SN∕T 5109-2019 国境口岸鼠疫耶尔森菌聚合酶螺旋恒温扩增检测方法

1、犐 犆犛 犆 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛犖犜 国境口岸鼠疫耶尔森菌聚合酶螺旋 恒温扩增检测方法 犘 狅 犾 狔犿犲 狉 犪 狊 犲狊 狆 犻 狉 犪 犾犻 狊 狅 狋 犺 犲 狉犿犪 犾狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀犿犲 狋 犺 狅 犱 犳 狅 狉犢犲 狉 狊 犻 狀 犻 犪狆 犲 狊 狋 犻 狊犪 狋犳 狉 狅 狀 狋 犻 犲 狉狆 狅 狉 狋 狊 发布 实施 中华人民共和国海关总署发 布 前言 本标准根据 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国满洲里海关、中华人民共和国福州海 关、中国人民解放军疾病

2、预防控制研究所。 本标准主要起草人：张晓龙、高艳菲、郭文秀、王静、黄恩炯、刘威、慈颖、刘丽娟、杨宇、黄留玉。 犛犖犜 国境口岸鼠疫耶尔森菌聚合酶螺旋 恒温扩增检测方法 范围 本标准规定了国境口岸检测鼠疫耶尔森菌聚合酶螺旋恒温扩增（）法，包括样本前处理、检测程 序、方法、结果判定及报告。 本标准适用于国境口岸鼠疫耶尔森菌疑似感染样本、啮齿动物、蚤等样本中鼠疫耶尔森菌的筛选 检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 实验室生物安全通用要求 微生物和生物医学实

3、验室生物安全通用准则 人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部） 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 鼠疫耶尔森菌犢 犲 狉 狊 犻 狀 犻 犪狆 犲 狊 狋 犻 狊 分类上属原生生物界，原核细胞型微生物，革兰氏阴性兼性厌氧菌类，肠杆菌科，耶尔森菌属，假结 核耶尔森菌鼠疫亚种（犢狆 狊 犲 狌犱 狅 狋 狌 犫 犲 狉 犮 狌 犾 狅 狊 犻 狊狆 犲 狊 狋 犻 狊） 。鼠疫的病原菌，能够引发腺鼠疫、败血型鼠疫和 肺鼠疫，是生物战剂和生物恐怖的重要病原菌之一。 抗原是目前公认的鼠疫菌种特异性抗原之一， 其 基因常作为鼠疫菌核酸检测的靶标。 聚合酶螺旋恒温扩增反应狆 狅 犾 狔犿犲

4、 狉 犪 狊 犲狊 狆 犻 狉 犪 犾犻 狊 狅 狋 犺 犲 狉犿犪 犾狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀（犘犛犚） 一种核酸恒温扩增方法，利用条条引物来特异性识别目标片段的个个独立区域，在 犅 狊 狋聚合酶的链置换作用下，短时内扩增靶序列，形成螺旋扩增。大量合成目标的同时，伴 随有 的大幅下降，加入 指示剂，可通过观察颜色变化判定结果；也可以加入荧光染料（例如： ） ，通过荧光仪上的扩增曲线和溶解曲线来判定结果。 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ：聚合酶螺旋恒温扩增反应（ ） 犛犖犜 ：脱氧核糖核酸（ ） ：脱氧核糖核苷三磷酸（ ） 犅 狊 狋酶：犅 狊 狋聚合酶（大片段） （ （ ） ） 检

5、测对象 检测对象包括： 国境口岸出现的不明样本和环境样本； 啮齿动物及寄生蚤、洞干蚤等样本； 国境口岸来自鼠疫疫区的有症状或其他不能排除鼠疫耶尔森菌感染的人员样本。 生物安全要求 实验过程中生物安全要求如下： 检测工作中按 和 中相关要求做好个体防护； 应遵循人间传染的病原微生物名录中的生物安全要求进行，鼠疫菌核酸检测应在生物安全 二级（ ）实验室； 应遵循 对废弃物的处理要求对废弃物品进行处理。 主要仪器与试剂 主要仪器 主要仪器设备如下： 荧光仪；或核酸扩增仪；或恒温扩增检测仪；或金属浴；或水浴锅： ； 。 主要试剂 使用的主要试剂如下： 多功能样品处理液：含 ， 的缓冲液（ ， ）（具体

6、配制方法参见附录） ； 鼠疫菌螺旋恒温扩增快速检测试剂盒：包括核酸免提取试剂（多功能样品处理管，含多功能样 品处理液） ，鼠疫菌一滴法现场检测试剂盒（具体方法参见附录） ，鼠疫菌实时荧光 检测试剂盒（具体方法参见附录） ； 注，：试剂、由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果 其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 引物：以鼠疫菌 基因保守序列设计（ 号： 的）引物组，组成如下： ： ： ： ：四种核苷酸，每种浓度均为 ； 犅 狊 狋酶：； 犛犖犜 反应缓冲液（） ： ，硫酸铵 ，氯化钾 ，硫酸镁 ， ，甜菜碱 ，（每种各） ，引物、各 ，

7、 ， ； 显色液：甲酚红 ，苯酚红 。或荧光染料： （ 水溶液） 。二者选一； 阳性对照：可溯源的已鉴定菌株，或含目的片段的。 检测程序 样本前处理 白色粉末、物体表面等环境样本 以无菌生理盐水或多功能样品处理液浸湿无菌采样棉签，沾取白色粉末，或擦拭受污物体表面，置 于含多功能样品处理液的试管内，油性笔编号标记待检。 啮齿动物脏器样本 以无菌操作采取的肝、脾、肺、心血及有可疑病理改变的淋巴结等组织，加入滴滴（约 ）研磨液（生理盐水或多功能样品处理液）研磨。用采样棉签沾取研磨匀浆液（约 ） ，置于含多功能样品处理液的试管内，油性笔编号标记待检。 蚤样本 蚤经种类鉴定后，以采集时间、地点、种类分组

8、， 只 只为一组待检样本。待检样本加入 滴滴（约 ）研磨液（生理盐水或多功能样品处理液）研磨。用采样棉签沾取研磨匀 浆液（约 ） ，置于含多功能样品处理液的试管内，油性笔编号标记待检。 人体样本 可包括人静脉血、淋巴液、带血痰液、带血粪便、咽部分泌物、眼分泌物、水泡脓泡液、脑脊液、溃疡 面和痂皮下的创面等。无菌采集的待检者的静脉血，室温静置数 使血液凝固，上层为 血清。用采样棉签沾取血清、淋巴液、带血痰液、分泌物或固体排泄物，置于含多功能样品处理液 的试管内，油性笔编号标记待检。 鼠疫耶尔森菌的犘犛犚检测 样本处理与模板制备 将采样棉签置于含多功能样品处理液的试管内，摇动混匀后，置于恒温扩增检

9、测仪（或金属 浴、水浴锅） ， 加热 。取出?至室温后即可作为样本模板。 犘犛犚反应体系及加样 鼠疫耶尔森菌反应的结果判定可选用显色法，也可选择荧光染料法，其反应体系及加样量分 别见表和表。设阳性、阴性对照检测。 犛犖犜 表鼠疫耶尔森菌犘犛犚反应体系（显色法） 组分工作液浓度反应体系终浓度 加样量 （ 体系） 引物、混合液 引物 液 犅 狊 狋酶 甲酚红 苯酚红 模板阴性对照阳性对照 表鼠疫耶尔森菌犘犛犚反应体系（荧光染料法） 组分工作液浓度反应体系终浓度 加样量 （ 体系） 引物、混合液 引物 液 犅 狊 狋酶 模板阴性对照阳性对照 扩增 显色法：将反应管置于核酸扩增仪（或恒温扩增检测仪、金

10、属浴、水浴锅、加热模块） ， 恒温反应 。 荧光染料法：将反应管置于荧光定量仪，程序设置见表。 表鼠疫耶尔森菌荧光犘犛犚反应程序 阶段循环温度时间内容荧光采集 反应 延伸是 溶解曲线分析 质量控制 显色法有效实验应同时满足如下条件： 阴性对照颜色仍为粉红色； 犛犖犜 阳性对照颜色变为黄色。 荧光染料法有效实验应同时满足如下条件： 阳性对照在反应阶段出现型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰； 阴性对照在反应阶段无扩增曲线，且溶解曲线无峰出现。 结果判定 显色法，待反应管冷却至室温后观察结果， 根据以下条件进行结果判定： 阳性结果：待检样本反应管液体呈黄色，表示检出鼠疫耶尔森菌核酸，该样本检测结果为初筛

11、 阳性； 阴性结果：待检样本反应管液体呈粉红色，表示未检出鼠疫耶尔森菌核酸，可报告快速检测结 果阴性。 荧光染料法，根据以下条件进行结果判定： 阳性结果：样本在反应阶段出现型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰，并与阳性对照单一峰位 置接近（变化范围在之内） 阴性结果：样本在反应阶段无扩增曲线，且溶解曲线无峰出现。 聚合酶螺旋恒温扩增检测方法初筛阳性的样本需进一步采用其他检测方法确认。 犛犖犜 附录犃 （资料性附录） 溶 液 配 制 犃 样本综合处理液的配制 取 （ ）和 溶于 缓冲液（ ， ）中制成 裂解液，即为样本综合处理液。可保存使用一年。 犃 反应混合液（犚犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀犕犻 狓

12、狋 狌 狉 犲， 犚犕）的配制 犃 溶液 犚犕狆 狉 犲的配制 取 硫酸铵， 氯化钾， 七水硫酸镁， 吐温 于 容量瓶中，充分溶 解，用溶液调节 至 ，定容到 ，保存，可存放一年。 犃 甜菜碱溶液（ 犵犿犔）配制 取 甜菜碱于 容量瓶中，充分溶解并定容到 ，保存，可存放一年。 犃 溶液犚犕的配制 的反应混合液应避免反复冻融，故一般配成的小体系。吸取 的 于 离心管中，加入 的 溶液（ ， ） ， 甜菜碱溶液（ ） ， 加入 去离子水补齐至，于 保存，可存放一年。 犃 引物混合液的配制 将合成的上下游引物粉末用纯水稀释至 ，并将两种引物等体积混合，记为（ ， 引物混合液） 。 犃 显色液的配制

13、称取 甲酚红（ ，美国）与 苯酚红（ ，美国） ，溶于 纯水中，此时 甲酚红与苯酚红的摩尔浓度分别为 和 。可存放一年。使用时，取该显色液于 反应体系中。 犛犖犜 附录犅 （资料性附录） 参照鼠疫菌螺旋恒温扩增一滴法现场检测试剂盒 犅 样本处理 犅 白色粉末、物体表面等环境样本 用无菌生理盐水或多功能样品处理液浸湿无菌采样棉签，沾取白色粉末，或擦拭受污物体表面，置 于多功能样品处理管内，油性笔编号标记待检。 犅 人体样本 可包括静脉血、淋巴液、带血痰液、带血粪便、咽部分泌物、眼分泌物、水泡胞泡液、脑脊液、溃疡面 和痂皮下的分泌物。 无菌采集的疑似感染者静脉血，室温静置数分钟使血液凝固，上层为血

14、清。用采样棉 签沾取血清或淋巴液或带血痰液、分泌物或固体排泄物，置于多功能样品处理管内，折断棉签杆将多功 能样品处理管盖紧后，油性笔编号标记。尽量即刻检测。 犅 蚤样本 蚤经种类鉴定后，以采集时间、地点、种类分组， 只 只为一组待检样本。待检样本加入 滴滴（约 ）研磨液（无菌生理盐水或多功能样品处理液）研磨。用采样棉签沾取研 磨匀浆液（约 ） ，置于多功能样品处理管内，混匀后，置于智能恒温检测仪裂解区，点击加 热裂解键， 后取出，待检。 犅 鼠疫耶尔森菌一滴法犘犛犚恒温现场检测 犅 加样及阳性、阴性对照检测 犅 阳性、阴性对照检测 取出鼠疫耶尔森菌恒温现场检测试剂盒，分别打开阳性（黄色管）和阴

15、性对照管（蓝色管） ，从 多功能样品处理管挤出干净的裂解液，分别加入滴到阳性和阴性管管盖上，加入裂解液后会发现管盖 液体变为红色，然后扣上管盖，倒置待检。 犅 样本检测 处理完样本后，打开检测管（粉红色） ，将经过多功能样品处理管处理过的样本模板滴加滴至检测 管管盖，加入滴裂解液后会发现管盖液体变为粉红色，扣上管盖，倒置约 。 分别拿起反应管、阳性对照管、阴性对照管，将管盖上的液体用力甩至反应管内。 犅 扩增反应 将反应管置于智能恒温检测仪，点击扩增键， 后看到封闭剂融化，拿出反应管迅速甩动两下， 让反应液充分混合，会观察到红色液滴和底部反应液混合，然后再置于恒温装置，听到提示音反应结束， 取

16、出。 犛犖犜 反应过程中切勿开盖。 犅 结果观察与分析 待反应管冷却至室温，肉眼观察。在阴性对照管颜色为粉红色，阳性对照管颜色变为黄色的条件 下，检测管变为黄色表示待测样本中存在鼠疫耶尔森菌基因（阳性） ；检测管颜色为粉红色，表示待测样 本中不存在鼠疫耶尔森菌基因（阴性） 。 恒温现场结果阳性的样本可进一步采用其他相应的方法确认。 犛犖犜 附录犆 （资料性附录） 参照鼠疫菌螺旋恒温扩增快检试剂盒（实时荧光犘犛犚法） 犆 样本处理 环境样本：棉棒沾取粉末于多功能样品处理管中，充分混匀； 动物材料：用研磨杵研碎，棉棒沾取匀浆移于多功能样品处理管中，充分混匀； 细菌：棉棒沾取细菌菌落或菌悬液于多功能

17、样品处理管中，充分混匀。 犆 模板制备 待反应的多功能样品处理管置于智能恒温检测仪裂解区，点击加热裂解键；或者置于水浴锅中 ，热裂解 后取出。上清转移至新的离心管，或 保存待检，或直接用于 扩增。 犆 鼠疫菌实时荧光犘犛犚检测 犆 建立 反应体系，见表 。 表犆 犚犲 犪 犾 犜 犻 犿犲犘犛犚反应体系 组成成分添加量 反应液（） 样本量阳性对照 超纯水补齐至 将上述组分滴加至管盖，静置 充分溶解管盖玻化物，然后将所有液体甩至管底，打开管 盖滴加封闭液滴，盖上管盖，短暂离心。 犆 建立 反应程序，见表 。 表犆 犚犲 犪 犾 犜 犻 犿犲犘犛犚反应程序 阶段循环温度时间内容荧光采集 反应 延伸是 溶解曲线分析 将反应管置