种试剂作用于侧链基团的亲核基团,使它们烷基化,烷基基团连接到亲核原子上。反应基团包括氨基(赖氨酸、精氨酸)、巯基(半胱氨酸)、羧基(天冬氨酸、谷氨酸)、甲硫基(甲硫氨酸)和咪唑基(组氨酸)。该试剂具有氧化或还原的特性。可氧化基团包括巯基、甲硫基、吲哚基(色氨酸)、咪唑基、二硫键等。还原基团主要是二硫键。(3)氧化还原反应,用四硫酸盐氧化巯基,双硫腙还原反过来,可以用来保护巯基。(4)芳环取代反应,试剂:卤化和硝化试剂。这种试剂作用于酪氨酸的羟基邻位。特定氨基酸残基侧链基团的化

6、学修饰,即通过选择性试剂或亲核试剂对酶进行特定侧链基团的化学修饰,是研究酶分子化学的重要方法,也是修饰酶的性质和功能的重要手段。在20种氨基酸的侧链基团中,只有极性氨基酸的侧链容易被修饰,它们通常是亲核的。从酶动力学的角度来看,酶必需基团的化学修饰过程是不可逆的抑制(活化)。(1)巯基的化学修饰,具有很强的亲核性。巯基与酶蛋白侧链上的巯基结合,改变巯基,从而改变酶的空间构象、特性和功能。巯基修饰可分为以下几种类型:二硫键交换、重金属化合物作用、烷基化和酰化。二硫键交换,e-SH r-s-s-r-e-s-s-r-SH e-SH e-s-s-r-e-s-e-s-e-e-r-SH被修饰,另一半试剂作

7、为单体释放。二硫键交换产生的单体在一定波长下有很大的光吸收,可以用分光光度计连续监测。5,5-二硫代-2-硝基苯甲酸顺丁烯二酰肼,(2)氨基的化学修饰,它具有很高的亲核性,可以通过各种酰化或烷基化试剂进行修饰。烷基化、乙酸酐酰化丹磺酰氯(DNS)、磷酸吡哆醛(一种常用的特异性修饰赖氨酸氨基的试剂)的还原烷基化,(3)羧基的化学修饰,修饰羧基的反应特异性差,天冬氨酸和谷氨酸一般用适当的R and R水溶性碳二亚胺修饰,属于烷基化反应。水溶性碳二亚胺,酯化的三氟硼三甲基绵羊盐(CH3)3BF 4,(4)咪唑基团的化学修饰,通过咪唑基团上氮原子的酰化或烷基化来修饰组氨酸咪唑基团。二乙基焦酸是最常用的

8、试剂。碘乙酸也可以亲核取代咪唑基团上的碳。(5)胍基、二酮、环乙二醇、苯甲酰甲醛的化学修饰。这个反应本质上是羰基的氨基酰化。该反应通常是可逆的,应该加入硼酸盐使产物与它反应并稳定它。然而,当使用苯甲酰甲醛时,反应是不可逆的,并且不需要硼酸盐。二硫键的化学修饰、氧化、过甲酸还原、巯基乙醇、二硫苏糖醇是目前最常用的二硫键修饰剂和巯基保护剂。酶的亲和修饰亲和标记是最重要的化学修饰,因为它能特异性地作用于酶的活性位点。亲和标记是一个逐步的反应,其中修饰物首先可逆地结合到酶的活性位点,然后不可逆地修饰该位点的特定基团,该基团通常是必需基团,导致不可逆的失活。亲和标记修饰剂通常是一种底物类似物,该底物含有

9、一个与酶结合的共同基团。亲和标记的作用符合饱和动力学特征,因此亲和标记过程可视为自杀酶反应。亲和试剂通常是化学反应性蛋白质分子的底物或配体类似物。亲和标记试剂对酶具有特异性结合位点,其解离常数易于测量,可提供酶的结构信息一般来说,亲和标记试剂在较低浓度下能有效修饰酶和改变酶的活性,特别是具有很强的特异性,是一种很好的候选药物,具有广泛的应用价值。1。光亲和标记,其特征在于具有光反应基团。这种试剂首先在黑暗条件下与酶的活性位点特异性结合,然后被光激活产生非常活跃的官能团,该官能团可以与它们附近的几乎所有基团反应形成共价标记。2.特定的不可逆抑制剂。亲和试剂可以被特异性地标记在酶的活性位点上,这使

10、得酶不可逆地失活。因此,它被称为特异性不可逆抑制。(1)Ks抑制剂:根据底物的结构设计,它有一个与底物结构相似的结合基团,还能特异性结合酶的活性位点,并能修饰活性位点的侧链基团,导致酶的不可逆失活。(2)Kcat抑制剂:根据酶催化过程的设计,它具有酶的底物性质,在酶催化活化后,一个潜在的反应基团不可逆地抑制了酶的活性部位,因此也被称为“自杀抑制剂”。有机大分子对酶的化学修饰,利用水溶性大分子与酶结合,使酶的空间结构发生一些细微变化,从而改变酶的特性和功能。聚乙二醇是一种线性分子,具有良好的生物相容性和水溶性,在体内无毒、无残留、无免疫原性,并能消除酶的抗原性,使其末端活化后能与酶交联,因此被广

11、泛应用于酶的修饰。天然超氧化物歧化酶:半衰期6分钟葡聚糖修饰:半衰期7小时聚乙二醇修饰:半衰期35小时过程:活化:修饰剂中所含的基团需要活化后才能与酶分子的侧链基团反应。修饰:将带有活化基团的大分子修饰剂与分离纯化的酶溶液按一定比例混合,在一定的温度、酸碱度等条件下反应一段时间,使修饰剂的活化基团通过共价键与酶分子的某个侧链基团结合,对酶分子进行修饰。分离:需要用凝胶色谱法分离不同修饰程度的酶分子,以获得修饰效果更好的修饰酶。(1)三氯三嗪法,三氯三嗪环上的氯原子非常活泼,容易发生亲核取代反应。当环上的一个氯原子被取代时,它可以稳定其他碳-氯键(第一个氯原子可以在4反应,第二个氯原子在25反应

12、,第三个氯原子在80反应)。(2)叠氮基法,将聚乙二醇链末端的羟基转化为叠氮基,然后与酶反应。聚乙二醇甲氧基甲酯的制备:聚乙二醇与氯乙酸酐和重氮甲烷反应生成聚乙二醇甲氧基甲酯。聚乙二醇酰肼的制备:反应产物与肼反应生成相应的酰肼化合物。聚乙二醇羧甲基叠氮化物的制备:聚乙二醇酰肼化合物与亚硝酸反应生成活化的聚乙二醇。(3)琥珀酸酐法,二溴丁二酸作为聚乙二醇的活化剂。聚乙二醇活化反应和修饰反应,(4)重氮法,修饰剂上的相关基团转化为重氮基团,然后在弱碱条件下与酶分子上的酚基和咪唑基反应生成修饰酶。聚乙二醇活化反应修饰反应,2。葡聚糖和葡聚糖酯。葡聚糖属于细菌多糖,是由葡萄糖通过-1,6糖苷键形成的高

13、分子糖。它具有良好的水溶性和生物相容性,可用作血浆代用品。(1)溴化氢法,(2)周期性酸氧化法,和(3)糖肽,其通常通过蛋白酶或蛋白水解酶降解人纤维蛋白或球蛋白获得。糖肽结构中含有氨基,活化后可与酶分子上的氨基反应,产生共价键。(1)异氰酸法(2)戊二醛法(4)具有生物活性的大分子物质。肝素是一种含有硫酸盐的粘多糖,由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成,平均分子量约为2000。肝素的共价交联可以提高酶的稳定性。同时,肝素具有抗凝血、抗血栓和降血脂活性羧二亚胺法、溴化氢法、三嗪法。蛋白质和其他。血浆蛋白是血浆中的天然成分,它们与其他蛋白(包括酶)的复合物可被认为是血液中的“自体蛋白”。6.酶的化学交联。

14、交联剂是具有两个反应位点的双功能基团,它们可以在两个相距很近的氨基酸残基之间交联,或者在酶和其他分子之间交联。同型双功能试剂和不同的双功能试剂可以被光活化。第五,修饰酶的性质和特性。首先,热稳定性增加。修饰物在多个点与酶交联,固定酶的分子构象并增强酶的热稳定性。增强酶天然构象的稳定性可以减少酶的热失活。然而,聚乙二醇的热稳定性并没有显著提高,因为聚乙二醇与酶在一个点上发生交联,并且相对难以产生固定的酶分子结构。2。抗原性部分可以被消除。人们普遍认为聚乙二醇和人血清白蛋白在消除酶的抗原性方面有明显的作用。3.最适酸碱度某些酶的最适酸碱度在化学修饰后发生了变化,这在应用研究中有时具有重要意义。修饰

15、酶的最适酸碱度更接近生理环境,在临床应用中具有重要意义。4.酶性质的变化大多数酶的最大反应速度在改性后没有变化,但一些酶的米氏常数在改性后会增加。5.组织分布能力的改变改变了组织的分布能力,组织可以被血液中的目标器官选择性地吸收。在第二部分,酶的定向进化,蛋白质工程:酶的蛋白质分子被基因工程修饰,以获得具有更完善的性质和功能的蛋白质分子。酶分子的合理设计:通过各种方法,如生物化学、结晶学、光谱学等,研究天然酶或其突变体。从而获得酶的分子特征、空间结构、结构与功能的关系以及氨基酸残基的功能等信息。例如,化学突变和定点突变等酶分子的不合理设计不需要酶分子结构的准确信息,而是通过随机突变、基因重组、

16、定向筛选等方法进行修饰。如:定向进化和混合进化。定向进化图,随机突变,定向选择目标突变体,自然进化是一个非常缓慢的过程,自发地发生在整个生物体的繁殖和生存过程中。自然选择使进化朝着有利于生存环境的方向发展。环境和适应方式的多样性决定了进化方向的多样性。我们可以在实验室中模拟自然进化的突变、重组和筛选的关键步骤,在短时间内完成漫长的自然进化过程,并有效地转化蛋白质以满足人类的需求。酶具有进化潜力的原因是:生物环境不同于实际应用环境,希望具有更高的活性和稳定性,蛋白质性质涉及非生物体,聚合酶链反应的基本原理,重复13步2530轮,目标脱氧核糖核酸片段扩增100多万倍,脱氧核糖核酸双螺旋,脱氧核糖核酸单链和引物复性,脱氧核糖核酸变性形成两条单链,亚链延伸脱氧核糖核酸加倍。聚合酶链反应的基本原理,聚合酶链反应条件,模板脱氧核糖核酸,聚合酶链反应,引物1,引物2,聚合酶链反应,引物1,引物2,引物2,Taq酶,Taq酶,聚合酶链反应,聚合酶链反应条件,聚合酶链反应过程的特点,聚合酶链反应的基本原理,聚合酶链反应过程的特点,聚合酶链反应条件的基本原理,Taq,Taq,Taq,Taq,Taq。聚合酶链反应条件的特点聚合酶链反应过程,模板DNA,第一轮扩增,第二轮扩增,第三轮扩增,第四轮扩增,第五轮扩增,第六轮扩增,理想拷贝数=2n n个循环次数,实际拷贝数=(1n)X平均效率,约0.

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