SN∕T 5105-2019 国境口岸轮状病毒（B组）实时荧光RT-PCR检测方法

1、犐 犆犛 犆 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛犖犜 国境口岸轮状病毒（犅组）实时荧光 犚犜 犘犆犚检测方法 犇犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犿犲 狋 犺 狅 犱狅 犳犚狅 狋 犪 狏 犻 狉 狌 狊（犵 狉 狅 狌 狆犅）犫 狔狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿犲犳 犾 狌 狅 狉 犲 狊 犮 犲 狀 犮 犲 犚犜 犘犆犚犪 狋犳 狉 狅 狀 狋 犻 犲 狉狆 狅 狉 狋 狊 发布 实施 中华人民共和国海关总署发 布 前言 本标准按照 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国厦门海关、中华人民共和国深圳海关、 深圳市计

2、量质量检测研究院。 本标准主要起草人：莫秋华、杨坤宇、杨泽、汪海波、史蕾、陈晶、陈新彬、吴锦顺、涂承宁、史咏梅、 杨国武。 犛犖犜 国境口岸轮状病毒（犅组）实时荧光 犚犜 犘犆犚检测方法 范围 本标准规定了国境口岸成人腹泻轮状病毒（组）实时荧光 检测的对象、检测方法及结果 报告。 本标准适用于国境口岸成人腹泻轮状病毒（组）的实验室检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 实验室生物安全通用要求 出入境口岸轮状病毒感染监测规程 临床诊断中聚合酶链反应（）技

3、术的应用 人间传染的病原微生物名录（原中华人民共和国卫生部） 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 轮状病毒狉 狅 狋 犪 狏 犻 狉 狌 狊 属于呼肠孤病毒科（犚犲 狅 狏 犻 狉 犻 犱犪 犲）轮状病毒属（犚狅 狋 犪 狏 犻 狉 狌 狊） ，为双链病毒，基因组分 个节段， 是引起人类、哺乳动物类和鸟类腹泻的主要病原体。轮状病毒有个血清组（） ，其中、组能 引起人和动物腹泻。组轮状病毒最常见，它是婴幼儿腹泻首要的致病原。组轮状病毒感染对象没 有年龄限制，主要感染 岁的青壮年，但也可感染老人和婴幼儿，故又定名为成人腹泻轮状病毒 （ ，） 。 逆转录聚合酶链反应狉 犲 狏 犲 狉 狊 犲狋

4、 狉 犪 狀 狊 犮 狉 犻 狆 狋 犻 狅 狀狆 狅 犾 狔犿犲 狉 犪 狊 犲犮 犺 犪 犻 狀狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀；犚犜 犘犆犚 将的逆转录（）和的聚合酶链式扩增（）相结合的技术。本标准采用一步法逆 转录聚合酶链式反应（ ） 。在一步法 中，首先以为模板，利用下游特异性引物， 在依赖的聚合酶（逆转录酶）的作用下转录合成互补（） ，该步称作“逆转录” ：随 后，再以为模板，利用上游和下游特异性引物，在聚合酶的作用下进行循环扩增；最 终使分子的某个特定区域（目的片段）被扩增达几百万倍。 实时荧光犚犜 犘犆犚狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿犲犳 犾 狌 狅 狉 犲 狊 犮 犲 狀 犮 犲犚

5、犜 犘犆犚 通过荧光染料或荧光标记的特异性荧光探针，对反转录后扩增的产物进行标记跟踪，利用荧 光信号累积实现实时在线监测整个反应过程，结合相应的软件可以对结果进行定性和定量分析。 犛犖犜 本标准所采用的荧光探针是分子信标（ ）探针。分子信标探针是一种荧光标记的寡核 苷酸链，一般含有 个核苷酸。在结构上，分子信标探针可以分为三部分，即环状区、茎干区、荧光 基团和淬灭基团。环状区：一般由 个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；茎干区：寡核苷酸链 两端的核酸序列互补配对形成的个碱基对的双链结构，在分子信标与靶分子结合过程中可 发生可逆性解离；荧光基团和淬灭基团：荧光报告基团（如）一般连接在端，荧光淬灭

6、基团（如 ）一般连接在端。自由状态时的分子信标呈发夹结构，此时由于荧光基团与淬灭基团靠得很 近，荧光被淬灭；当与靶序列结合后，分子信标的空间构型发生改变，使荧光基团与淬灭基团距离变大， 分别位于伸展开的探针的两端，荧光得以恢复。分子信标技术具有很高的特异性，而且操作简便、灵敏 度高，特别是它可以进行实时定量检测，甚至可以用于活体分析。 犆 狋值犆狔 犮 犾 犲狋 犺 狉 犲 狊 犺 狅 犾 犱 在荧光中，每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ：焦碳酸乙二酯（ ） ：聚丙烯酰胺凝胶电泳（ ） ：高效液相色谱（ ） ：碱基对（ ） ： 羧基一荧光

7、素（ ） ：， 二甲氨基偶氮苯 羧酸（， ） 检测对象 国境口岸发现的有呕吐、腹泻和发热等症状， 疑似腹泻病毒感染的急性肠胃炎病人。 其他申请检验的人员。 生物安全和犘犆犚防污染要求 实验室生物安全应符合 和人间传染的病原微生物名录的规定。防污染措施按 的规定执行。 主要仪器 主要仪器设备如下： 二级型生物安全柜； 台式高速冷冻离心机（最高离心力 以上） ； 旋涡振荡器； 冰箱：、 和 ； 超净工作台； 犛犖犜 微型离心机； 荧光定量仪； 电子天平（） ； 微波炉； 电泳仪； 高压灭菌锅； 超纯水器或双蒸水器； 微量可调移液器一套（含以下种规格： 、 、 、 、） 。 主要试剂 无酶的水。 引

8、物和探针： 引物应为以上级别纯化， 探针为纯化，引物和探针序列 见 。 一步法荧光 基础试剂： 宝生物工程（大连）有限公司 （ ） ）。 ）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的 效果，则可使用这些等效产品。 检验程序 样品采集 粪便标本和呕吐物标本的采集按照 执行。 实验室检验 样品处理 取黄豆大小约 的粪便标本或呕吐物，或 水样便，加入 的 生理盐水，剧烈振荡混匀，制成 的悬液：然后， 离心 ；转移上清至灭菌的 干净离心管。不能立即进行检测时，样本冻存于 超低温冰箱备用。 病毒核酸提取 犜 狉 犻 狕 狅 犾法 取处理好的样本 ，加入

9、 液，振荡混匀后室温静置 ，然后加入 三 氯甲烷，盖紧离心管，振荡混匀 后室温静置 ， 离心 ，取上层水相至另一 离心管中，加入等量异丙醇沉淀，充分混匀后室温放置 ， 离心 ，弃上清液， 再加入的 乙醇洗涤一次， 离心 ，弃上清液，室温放置 后加入 水（或其它核酸溶解液）溶解核酸沉淀，分装后于 条件下保存，备用。 试剂盒提取纯化核酸法 按适用于病毒基因组提取的商品试剂盒说明书操作。 犛犖犜 实时荧光犚犜 犘犆犚检测 引物和探针 引物应用液浓度配制成 。探针应用液浓度配制成 ，探针的和端分别用 和 标记。 引物和探针的序列见表。 表轮状病毒（犅组）实时荧光犚犜 犘犆犚检测引物和探针 引物探针名称

10、序列（ ）扩增片段 注：简并碱基中为或，为或或。 注：下划线碱基是形成分子信标探针茎干区的部分。 注：等效的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。 阳性对照和空白对照设置 检测过程中分别设阳性对照和空白对照。阳性对照为成人腹泻轮状病毒（组）阳性样本核酸，或 者为克隆轮状病毒（组）的部分核苷酸序列（必须包含扩增区域在内）在体外转录合成的，序列见 附录；空白对照用无菌水。 反应体系组成 一步法实时荧光 反应体系采用以下参数： （含和 等） ；引物 ；引物 ；探针 ； ； （） ； ； 模板 ；加水补足至 。样本在加入前可以在 热处理 后再置冰上骤冷 。 反应条件 一步法实时荧光 反应条件

11、： 反转录 ； 预变性 ； 变性， 退 火 ， 延伸 ， 个循环；选择通道于 退火时收集荧光信号；设置通道为参 比通道。不同实验室可根据所使用的试剂和仪器参考上述反应条件作适当调整。 检验结果判断及报告 在实时荧光 实验中，若阳性对照有明显的荧光增幅现象，且 值在预期的范围之内 （ ） ；空白对照无荧光增幅现象，则表明反应体系运行正常，可以进行结果判定，否则，试验视为无效， 需重新试验。 当同时进行的阳性对照和空白对照试验结果正常，本方法检验结果判定及报告如下： 检测样品有明显的荧光增幅曲线，且 值 时，判为阳性，报告“检出成人腹泻轮状病毒（ 组）特异性基因（实时荧光法） ” ； 检测样品荧光增幅曲线的 值介于 和 之间时，建议采用浓缩方式处理核酸样本，再重 犛犖犜 新进行实时荧光 检测。若重新检测的 值仍介于 和 之间，且曲线有明显的对 数增长期，判为阳性，报告“检出成人腹泻轮状病毒（组）特异性基因（实时荧光 法） ” ，此类样本建议用其他方法进一步验证；否则判为阴性，报告“未