SN∕T 5119-2019 进出口食用动物中新霉素药物残留测定 酶联免疫吸附法和液相色谱-质谱∕质谱法_第1页
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文档简介

1、犐 犆犛 犅 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛犖犜 进出口食用动物中新霉素药物残留测定 酶联免疫吸附法和液相色谱质谱质谱法 犇犲 狋 犲 狉犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狀 犲 狅犿狔 犮 犻 狀狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊犻 狀犲 犱 犻 犫 犾 犲犪 狀 犻 犿犪 犾犳 狅 狉犻 犿狆 狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋 犈犔 犐 犛犃犪 狀 犱犔犆 犕犛犕犛 发布 实施 中华人民共和国海关总署发 布 前言 本标准按照 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利,本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准

2、主要起草单位:中华人民共和国青岛海关。 本标准主要起草人:孙明君、邱芳、张金玲、郑小龙、张晓文、梁成珠、孙涛、岳志芹、朱来华、王群。 犛犖犜 进出口食用动物中新霉素药物残留测定 酶联免疫吸附法和液相色谱质谱质谱法 范围 本标准规定了进出口食用动物的血浆、尿液中新霉素残留的酶联免疫吸附测定方法和液相色谱质 谱联用测定方法。 本标准适用于进出口食用动物猪、牛、羊血液及尿液中新霉素残留量的快速检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验

3、方法 第一方法酶联免疫吸附法 原理 基于竞争性酶联免疫反应,含有新霉素的抗原包被于微孔板上。药物分析时,样品同特异性一抗共 同被添加到板孔中。如果样品中含有药物,会竞争一抗,抑制抗体与板上包被的药物抗原结合。加入酶 标记二抗,形成包被抗原抗体酶标二抗复合物。加入底物后,产物的颜色强弱与样品中药物的浓度成 反比。 试剂与材料 水: 中规定的二级水 碳二亚胺:分析级 卵清蛋白 牛血清白蛋白 透析袋 包被缓冲液 洗涤缓冲液 封闭缓冲液 稀释缓冲液 样品提取液 辣根过氧化物酶标记偶联物稀释液 底物液 显色剂液 犛犖犜 终止液 抗体 偶联物 包被卵清蛋白偶联新霉素的聚苯乙烯微量 孔反应板 标准品:硫酸新

4、霉素,纯度 。 标准品贮备液:准确称取标准品,折合成目标化合物 , 用适量水溶解,并用水定容至 ,混匀。 以下避光保存,有效期为 个月。 标准品中间液:用水稀释标准储备液至 ,以下避光保存,有效期为个月。 标准品工作液:用稀释缓冲液稀释标准中间液至工作浓度 、 、 、 、 ,现用现配。 注:试剂与材料所涉及各种液体配制详见附录 仪器和设备 分析天平,感量 。 酶标仪,带有 滤光片。 离心机:转数 。 超声波发生器。 微量移液器:单道 、 、 和多道 。 酸度计: 测量范围 。 涡旋式混合器。 振荡器。 测定步骤 试样制备与保存 试样制备 分别采集动物血液 于含有肝素钠的抗凝试管中、新鲜尿液 装

5、入洁净容器内,各分成 两等份,作为试样密封并标明标记。在制样操作过程中,应防止样品受到污染或发生残留物含量的 变化。 试样保存 试样置于下可保存 天;若长期保存,需将试样置于 以下。 提取 取 样品,加 样品提取液,混匀, 离心 ,上清液用于检测。 酶联免疫测定 根据待测样品数量和标准样品(每个样品个平行) , 决定微孔的使用量。 每孔加入 含有卵清蛋白偶联新霉素抗原包被板过夜。 将微孔内液体垂直倒掉,加入 洗涤缓冲液, 轻轻晃动后垂直倒掉,再重复洗涤微孔次, 在滤纸上用力垂直磕掉残留在壁上的液体。 犛犖犜 每孔加 牛血清白蛋白, 封闭小时。 操作同 。 每个微孔中加入 标准溶液或待测样品溶液

6、。 在每个微孔中加入 辣根酶标记物和 抗体, 混匀。 室温( )避光孵育 。 操作同 。 每个微孔加入 底物液和 显色剂液,充分混合并在室温( )暗处孵育 。 加入 的终止液终止反应,充分混合后 内于 处测量吸光度值。 空白试验 除不加试样外,均按 测定步骤进行。 质控试验 每次测定均应做一个用空白样品添加药物混合标样的质控样品,添加浓度应为相应产品的检测 低限。 结果计算 标准曲线的绘制 将个浓度的标准溶液( 、 、 、 、 、 )和待测 溶液按限量法测定步骤测定得相应的吸光度值。以浓度的吸光度值为分母,其他标准浓度的吸 光度值为分子的比值,再乘以 ,获得吸光度的百分比。以此吸光度百分比为纵

7、坐标,对应的个 标准浓度为横坐标,在半对数坐标上绘制标准曲线。该定标模型在 范围内是线 性的。 百分吸光度值的计算 按式()计算百分吸光度值: 百分吸光度值样品 () 样品 样品孔的平均吸光度值; 零标准的平均吸光度值。 待测溶液中目标物含量的计算 将样本的百分吸光度值代入标准曲线中,从标准曲线上得到相应的药物浓度( ) ,按式()计 算血浆和尿液中新霉素药物的残留量。 () 式中: 试样中药物残留量,单位为微克升( ) ; 从标准曲线中得到的试样中药物含量,单位为微克升( ) ; 试样稀释倍数; 计算结果保留三位有效数字。阳性结果需要经过 方法进行确认。 犛犖犜 方法性能指标 灵敏度 本方法

8、在检测猪、牛、羊的血液和尿液样本中检测限为 。 回收率 本方法在 添加浓度水平上的回收率为 。 精密度 对于定量分析,每个试样最少应取两份平行样进行分析。在重复性条件下获得的两次独立测定结 果的绝对差值不得超过算术平均值的 。 注:可使用经合格评定的等效的商品化 试剂盒检测。 第二方法液相色谱串联质谱方法 试剂材料 水: 规定的一级水。 甲醇:色谱级。 乙腈:色谱级。 磷酸:优级纯。 甲酸:色谱级。 甲酸铵:色谱级。 庚烷磺酸钠:色谱纯。 磷酸三钠:分析纯。 提取液:磷酸盐缓冲液(含 庚烷磺酸钠、 磷酸三钠) ,磷酸调 。 提取液:磷酸盐缓冲液(含 庚烷磺酸钠、 磷酸三钠) 。 柱: 。 仪器

9、和设备 液相色谱质谱串联仪:配有电喷雾离子源, 公司。 均质器: ,公司。 涡旋混匀器。 计: ,梅特勒。 高速冷冻离心机: 。 固相萃取仪:带正压空气泵,公司。 移液枪: 、 、 、 。 犛犖犜 测定步骤 提取 按照 制备样品,从中取 至 离心管中,加入 提取液( ) ,混匀震荡 、 离心 ,上清液至另一新的 离心管中,加入 正已烷,振荡混匀 , 离心 ,弃去上层液体,准确移取下层提取液 至一新的 离心管中,用提取 液( )调节 ,待过柱净化。 净化 柱净化,提前用甲醇、水预柱,调节好 的提取液加贮液器中以小于等于 的流速通过 柱,待液体完全流出后,用水淋洗小柱,弃去所有流出液,正压吹干,最

10、后用 甲醇洗脱,收集洗脱液至 聚四氟乙烯圆底离心管, 水浴氮气吹干, 流动相定溶 过 滤膜至进样小瓶,供高效液相色谱串联质谱仪测定。 测定 液相色谱条件 色谱柱: , : 。 流动相:有机相:乙腈;水相:甲酸水溶液(含 甲酸铵)梯度洗脱条件参见附 录。 流速: 。 柱温: 。 进样量: 。 质谱条件 离子化模式:电喷雾电离正离子模式( ) 。 质谱扫描方式:多反应监测()谱图参见附录。 分辨率:单位分辨率。 其他质谱条件参参见附录。 定性测定 被测组分选择个母离子,个以上子离子,在相同实验条件下,样品中待测物质的保留时间与基 标准溶液的保留时间偏差在之内;且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度

11、接近的基质标准工 作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较,偏差不超过表规定的范围,则可判定为样品中存在对 应的待测物。 表定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 允许的相对偏差 定量测定 在仪器最佳条件下,对基质标准工作溶液进样,以峰面积为纵坐标,基质标准工作溶液浓度为横坐 犛犖犜 标绘制标准工作曲线,用标准曲线定量。 空白试验 除不加试样外,均按上述操作步骤进行。 结果计算与表述 外标法定量,试样中被测组分残留量按式()计算: 犡犆犞 () 犡 试样中被测组分残留量,单位为微克每千克, ; 犮 从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度,单位为纳克每毫升, ; 犞 试样溶液定容体积,

12、单位为毫升,; 试样溶液所代表的质量,单位为克,; 注:计算结果应扣除空白值。 测定低限、回收率和精密度 测定低限 本方法对新霉素的测定低限为 。 回收率和精密度 尿液、血液中新霉素的回收率为 。 非商业性声明:本标准文本中所用仪器型号仅为提供参考,并不涉及商业目的,鼓励标准的使用者 尝试使用不同的厂家或型号的仪器。 犛犖犜 附录犃 (资料性附录) 酶联免疫检测试剂的配制 犃 的氢氧化钠溶液:称取 氢氧化钠,用容量瓶定容,溶解。 犃 磷酸二氢钠缓冲液( ) :取磷酸二氢钠() ,加水适量使 成 后,用磷酸调 至 。 犃 碳酸盐包被缓冲液( ) :称取 、 ,加水定容至 ,溶解后置于冰箱保存。 犃 稀释缓冲液 : ,吐温 ( ) ,混匀。 犃 封闭缓冲液溶液: , 加 牛血清白蛋白,溶解混匀。 犃 洗涤缓冲液:含 磷酸钠缓冲液,加入 吐温 。 犃 辣根过氧化物酶标记偶联物稀释液: 含 磷酸钠缓冲液,加入 吐温 ,牛血清白蛋白。 犃 底物液:过氧化氢,浓度为 。 犃 显色剂液:用 乙酸钠柠檬酸缓冲液配制 的四甲基联苯胺溶液。 犃 终止液: 硫酸溶液。 犃 三个试剂的说明: 样品提取液为美国 提供、 抗体为绵羊源新霉素多抗、 偶联物为驴抗绵羊二抗。 犛犖犜 附录犅 (资料性附录) 液相色谱的梯度洗脱条件 步骤运行时间(

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