第二章 基因操作的工具酶.ppt

1、,基因工程,华中师范大学生命科学学院 陈明清,基因工程,第一章 导 论 第二章 基因操作的工具酶 第三章 基因克隆的载体 第四章 基因克隆的策略 第五章 克隆基因的表达 第六章 基因工程的基本技术,第二章 基因操作的工具酶,第一节 限制性核酸内切酶及其应用 第二节 DNA连接酶及其应用 第三节 DNA聚合酶及其应用 第四节 修饰性工具酶,Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology. A variety of enzymes form the basic toolkit of the

2、genetic engineer.,1、限制性核酸内切酶的发现 2、限制性核酸内切酶的分类合命名 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、限制性核酸内切酶的消化反应,第一节 限制性核酸内切酶及其应用,50年代初发现了由寄主控制的限制和修饰现象,(K),大肠杆菌B,大肠杆菌K,1,1,410 4,10 4,E.O.P 成斑率 efficiency of plating,限制修饰的酶学假说,酶切位点 不被修饰,噬菌体DNA 被切割,酶切位点 被修饰 Methylation,基因组DNA 不被切割,1968年，Meselson 和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制性核酸内切酶； 1970年，

3、Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核 酸内切酶Hind II，使得DNA分子的体外精确切割成为可能。,1、限制性核酸内切酶的发现 2、限制性核酸内切酶的分类合命名 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、限制性核酸内切酶的消化反应,第一节 限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的概念,限制性核酸内切酶（ Restriction endonucleases）：是一类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶。已经从近300中微生物中分离出了500余种限制性核酸内切酶。,限制性核酸内切酶的分类,1. 限制修饰活性 2.

4、 内切酶的蛋白 质结构 3. 限制辅助因子 4. 切割位点 5. 特异性切割 6. 基因克隆中,I 型 单一多功能的酶 3种不同亚基 ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸 距特异性位点1000bp 不是 无用,II 型 限制酶和修饰酶分开 单一成分 Mg2+ 特异性位点及其附近 是 非常有用,III 型 双功能酶 2种亚基 ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸 特异性位点3端24-26bp处 是 有用,限制性核酸内切酶的命名,1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体 字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco , 流感嗜血菌Haemop

5、hilus influenzae 表示为 Hin； 2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind； 3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则 用罗马数字标出，比如Eco R I、 Hind III。,1、限制性核酸内切酶的发现 2、限制性核酸内切酶的分类合命名 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、限制性核酸内切酶的消化反应,第一节 限制性核酸内切酶,II型限制性核酸内切酶的3大特点,1、识别位点的特异性 每种酶都有其特定的DNA识别 位点，通常是由4、5、6或7个核苷酸组成的特定序 列（靶序列）。 2、识别序列的对称性 靶序列通常具有双重旋转对称 的结构，即双

6、链的核苷酸顺序呈回文结构。 3、切割位点的规范性 双链DNA被酶切后，分布在两 条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平 末端的DNA分子）。,切割位点,切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：,识别位点处。,与II型核酸内切酶有关的几个概念,粘性末端 cohesive ends 因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形 成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很 容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。 平 末 端 Blunt end 因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐 的末端结构，这种末端不易重新连接

7、起来。 同裂酶 isoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。 同尾酶 isocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一 类限制性核酸内切酶。 注 意： 由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶 消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的 任一种所识别。,粘性末端（sticky ends，cohensive ends）,含有几个核苷酸单链的末端。,分两种类型：, 5端凸出（如EcoR I切点）,GAATTC,CTTAA G,G AATTC,CTTAAG,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCAG, 3

8、端凸出（如Pst I切点）,GACGTC,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCA G,G ACGTC,几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点,经同尾酶消化的DNA末端连接示意图,5 XXXXGGATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAGGXXXXXX 5,BamH I,5 XXXXG GATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAG GXXXXXX 5,5 XXXXAGATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAGAXXXXXX 5,Bgl II,5 XXXXA GATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG AXXXXXX 5,推测酶切割位点出现的频率对于推断

9、DNA酶切片段大小很有用。假定4种核苷酸在DNA分子上出现的频率相同，那么靶序列为6个核苷酸的内切酶在每46（=4096）个核苷酸中酶切位点就有一次出现机会。据此推算，一条4900bp长的DNA中有12个6核苷酸识别序列的酶切位点（49000/4096）。但事实上并非真正如此，因为DNA分子中4种碱基的出现频率并不均等。,识别位点在DNA分子上出现的频率,1、限制性核酸内切酶的发现 2、限制性核酸内切酶的分类合命名 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、限制性核酸内切酶的消化反应,第一节 限制性核酸内切酶,一个酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37）下，50L

10、反应体系中完全降解1 g DNA所需要的酶量。 影响酶活性的因素很多，最重要的有： A。DNA的纯度和甲基化程度 B。甘油的含量（不超过5%） C。反应体系中的离子强度 D。反应体系的pH值 F。反应的温度条件 （通常为37 ）,酶单位的定义和影响酶活性的因素,Buffer (10X) 2.0 L Water 16.5 L DNA 1.0 L Enzyme 0.5 L Volume 20.0 L,酶 切 反 应 的 基 本 步 骤,电泳,紫外分析,37 1h,加反应液,CK,M,Buffer (10X) 2.0 L Water 16.5 L DNA 1.0 L Enzyme 0.5 L Vol

11、ume 20.0 L,1.0kb,1.0kb,0.4kb,0.5kb,0.6kb,CK,M,T,T,第二章 基因操作的工具酶,第一节 限制性核酸内切酶及其应用 第二节 DNA连接酶及其应用 第三节 DNA聚合酶及其应用 第四节 修饰性工具酶,Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer.,1、DNA连接酶作用的特点 2、DNA连接酶的反应条件 3、D

12、NA连接的策略,第二节 DNA连接酶及其应用,DNA连接酶的发现,环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种Nick的酶存在。 1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条 DNA链之间形成磷酸二酯键的酶DNA连接酶（ligase）。 DNA连接酶 由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能源辅助因子； T4DNA连接酶 由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以ATP作为能源辅助因子。 （1970年） 容易制备，而且可以连接完全配对的平末端DNA分子，所 以在基因克隆中应用广泛。,Nick,Nick,DNA连接酶作用的特点,A. 连接的两条链必须分别具有 3端自由羟基（-

13、OH） 和5 端磷酸基团（-P），而且只有这两个基团彼 此相邻时才能进行连接反应； B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过 程，因此连接反应必须有能量分子的参与，通常有 两种能量分子，即ATP和NAD+。,OK,NO,载体去磷防止自连的应用示例,P,OH,P,OH,OH,OH,OH,OH,P,OH,P,OH,OH,OH,OH,OH,连接酶,连接酶,连接酶,碱性磷酸酶,2Pi,寄主修复缺口,载体自连或产生二具体等,1、DNA连接酶作用的机理 2、DNA连接酶的反应条件 3、DNA连接的策略,第二节 DNA连接酶及其应用,DNA连接反应的条件,连接反应最佳温度为37，但是此时粘性末端间

14、氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，EcoRI 粘性末端连接部位只有4个碱基对，很容易断开。所以通常在4-15连接。 影响连接效率的因素有： A. 温度（最主要的因素） B. ATP的浓度( 10M - 1M ) C. 连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高） D. 反应时间（通常连接过夜） E. 插入片段和载体片段 的摩尔比,转化,1、DNA连接酶作用的机理 2、DNA连接酶的反应条件 3、DNA连接的策略,第二节 DNA连接酶及其应用,粘性末端DNA片段的连接,Nick,Nick,平末端DNA片段的末端加尾连接法,3,3,5,5,3,3,5,5,DNA聚合酶和 T4DNA连接酶,平

15、末端DNA片段加接头连接法,衔接物(linker)，也叫接头，是有人工化学合成的一段10-12个核苷酸的DNA双链，其中包含有1个或几个限制性酶切位点。使用时只须将衔接物和目的片段的5端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用T4DNA连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的DNA片段。,CCGAATTCGG GGCTTAAGCC,磷酸化,CCGAATTCGG GGCTTAAGCC,P,OH,OH,P,P,P,OH,OH,T4连接酶,CCGAATTCGG GGCTTAAGCC,P,OH,P,OH,EcoR I,CCGAATTCGG GGCTTAAGCC,AATTCGG GCC,CCG GGCTTA

16、A,第二章 基因操作的工具酶,第一节 限制性核酸内切酶及其应用 第二节 DNA连接酶及其应用 第三节 DNA聚合酶及其应用 第四节 修饰性工具酶,Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer.,1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 3、T4 DNA聚合酶 4、逆转录酶（反转录酶）,第三节 DNA聚合酶及其应用,大肠杆菌DNA聚合酶I （E

17、。Coli DNA pol I）是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E。Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力： 5- 3聚合酶活性 以双链DNA为模板，催化单核苷酸结合到引物的3末端，并不断延伸。 5- 3外切酶活性 将双链DNA中游离的5末端逐个切去。 3 - 5外切酶活性 将游离的双链或单链DNA的3端降解。不过对于双链的降解可被5-3的多聚活性所抑制。,CCG GGCTATCGGA,A,T,A,G,CCT,CCGATAGCCT GGCTATCGGA,CCGATAGCCT GGCTA,T,大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途,A. 制备高比活

18、度的DNA探针 利用其5-3的外切酶活性及其聚合酶活性。 B. 用于DNA连接后的大缺口填充 利用5-3的聚合酶活性。 C. 用于DNA的序列分析 利用5-3的聚合酶活性。,大肠杆菌聚合酶I的应用示例,CCGATAGCCT GGCTATCGGA,缺口转移 (Nick translation),CCG GGCTATCGGA,A,T,A,G,CCT,缺口转移 (Nick translation),1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 3、T4 DNA聚合酶 4、逆转录酶（反转录酶）,第三节 DNA聚合酶及其应用,Klenow片段的主要用途,Klenow片段大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草

19、杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，它仍然有53的聚合酶活性和3 5 的核酸外切酶活性，但失去了53的外切酶活性。,Klenow片段的主要用途 修补限制性酶消化DNA形成的3隐蔽末端 标记DNA片段的末端 cDNA克隆中第二链cDNA的合成 DNA序列的测定,GAA CTTAA,1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 3、T4 DNA聚合酶 4、逆转录酶（反转录酶）,第三节 DNA聚合酶及其应用,T4DNA聚合酶的特点,T4DNA聚合酶是 从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，它和Klenow片段一样具有53的聚合酶活性和3 5 的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶

20、I 的活性高200倍。 特别是，T4DNA聚合酶还有第三种活力取代反应： 如果反应体系中仅存在一种dNTP，这时T4DNA聚合酶就会表现出3 5 外切酶活力，从双链DNA的3开始降解，直到露出和缺乏的那中dNTP互补的碱基，然后就在此位置发生合成和取代反应。,CGTCGC GCAGCG,CGT GCAGCG,dTTP,Mg+,CG GCAGCG,dTTP,Mg+,T4DNA聚合酶的用途,1、以填充反应标记有5端延伸的双链 DNA片段 2、以取代反应标记延伸末端或平头末端 的双链DNA片段 3、用于DNA序列分析,1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 3、T4 DNA聚合酶 4、逆转

21、录酶（反转录酶）,第三节 DNA聚合酶及其应用,逆转录酶Reverse transcriptase,逆转录酶是 一种可以有效地将mRNA转录成为DNA的酶，其产物称为cDNA(complementary DNA).实际上，它也是一种RNA依赖的DNA聚合酶。 逆转录酶首先是1970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都发在了同一期的Nature杂志上。 主要用途是 将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。,3 AAAAAAAA,第二章 基因操作的工具酶,第一节 限制性核酸内切酶及其应用 第二节 DNA连接酶及其应用 第三节 DNA聚合酶及其应用 第四节 修饰性工具酶,Gen

22、etic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer.,1、末端转移酶（terminal transferase） 2、核酸酶SI（SI nuclease） 4、碱性磷酸化酶,第四节 修饰性工具酶,末端转移酶的特性,末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。 该类酶可以在没有模板链存在的情况下，将核苷酸连接到DNA的在3 羟基，特别是对于平末端的双链DNA

23、末端加尾十分有效。 最常见的用途是在酶切产生的平末端加尾以便于创造粘性的互补末端。,Characters of the polymerase,Terminal transferase is the common name of template-independant DNA polymerase. This enzyme is isolated from calf thymus and can add nucleotides to 3 hydroxyl groups of DNA without the need for a template. The best primer is doub

24、le stranded DNA (dsDNA) with blunt ends. Purine bases require magnesium ions and pyrimidine bases require cobalt ions. The enzyme builds up homopolymer chains if supplied with appropriate dNTPs. The most common use for this enzyme is the generation of complementary tails on DNA fragments and vectors

25、 cut with restriction enzymes which generate blunt ends.,平末端DNA片段的末端加尾连接法,3,3,5,5,3,3,5,5,DNA聚合酶和 T4DNA连接酶,1、末端转移酶（terminal transferase） 2、核酸酶SI（SI nuclease） 3、碱性磷酸化酶（Alkaline phosphatase）,第四节 修饰性工具酶,核酸酶SI的特性,这是一种从米曲霉（Aspergillus oryzae）中分离的可以降解单链DNA或RNA的外切酶。 其主要用途有： A、在cDNA合成过程中，切开cDNA的发夹末端； B、载体构建

26、过程中，切去DNA片段的单链尾巴， 形成平末端结构。,3 AAAAAAAA,发夹结构的切除,单链尾巴的切除,1、末端转移酶（terminal transferase） 2、核酸酶SI（SI nuclease） 3、碱性磷酸化酶,第四节 修饰性工具酶,碱性磷酸化酶的特性,从细菌中分离的碱性磷酸化酶简称BAP（Bacterial Alkaline Phosphatase），从小牛肠中分离的简称CAP（Calf Alkaline Phosphatase）.其主要功能是将DNA或RNA5端的磷酸切除。 其主要用途有： A、在用P标记DNA 5端之前，去除5端的磷； B、在DNA重组技术中，去除DNA片段的5磷酸，防 止载体的自身环化。,载体去磷防止自连的应用示例,P