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文档简介

1、第1,21章,基因工程,生物化学和分子生物学黄萨克森主编,2,将一种生物的基因和载体分子在体外结合,重组,转移到另一种一生的物体细胞内,使其扩增并表现出新的特性。是生物技术领域的核心技术。基因工程遗传工程,捐赠者,受体,载体是DNA重组技术的三个茄子基本组成部分。体外将徐璐其他来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接成新的DNA分子。为了获得单个基因或DNA片段的大量拷贝,称为基因克隆或分子克隆。DNA重组DNA recombination,3,基因工程genetic engineering,广义:两个茄子上游技术:外源基因的克隆、重组、表达(即窄基因工程或重组DNA技术)下游技术:外,4,5,第一

2、节基因克隆工具酶,6,1,限制性核酸内切酶restriction endonuclease,双链DNA分子内部的特异性序列,在识别部位或周围起切割作用的核酸解酶。存在于多种细菌中,与伴随的甲基化酶一起构成细菌的“限制-修饰”体系,保护自己的DNA,分解外来DNA。维持细菌遗传特性的稳定遗传。(a)概念,7,命名,基本原则:3-4字配置:种名称株序列号,如大肠杆菌R股,=Escherichia 限制性核酸内切DNA都是5磷酸基和3-OH的末端,5g-c-t-g-a-a-t-t-c-g-a-G3,3c-g-a-c 37C,15,部分限制性内切酶及其结果端,16,2,其他共切酶,(2) DNA聚合酶

3、,1。DNA聚合酶,大肠埃希菌DNA聚合酶是单肽链的多功能酶,928个氨基酸。有3个相对独立的活性中心,每个都有53聚合酶活性,35,53核酸外体酶活性。Klenow片段(大片段)指羧基端604个氨基酸,53聚合酶活性,35核酸外体酶活性。17,Klenow片是分子生物学研究中常用的工具。用途:合成cDNA的第二链DNA片段3端(校准活性)标记探针3端DNA序列分析,18,2.Taq-DNA聚合酶(Taq酶),耐热聚合酶,53聚合酶活性和53核酸外体酶活性,热稳定性,19,3。逆转录酶、依赖RNA的DNA聚合酶、合成互补DNA(相容性DNA,cDNA)。功能:逆转作用:53合成cDNA单链核酸

4、酶H的水解作用:35水解杂交双链的RNA依赖DNA的DNA聚合酶作用:杂交双链的DNA为模板催化cDNA的互补链。20,4。端转移酶(TDT),端脱氧核苷酰转移酶,不需要模板的DNA聚合酶。在DNA分子的单双链3-OH上添加DNA,以显示探针并创建粘性末端。21,1.DNA连接酶(DNA ligase),是封闭DNA链缝隙的酶,在DNA中相邻的5磷酸基和3羟基端形成磷酸酯键。大肠杆菌DNA连接酶:DNA聚合酶1催化聚合填充双链DNA的单链间隙后,封闭DNA双链的单链间隙,对DNA复制、修复和重组起作用。辅助基础是NAD。T4连接酶:连接双股DNA分子的粘性末端或扁平末端。需要ATP。(2)去除

5、DNA连接酶,22,(3)碱性磷酸酶,核酸末端的5-磷酸基团。可以有效地防止载体本身的磷酸化,提高重组的效率。23,(4)核酸酶S1,高单链特异性核酸内切酶。功能:单链水解功能,作用于双链核酸分子的单链区域,在单链部分阻断核酸分子,单链区域可能小到只有一对碱基。用于分析核酸杂合分子(RNA-DNA)的结构,在RNA分子中定位,去除DNA片段中突出的单股尾,形成扁平端,打开双链cDNA合成过程中形成的发夹环。24,载体:一些DNA分子,用来表达无性繁殖或有意义的蛋白质,以便携带目的基因。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA,双节基因复制的载体,25,能稳定自主复制,克隆数高。有复制点(外源D

6、NA插入点)牙齿,有多个单酶,通常称为多复制点。具有两种以上的遗传标记物质,便于重组体的筛选和鉴定。分子量小,可以容纳更大的外源DNA。26,穿梭载体:包含原核和真核细胞的复制元素。27,存在于细菌中,独立于染色体,可自行复制的双链环DNA分子。1 .质粒(plasmid),1,克隆载体,2种:严格控制:克隆和宿主之间的繁殖耦合,克隆数量少的李莞控制型:克隆和宿主繁殖不配对,克隆数量多,28种,优点:少量分子量提取,耐受性标记,噬菌体,细菌感染类病毒。噬菌体DNA要包装蛋白质皮并煮熟,才能感染细菌。感染时,噬菌体DNA进入大肠埃希菌,其粘性末端会循环成环状双链DNA。31,野生噬菌体DNA及其

7、噬菌体DNA地图,32,gt系列(插入,插入片6 kb,复制效率,应用于cDNA复制,gt 10代表,EcoR I,仅排在第一位)EMBL系列(替代,插入片BL复制容量,高达40-50kb,构建基因组文库),人工改造噬菌体,33,(2)M13mp噬菌体:DNA改造系统M13在感染宿主菌后,由于细菌体内酶的作用,感染性单链DNA被称为模板复制型(RF DNA)的双链DNA到达特定复制副本后,停止复制,创建并包装大量单链DNA。34,(c)可以满足病毒载体、动物细胞病毒感染、真核DNA重组生物的需要。用于肿瘤和遗传病的研究和治疗。常用病毒矢量:猴子空化病毒(SV40)逆转录病毒(retroviru

8、s)昆虫条病毒腺病毒(Adenovirus,AV)线相关病毒(adeno-associated virus,AAV)包含病毒启动子、铺装层组件、遗传标记和质粒复制起点。,36,2,受体细胞中用于表达(转录和翻译)外源基因的载体。必须具有复制载体的性质。必须具有转换和翻译所需的元素。徐璐必须徐璐为不同的表达系统构建不同的表达载体。1.原核表达载体经常使用大肠埃希菌表达载体。复制载体还包括启动子(TRC启动子、T7噬菌体启动子等)、核糖体结合点(RBS)、转录终止序列等。37,SV40病毒矢量:最终导致宿主细胞死亡,使用受限逆转录病毒矢量:高整合和外源基因表现能力,安全腺病毒矢量考虑:删除所有腺病

9、毒代码基因的第三代基因治疗AVV矢量:小DNA病毒。无致病性,感染效率高,在基因治疗中广泛使用。2 .真核表达载体在复制载体上发展。包括原核生物序列、真核表达调控因素(启动子、增强子、转录终止、加聚A信号序列)、真核细胞的克隆起始序列、真核过滤标记基因等。38,第三个基因克隆的一般过程,分体和目的基因的分离限制内切酶切割载体和目的基因连接的基因序列导入细胞体基因序列克隆的选择性,基本过程,39,基因组DNA文库(基因组DNA文库)2。CDNA库(CDNA库)3 .多酶链反应基因组DNA文库(Genomic DNA library)是一个复制群,它以基因工程的方法包含某个生物基因组DNA的各种片

10、段。基因组DNA片段插入克隆向量,得到的分子克隆的总和。理想基因组文库应包含牙齿气体基因组的所有遗传信息。43、基因组文库技术(引自Griffiths et al.1996)、基因组文库构建、染色体DNA分离、酶切片、与克隆载体的连接、将所有重组DNA分子导入宿主细胞,扩增,形成基因组DNA文库。44,以mRNA为模板,利用逆转录酶合成与mRNA互补的DNA(cDNA),然后复制双链cDNA片段,连接到适当的载体,转移到受体菌,就能得到cDNA文库。构建cDNA库(引自1980年Old Primrose),构建cDNA库,45,获取已知序列基因片段,变性,退火,扩展,灵敏度高,特异性强,生产率高,重复性快,用PCR技术获取目标基因,44目的用酶修饰基因DNA和载体DNA,目的DNA,限制性核酸内切酶,目的基因与矢量连接的过程,51,52,连接粘性末端等限制酶切割部位,连接其他限制性内切酶部位等聚合物尾部连接人工连接连接平端连接,53,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶15C,重组效率和特异性都很好。55,同伦聚合物在端转移酶的作用下,在DNA片段端添加同伦聚合物序列,形成粘性末端,然后连接粘合端。人工连接器(linker)连接在目标基因的平端加上化学合成的一个或多个酶的平端双链和核苷酸片段,然

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