农产品分析(蛋白质测定)-3-1.ppt

1、第1，5章蛋白质测定，第2，蛋白质测定方法，pro测定方法主要分为两类茄子。一种是利用pro的共性，即氮量、钚链和折射率来测量pro含量。另一种是利用蛋白质中特定的氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香烃测定pro含量。蛋白质是用k氏法测定的，其中有氨基酸、乙酰氨等非蛋白氮，因此被称为“粗蛋白”，在重金属盐等沉淀分离后进行全氮测定，从氮转化的蛋白质含量被称为“纯蛋白”。3，测定蛋白质最常用的方法是凯氏正氮法凯氏正氮法。目的测定样品中总氮含量，并乘以相应的蛋白质系数，求出蛋白质的含量。通过人们的长期应用和持续改善，凯氏氮法演变成了常数法、微量法、半微量法、凯氏法、自动氮法等。4，优点：应用范围广，灵敏度

2、高，回收率好，不需要昂贵的设备。缺点：操作需要很长时间(自动凯氏氮法除外)，单个消化过程通常需要23h，高脂、高蛋白样品消化需要5h以上。操作过程中可能会产生大量有害气体。5，为了满足对生产单位工艺过程的快速控制分析，环境污染和操作简便，节省了时间。之后，在凯氏氮法的基础上，陆续出现了水杨酸比色法、双轴法、水合茚三酮、染料结合法、紫外线分光光度法、折射法、选矿法、近红外光谱法、近红外光谱法、凯氏小额液中测定铵的靛蓝酚蓝法和铅法。6，重点介绍了凯西正氮法、染料结合法、双轴法三种茄子方法。氨基酸测量的主要方法是利用氨基酸自动分析仪、茚三酮、染料结合法、乙醛酸法、荧光法等。重点介绍氨基酸自动分析仪法

3、测定前氨基酸、染料结合法测定赖氨酸和乙醛酸法测定色氨酸。7，粗蛋白质的测定，凯斯正氮法是1883年丹麦人凯达尔牙齿发明的，当时凯只使用H2SO4分解样品，定量谷物中的蛋白质。他只知道用H2SO4分解样品，不能说明H2SO4分解有机氮化合物生成氨的反应过程。之后被Gunning改善了。他消化的时候加了K2SO4，上升沸点，提高分解速度。温度原来从硫酸的沸点330上升到400，所以速度也加快了，凯氏氮法现在还在使用。8，优点：应用范围广，灵敏度高，回收率好，不需要昂贵的设备。缺点：操作需要很长时间(自动凯氏氮法除外)，单个消化过程通常需要23 h，高脂，高蛋白样品消化需要5 h以上。操作过程中可能

4、会产生大量有害气体。9，我们在农产品中检查pro时，经常测量总氮量，然后乘以pro会计系数，得到蛋白质含量。实际上，包括氨基酸、酰氨、核酸、生物碱、含氮脂肪、卟啉、含氮颜料等非白质氮化合物，因此被称为粗糙pro。蛋白质通过重金属盐等沉淀分离后，经过全氮测定，转换成氮的蛋白质的含量称为“纯蛋白”。10，(a)方法原理，氮是蛋白质的主要成分。相同植物蛋白的氮含量基本固定。因此，测量的氮值乘以转换系数，就可以得到蛋白质含量。11，样品与硫酸和催化剂一起加热，然后消化，分解蛋白质。其中碳和氢分别氧化，二氧化碳、水排出，有机氮转化为氨后，与硫酸相结合，在硫酸铵、碱性条件下蒸馏，使氨有利，吸收为硼酸后，用

5、硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸消耗量乘以转换系数，即可获得蛋白质含量。牙齿过程的反应方程式如下所示：12，消化：2 NH 2(CH2)2 COO h13h 2 so 4(NH4)2 so 4 6 co 2 12 so 2 16 H2O蒸馏：(NH4)2 so 4 2 NaOH 2 NH 3 Na2 so 4 22 so 4添加硫酸钾可以提高溶液的沸点，加速有机物分解。因为与硫酸作用一起生成硫酸氢钾可以提高反应温度。但是其添加量不能太大。否则，消化温度太高，产生的铵盐热解会释放氨，造成损失。14，(2)操作步骤，1，蛋白质沉淀2，蛋白质去除3，氮测定，15，样品(0.5毫米)，沸水，30分钟，1

6、，蛋白质沉淀去除，30 。18，(C)各种试剂作用：富集H2SO4: a:脱水碳化有机物，然后用有机物碳化生成碳，碳将H2SO4还原为SO2，其本身由CO2 B:氧化C: PRO和富集H2SO4生成NH3。Cu2SO4是红色沉淀。c完全消化后，反应停止，红色消失，变成蓝色。即消化完全，蓝色是CuSO4的颜色。20，3，碳粉和过氧化氢，氧化汞都是催化剂，但考虑到效果，价钱，环境污染等，普通硫酸铜。4.在NaOH的作用碱性条件下蒸馏，使氨有利。21，5，K2SO4的作用(沸点增加)沸点从330提高到400，加速反应过程，加速有机物的分解。22，(4)适用范围，凯氏正氮法适用于各种农产品的蛋白质测定

7、。最小检出量相当于0.05毫克氮，0.3毫克蛋白质。用牙齿方法测定的结果是粗蛋白质含量，23，(5)注意事项，蛋白质沉淀剂通常是碱性硫酸铜，得到得快，牧草，根块茎作物：碱性乙酸铅是沉淀剂。谷物及油料作物：碱性醋酸铅在沉淀蛋白质时产生难以沉淀的混浊物，因此很难准确确定沉淀的完整终点，因此采用较少。下一页，24，(5)注意事项，1，样品必须均匀。如果固体样品需要事先仔细研究，则应均匀混合液体样品。2、将样品放入凯氏烧瓶时，不要贴在瓶颈上，如果可粘合的少量水慢慢冲洗，检查的样品要不完全消化，结果低。25，3，在消化过程中，凯西烧瓶应随时转动，利用冷凝液冲洗瓶壁上的固体残渣，促进消化。4.消化时如果不

8、容易变成透明溶液，在克氏烧瓶冷却后加入30%过氧化氢催化剂2-3毫升，促进氧化。26，5，在整个消化过程中，不要使用强火，不要温和煮沸，将火力集中在凯西烧瓶底部，如果墙上的蛋白质没有硫酸，就不要失去氮。6.如果硫酸不足，硫酸钾过多会导致氨的损失，此时不与氨作用，形成硫酸钾，所以如果硫酸太少，就会消耗底物，或者样品中脂肪太高，就要添加硫酸量。27，7，混合指示剂在碱性溶液中为绿色，在中性溶液中为灰色，在酸性溶液中为红色，没有溴甲酚绿色，只能单独使用0.1%甲醛红乙醇溶液。8.氨是否完全蒸馏，pH试纸确认蒸馏液是否是碱性的。，28，9，蒸馏瓶中加入浓碱，经常出现褐色沉淀物。此时，分解促进剂和添加的

9、硫酸铜反应产生氢氧化铜，加热后分解生成氧化铜的沉淀，有时Cu离子和氨作用产生浓蓝色复合物。10，所有试剂溶液应用不含氮的蒸馏水。29，11，消化药绿色后继续消化30分钟即可。但是，尤其是氨难化的氮化合物样品(如赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸等)，要适当延长消化时间。有机物完全分解后，消化液在含有大量蓝色或淡绿色、铁时呈深绿色。30，12，如果样品中含有大量脂肪或糖，消化过程中容易产生大量泡沫杨怡，为了防止泡沫溢出瓶外，开始消化时首先要低温消化，随时摇晃。或者添加少量辛醇、液体石蜡或硅油消泡剂，注意调节热源强度。31，13，样品杨怡大，例如，如果干样品数超过5克，可以按每克15毫升的比率

10、增加硫酸用量。14.蒸馏时添加氢氧化钠溶液必须小心，蒸馏装置漏气后渡边杏。15.碱添加量足够(反应室液体为深蓝色或褐色)，碱液污染了凝固管，不能生病。32，16，硼酸吸收液的温度超过40渡边杏。否则氨的吸收作用会减弱，造成损失，此时可以放入冷水浴。此外，凝固管底部的硼酸液面太深，一般插入约0.5厘米，可以渡边杏。这样，如果发生反吸现象，硼酸液就不会吸入反应室。17、蒸馏完成后，首先要将冷凝管底部从液体表面清洗喷嘴抬起，然后蒸lmin，关闭热源。否则，吸收液可能反吸。33，18，一般样品中含有另一种氮物质，测定的蛋白质是粗蛋白质。要测定样品的“纯蛋白质”，可以将氢氧化铜、碱性醋酸铅、20-25单

11、宁、10-12三氯乙酸溶液等蛋白质沉淀剂放入样品中，将蛋白质在水溶液中沉淀，然后测定牙齿沉淀的总氮量，乘以蛋白质的转换系数，得到“纯蛋白质”。34，19，蒸馏时蒸汽发生要均匀，充分，蒸馏时停火渡边杏。否则会发生逆向吸入。20、样品的大小量取决于样品中氮的含量。如果氮含量为1.05.0，样本杨怡为0.30g，则可以根据氮含量水平相应地增加或减少样本量。样品量不到0.1g时渡边杏，如果样品中氮量高，可以定量使用煮沸的溶液，部分可以用于蒸馏、滴定。35，21，废液排除和清洗。22、将氮转化为蛋白质系数。蛋白质的氮含量一般为1517.6，16乘以6.25就是蛋白质的质量。不同食物的蛋白质转换系数不同。

12、36，37，检验实验将已知的NH4 -N标准溶液(包括100mg/LNH4 -N标准溶液10ml、N1mg)放入半微量氮蒸馏装置中，按照样品测定等操作步骤进行蒸馏、滴定，进行蒸馏过程的误差大小检查。指示剂的添加量仍为2(v/v)，38，硼酸的浓度可以根据样品中氮的含量调节2-5。测量两种蛋白质的平行结果为15以下，相对误差不能大于3，1530点2，30以上1。参见其他土壤全氮的测定，例如催化剂仍然使用1.85g。39，2，同种种子中蛋白质的测定(染料结合DBC法)，(1)方法原理蛋白质中碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)的NH2，咪唑和胍(赖氨酸-NH3，组氨酸咪唑，精氨酸胍)染料结合量的大

13、小反映了样品中碱性氨基酸的量。，41，赖氨酸(-NH2)组氨酸(咪唑)精氨酸(胍)，42，小麦，大麦，水稻，大豆，花生等种子的蛋白质含量和碱性氨基酸含量之间有很好的相关性。因此，可以用染料结合量评价同一作物种子的大量远视材料之间蛋白质含量的高低。43，如果想在染料结合量中计算样品的粗蛋白含量，则必须用开尔文法测定同一种种子中样品的粗蛋白质量分数，染料结合量也要用染料结合量测定，求粗蛋白含量的染料结合量的回归方程，或绘制回归曲线。这样，测量未知样品的染料结合量，就可以在回归方程中计算粗蛋白质()含量，或从回归线中获得。44，牙齿方法是从种子间接测定蛋白质的方法。方法简单、快速，与开尔文方法的关联

14、性很好，但准确度不好，适用于大量的样品过滤工作。美国谷物化学协会将牙齿方法选为分析小麦蛋白质含量的正式方法(AACC11-272)。45，(b)注意事项，1牙齿法不适用于随机混合物的样品。2.样品称谓量取决于蛋白质含量的高低。水稻、小麦、大麦等为500毫克，玉米等为700毫克，大豆为200毫克，花生、鱼粉等。3染料反应的条件(例如染料的pH、样品的粒度、振动反应时间、温度等影响测量的结果)，每次测量的反应条件必须一致。特别是测量样品与测量回归方程样品时的反应条件一致。46，3，同种种子中蛋白质的测定(双轴法)，(1)原理：蛋白质的肽键结构(类似双轴脲的反应器)，在碱性条件下，可以生成Cu2和紫

15、色红色可溶性复合物，蛋白质肽键多时间反应紫色，相反，在肽键少的情况下，反应是红色牙齿颜色反应(双轴脲的反应)实验表明，蛋白质溶液浓度在115毫克之间，其颜色溶液的吸收值与蛋白质含量成正比。47，48，牙齿法应使用开尔文法作为标准回归方程。经过实验，与开尔文方法的相关性较好。优点：牙齿方法简单、快速、适用于快速分析，使用仪器设备简单，特别适用于大量品种的选择。应用小麦、大麦、水稻、玉米、高粱等多种样品，取得了良好的效果。缺点：灵敏度不高，样品用量大，很麻烦(必须事先用克氏法测量蛋白质含量，绘制标准曲线或计算回归方程)。49，(2)说明和注意事项，1 .蛋白质的种类不同，对发色程度影响不大。2.完

16、成标准曲线后，不必每次都创建标准曲线。脂肪多的样品要提前用尿素提取，扔掉。4.如果样品中有不溶性成分，非颜色测量可能会有困难。你可以预先提取蛋白质，然后测量。50，5。钚链中含有脯氨酸时，糖类杨怡多颜色不好，测定值降低。6.牙齿方法是美国谷物化学协会(AACC)测量谷物蛋白质的正式方法，已经有了基于牙齿方法原理进行蛋白质快速测定的自动分析器。7.用于一般生化分析的双缩试剂是碱性硫酸铜水溶液，不适用于种子蛋白质分析。因为它不稳定，浸出有色物质、脂肪及部分淀粉物质，妨碍比色法测定。51，8。异丙醇双尿素试剂，可以减少这些物质的溶解，消除干扰。9.对于一些深色种子测量，应四氯化碳处理已知样品，分解10g/LH202着色物质，然后加入双缩二脲试剂，消除对测量结果的影响。