背根神经节TRPM8和P2X3受体相互作用

1、背根神经节TRPM8和P2X3受体相互作用参与神经病理性疼痛的机制研究TRPM8是一种对冷刺激敏感的通道，并与痛觉形成和传导密切相关。冷刺激后TRPM8通道开放，引起Ca2+内流，激活磷脂酶C，进一步激活PKC信号通路参与疼痛信息的传递。嘌呤能P2X3受体介导伤害性信息的传递，我们前期研究表明背根节神经元P2X3受体表达增加促进了神经病理性疼痛的发生、发展。TRPM8和P2X3受体广泛分布于神经系统，并且均高表达于背根神经节小型神经元。以往研究显示，在背根节神经元热敏感通道TRPV1与P2X3受体存在相互抑制作用。那么，冷敏感通道TRPM8和P2X3受体是否存在相互作用，共同参与神经病理性疼痛

2、的调节，有待于进一步研究。本项目拟采用坐骨神经缩窄性损伤（CCI）模型，综合应用行为学、形态学、分子生物学以及电生理学方法，观察背根神经节TRPM8和P2X3受体在神经病理性疼痛发生发展中的作用；培养背根节神经元，观察TRPM8和P2X3受体之间的相互调节作用及相关的信号机制。该研究为阐明神经病理性疼痛的机理及以TRPM8为靶点开发新型镇痛药提供新的思路。（一）立项依据与研究内容：1.项目的立项依据外周神经损伤后造成的神经病理性疼痛是临床上常见而难以治疗的疼痛，严重影响了患者的身体健康。因此，揭示其发生机制、进一步研发效果良好而副作用小的镇痛药物是疼痛研究领域的热点。以往的临床和基础研究均表明

3、，外周神经损伤后背根节神经元兴奋性增高是产生神经病理性疼痛的关键。异常性冷痛是临床上神经病理性疼痛的常见症状之一，TRPM8通道是介导异常性冷痛的关键分子。以往研究显示，背根节神经元P2X3受体表达增加在神经病理性疼痛中发挥重要作用。TRPM8通道和P2X3受体广泛分布于神经系统，均高表达于背根神经节及三叉神经节感觉神经元。然而，对于TRPM8通道和P2X3受体是否相互作用，共同参与神经病理性疼痛，以及它们之间相互作用的分子与细胞机理，尚不清楚。因此，我们拟提出以下的问题进行研究：第一，TRPM8和P2X3受体是否相互作用，共同参与神经病理性疼痛? 第二，TRPM8与P2X3受体之间相互作用的

4、信号机制如何?该研究将进一步阐明TRPM8与P2X3受体二者之间的相互作用，为研发新的镇痛药物奠定必须的理论基础，为顽固性神经病理性疼痛的治疗提供新思路。2、TRPM8通道参与神经病理性疼痛的调节瞬时受体电位（transient receptor potential，TRP）通道是位于细胞膜上的一类重要的非电压依赖性阳离子通道超家族，参与多种重要的生理功能，包括肌肉收缩、递质释放、细胞增殖与分化、基因转录、细胞凋亡及细胞死亡等。根据其编码氨基酸序列的不同，可将TRP基因超家族分为7个不同的亚家族：TRPC，TRPM，TRPV，TRPA，TRPP，TRPML及TRPN。TRP具有6次跨膜结构(S

5、1-S6)和位于胞内的N-末端和C-末端，S5和S6之间的疏水片段构成离子通透区，N-末端含有数目不等的锚蛋白样重复序列，C-末端具有高度保守的TRP结构域1。TRP通道作为细胞重要的感受器，传递细胞内外的信息，不同的TRP通道调节机制各异；而且同时受到来自细胞内外的信使分子、化合物、温度及渗透压等变化的调节2。其中，TRPV1、TRPM8和TRPA1是TRP离子通道家族的三个主要成员，TRPV1为主要的热感受体，而TRPM8和TRPA1是冷感受体。研究表明，TRPV1、TRPM8和TRPA1激活可导致初级感觉神经元兴奋，产生急性或持续性疼痛，在机械痛、冷痛、热痛觉过敏中等扮演着重要的角色3-

6、4 。瞬时受体电位melastatin 8（TRPM8）是属于瞬时受体电位蛋白家族的一种非选择性阳离子通道，主要分布在三叉神经节和背根神经节的小型神经元中，可以被冷刺激（828）激活,也可以被薄荷醇和icilin等化合物活化5。TRPM8参与了病理性疼痛的调节，然而迄今为止，有关于TRPM8在疼痛中的作用报道并不一致。Xing等6的研究表明，坐骨神经缩窄性损伤（chronic constrictive injury，CCI)大鼠背根神经节小型神经元TRPM8表达增加、功能增强，认为TRPM8介导了CCI大鼠的冷触诱发痛。然而，有学者报道采用坐骨神经痛模型及炎性疼痛模型研究表明，icilin作为

7、一种TRPM8激动剂可起到拮抗痛觉增敏的作用：坐骨神经损伤后背根神经节和脊髓中TRPM8的表达增高，而TRPM8反义寡核苷酸处理后镇痛作用消失，提示TRPM8在冷镇痛机制中发挥重要作用7-8。Su等9研究认为在CCI模型中通过下调背根神经节上TRPM8蛋白的表达可减轻冷痛觉过敏的作用。目前报道认为针对TRPM8通道已成为治疗病理性疼痛的新靶点10。TRPM8通道活性受到磷脂酰肌醇4，5二磷酸（PIP2）、Ca2+-非依赖性磷酸脂酶A2（iPLA2）的调节11-12。 Daniels等报道磷脂酶C( PLC)可通过分解PIP2，降低细胞膜PIP2的水平，进一步抑制TRPM8通道的活性13。与PL

8、C/PIP2信号通路相比，蛋白激酶调节TRPM8的作用目前并不清楚。有文献报道钙依赖性蛋白激酶C的激活剂可明显降低背根神经元TRPM8通道激活剂薄荷醇的反应14；Bavencoffe等15发现，在转染TRPM8通道的HEK-293细胞中，Gi/AC/cAMP/PKA信号通路的激活可抑制TRPM8通道电流，说明PKA参与了TRPM8通道的功能调节；而Sarria等16认为PKC激活可抑制TRPM8的功能，但PKA不影响TRPM8的活性。 3、P2X3受体参与神经病理性疼痛的调节ATP作为一种兴奋性神经递质调质普遍存在于神经系统并执行多种生理功能，其中ATP及其P2X受体在伤害性信息的产生、传递中

9、发挥重要的作用。P2X受体由379-595个氨基酸组成，有2个跨膜结构域和位于胞内的N-末端和-末端，保守序列主要位于胞外环结构。目前通过分子克隆技术已经克隆出种哺乳动物的P2X受体亚单位P2X（1-7）受体。P2X受体为配体门控非选择性阳离子通道，允许Na+、K+、Ca2+通过，但以Ca2+ 的通透性最为明显17。P2X3受体高度选择性地表达于与伤害性感受有关的小直径感觉神经元中。P2X3受体可由背根节神经元胞体合成后转运到中枢端与外周端，其中枢端轴突末梢投射入脊髓背角浅层；外周端投射到皮肤和内脏等器官。当机体受到伤害或神经损伤后释放大量ATP，激活突触前膜P2X3受体，引起大量Ca2+内流

10、，并促使谷氨酸释放，参与脊髓背角的突触可塑性变化，传递疼痛信息,促进疼痛的发生发展18。研究表明，P2X3受体表达上调或者活性增强时疼痛加重，当其表达下降或者脱敏时疼痛会相应减轻19-20。我们以往的研究显示背根节神经元P2X3受体表达增加所致的ATP反应敏感性增强及兴奋性提高可能在坐骨神经损伤所致的神经痛的发生、发展中发挥了重要的作用21-22。Brown等23研究表明PKC激活可增加HEK-293 细胞系P2X3受体介导的阳离子电流以及Ca2+内流，但认为这种作用并非源于P2X3受体直接磷酸化。另外，前列腺素E2激活cAMP/PKA 信号通路可以显著增强背根节神经元P2X3受体介导的电流2

11、4。李娜等25 在培养的大鼠背根神经节神经元中发现，PKA和PKC可能通过磷酸化调节抑制ATP诱导的瞬时型内向电流，从而抑制P2X3受体的功能。上述研究表明，蛋白激酶可调节P2X3受体的功能，但其调节机制尚未完全阐明。4、TRPM8和P2X3受体可能相互作用参与神经病理性疼痛背根神经节作为痛觉传入的第一级神经元，在痛觉的外周机制中起着极为重要的作用。背根神经节神经元不仅含有传递伤害性感觉的神经递质和调质，如速激肽、兴奋性氨基酸等，也含有起突触前调制作用的受体，如r-氨基丁酸、阿片、嘌呤等受体。TRPM8与P2X3受体均高表达于背根神经节小直径神经元，分别在伤害性信息的调制中起着重要的作用。St

12、anchev等26采用膜片钳、免疫共沉淀等技术发现，在培养的大鼠背根神经节神经元和转染P2X3及TRPV1受体的HEK293细胞系， P2X3受体和热敏感通道TRPV1存在相互抑制作用，且认为二者之间的相互作用与细胞内外的钙离子浓度密切相关。在初级感觉神经元，热敏感通道TRPV1与P2X3受体存在相互作用，冷敏感通道TRPM8和P2X3受体均高表达于背根神经节小直径神经元中，TRPM8通道和P2X3受体是否可以相互调节，继而参与神经病理性疼痛的调节，尚不清楚。综上所述，TRPM8与P2X3受体分别在伤害性信息的调制中起着重要的作用，且二者均高表达于背根神经节小直径神经元中，文献报道在背根神经节

13、神经元热敏感通道TRPV1与P2X3受体存在相互抑制作用，故我们推测冷敏感通道TRPM8与P2X3受体在功能上可能有交互作用，但TRPM8通道与P2X3受体是否为直接相接触而影响功能，抑或是TRPM8通过介导Ca2+内流，激活PKA和PKC，继而调节P2X3受体功能，有待于进一步的研究。本研究拟采用CCI模型，结合在体及离体实验，综合应用行为学、形态学、分子生物学方法，观察外周神经损伤后大鼠行为学变化，观察背根神经节TRPM8和P2X3受体在神经病理性疼痛发生发展中的相互作用；培养背根神经节神经元，观察TRPM8和P2X3受体功能的相互调节作用及其机理。该研究为神经病理性疼痛的机理研究及以TR

14、PM8为靶点开发新型镇痛药提供新的思路。主要参考文献：1.Clapham DE, Runnels LW, Strubing C.The TRP ion channel family.Nat Rev Neurosci. 2001,2(6):387-96.2. Staaf S, Oerther S, Lucas G, Mattsson JP, Ernfors P.Differential regulation of TRP channels in a rat model of neuropathic pain. Pain. 2009,144(1-2):187-99. 3. Julius D. TR

15、P channels and pain. Annu Rev Cell Dev Biol. 2013,29:355-84.4. Foulkes T, Wood JN. Mechanisms of cold pain. Channels. 2007,1(3):154-60.5.McKemy DD, Neuhausser WM, Julius D. Identification of a cold receptor reveals a general role for TRP channels in thermosensation. Nature. 2002,416(6876):52-8.6.Xin

16、g H, Chen M, Ling J, Tan W, Gu JG. TRPM8 mechanism of cold allodynia after chronic nerve injury. J Neurosci.2007,27(50):13680-90.7. Proudfoot CJ, Garry EM, Cottrell DF, Rosie R, Anderson H, Robertson DC, Fleetwood-Walker SM, Mitchell R. Analgesia mediated by the TRPM8 cold receptor in chronic neurop

17、athic pain. Curr Biol. 2006,16(16):1591-605.8.Knowlton WM, Daniels RL, Palkar R, McCoy DD, McKemy DD. Pharmacological blockade of TRPM8 ion channels alters cold and cold pain responses in mice.PLoS One.2011,6(9):e25894. 9.Su L, Wang C, Yu YH, Ren YY, Xie KL, Wang GL. Role of TRPM8 in dorsal root gan

18、glion in nerve injury-induced chronic pain. BMC Neurosci. 2011,12:120.10.Saat K, Moniczewski A, Librowski T. Transient receptor potential channels - emerging novel drug targets for the treatment of pain. Curr Med Chem. 2013,20(11):1409-36.11.Rohcs T, Lopes CM, Michailidis I, Logothetis DE. PI(4,5)P2

19、 regulates the activation and desensitization of TRPM8 channels through the TRP domain. Nat Neurosci. 2005,8(5):626-34.12. Fujita F, Uchida K, Takaishi M, Sokabe T, Tominaga M. Ambient temperature affects the temperature threshold for TRPM8 activation through interaction of phosphatidylinositol 4,5-

20、bisphosphate. J Neurosci. 2013,33(14):6154-9.13.Daniels RL, Takashima Y, McKemy DD. Activity of the neuronal cold sensor TRPM8 is regulated by phospholipase C via the phospholipid phosphoinositol 4,5-bisphosphate. J Biol Chem. 2009,284(3):1570-82.14.Abe J, Hosokawa H, Sawada Y, Matsumura K, Kobayash

21、i S. Ca2+-dependent PKC activation mediates menthol-induced desensitization of transient receptor potential M8. Neurosci Lett. 2006,397(1-2):140-4.15.Bavencoffe A, Gkika D, Kondratskyi A, Beck B, Borowiec AS, Bidaux G, Busserolles J, Eschalier A, Shuba Y, Skryma R, Prevarskaya N. The transient recep

22、tor potential channel TRPM8 is inhibited via the alpha 2A adrenoreceptor signaling pathway. J Biol Chem. 2010,285(13):9410-19. 16.Sarria I, Gu J. Menthol response and adaptation in nociceptive-like and nonnociceptive-like neurons: role of protein kinases. Mol Pain. 2010,6:47.17.Chen CC, Akopian AN,

23、Sivilotti L, Colquhoun D, Burnstock G, Wood JN. A P2X purinoceptor expressed by a subset of sensory neurons. Nature. 1995,377:428-31.18.Pan AH, Lu DH, Luo XG, Chen L, Li ZY.Formalin-induced increase in P2X(3) receptor expression in dorsal root ganglia: implications for nociception. Clin Exp Pharmaco

24、l Physiol. 2009,36(8):e6-11.19.North RA, Jarvis MF. P2X receptors as drug targets.Mol Pharmacol. 2013,83(4):759-69.20.Li X, Kang L, Li G, Zeng H, Zhang L, Ling X, Dong H, Liang S, Chen H. Intrathecal leptin inhibits expression of the P2X2/3 receptors and alleviates neuropathic pain induced by chroni

25、c constriction sciatic nerve injury. Mol Pain. 2013 ,9:65.21.刘晓红,曾俊伟,张金海,阮怀珍.神经病理性痛大鼠背根神经节P2X3受体表达及电生理学特性的改变.第三军医大学学报.2008,30(4):288-291.22.Liu X, Zeng J, Zhao Y, Xiao Z, Fang C, Ruan H.Inhibition of ATP-induced Ca2+ influx by corticosterone in dorsal root ganglion neurons. Neurochem Res. 2010 ,35(5

26、):804-10. 23.Brown DA, Yule DI. Protein kinase C regulation of P2X3 receptors is unlikely to involve direct receptor phosphorylation. Biochim Biophys Acta. 2007,1773(2):166-75.24.Wang C, Li GW, Huang LY. Prostaglandin E2 potentiation of P2X3 receptor mediated currents in dorsal root ganglion neurons

27、. Mol Pain. 2007,3:22.25.李娜,陆一,樊娟,邓小明,马蓓.蛋白激酶A和蛋白激酶C对大鼠背根神经节神经元P2X3受体介导的内向电流的调节作用.第二军医大学学报.2012,33 (8):813-817.26.Stanchev D, Blosa M, Milius D, Gerevich Z, Rubini P, Schmalzing G, Eschrich K, Schaefer M, Wirkner K, Illes P. Cross-inhibition between native and recombinant TRPV1 and P2X(3) receptors.

28、 Pain. 2009,143(1-2):26-36.1、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题（此部分为重点阐述内容）1.1 项目的研究内容：(1) 在体实验：制备大鼠坐骨神经缩窄性损伤（CCI）的神经痛模型，观察CCI大鼠行为学变化，背根神经节TRPM8、P2X3受体、信号分子PKA、PKC表达的变化，以及鞘内分别注射TRPM8拮抗剂、P2X3受体拮抗剂对以上指标的影响，从而确定TRPM8、P2X3受体、PKA、PKC在神经病理性疼痛中所起的作用。(2) 离体实验：观察TRPM8和P2X3受体之间相互作用对培养的背根节神经元功能活动的影响（Ca2+i变化、全细胞电流），并探讨T

29、RPM8和P2X3受体功能相互作用的分子机理。1.2 研究目标：(1) 观察背根神经节TRPM8、P2X3受体在神经病理性疼痛中发挥的作用。(2) 阐明背根神经节TRPM8和P2X3受体功能的相互作用以及相应的信号传导机制。1.3 拟解决的关键科学问题：(1) 背根神经节TRPM8和P2X3受体在神经病理性疼痛中发挥的作用。(2) 背根神经节TRPM8和P2X3受体之间是否存在相互作用及其相关的调节机制。2、拟采取的研究方案及可行性分析（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）2.1 研究方法：实验所用动物为我校实验动物中心提供的SD大鼠。(1) 行为学方法 热痛阈测定和机械痛阈测定

30、，观察模型大鼠行走姿态、下肢位置及状态、爪部情况及自噬现象，并于术前2天、术后1、3、7和14天进行热痛阈和机械痛阈的测定。(2) 形态学方法 免疫组织化学检测慢性神经痛大鼠背根神经节TRPM8、P2X3受体、PKA、PKC的表达。(3) 分子生物学技术 Western Blot测定TRPM8、P2X3受体、PKA、PKC的表达，以及鞘内分别注射TRPM8拮抗剂、P2X3受体拮抗剂对以上指标的影响，从而确定TRPM8、P2X3受体及PKA、PKC在神经病理性疼痛中所起的作用。(4) 大鼠背根节神经元的培养 1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后处死,剪开皮肤,快速取出腰段L4-6神经节及其相连的神经根,

31、在解剖显微镜下用精细角膜剪及游丝镊仔细剪除相连神经和周围的结缔组织被膜,将神经节剪碎成2至3块, 置于含0.25 %胶原酶的2 ml DMEM / F12培养基中消化60-90 min，然后置于含0.125 %胰蛋白酶的2 ml D-Hanks 平衡盐溶液消化15 min。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化,然后用经热抛光的不同口径的玻璃吸管轻轻吹打制成细胞悬液, 800 rpm/min ,离心5 min。获取沉淀物,接种于经多聚赖氨酸和层粘连蛋白双重包被的玻片上,加入2 ml神经细胞完全培养液,内含DMEM / F12培养基、10 %胎牛血清、青霉素、链霉素、神经生长因子（5

32、0 ng/ml），pH 7.4，置于含95% O2和5% CO2的37oc孵箱中，DRG神经元于培养48 h内用于膜片钳记录。(5) 电生理学技术 全细胞膜片钳记录：实验在2030室温下进行,选择表面光滑、有突起的中、小神经元为实验对象，以混合气(95%O2+5%CO2)饱和的细胞外液持续灌流，用灌入电极内液后阻抗为510 M的玻璃微电极钳制培养的神经元，待封接完全形成，负压吸破胞膜。在电流钳下记录动作电位的变化，电压钳下记录电流的变化。 (6) 其他技术 激光共聚焦技术测定Ca2+i，细胞内游离钙水平用钙离子荧光指示剂Fluo-4显示，通过激光共聚焦显微镜检测其荧光强度，反映胞浆游离钙的相对

33、强弱和变化。2.2 技术路线和实验方案：2.2.1 观察TRPM8和P2X3受体在神经病理性疼痛中所起的作用实验技术路线： (1) 实验分组 假性手术组、坐骨神经痛（CCI模型组）、CCI模型组+P2X3受体拮抗剂、CCI模型组+TRPM8拮抗剂。(2) 慢性神经痛模型的制作 大鼠以1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，无菌条件下分离坐骨神经主干，用珞制羊肠线环绕坐骨神经松扎四处，间距为1 mm，结扎强度以引起小腿肌肉轻度颤动、环绕的羊肠线能够在坐骨神经主干上滑动为宜，然后逐层缝合。假性手术组，游离坐骨神经后不做损伤处理。(3) 鞘内注射TRPM8拮抗剂、P2X3受体拮抗剂 大鼠蛛网膜下腔埋管，鞘内分别

34、注射TRPM8拮抗剂、P2X3受体拮抗剂（坐骨神经结扎术后1-7d给药）。(4) 疼痛行为学测定 观察模型大鼠行走姿态、下肢位置及状态、爪部情况及自噬现象，并于术前2天、术后1、3、7和14天进行热痛阈和机械痛阈的测定。(5) 背根神经节TRPM8和P2X3受体表达的测定 免疫组织化学检测慢性神经痛大鼠背根神经节TRPM8、P2X3受体的表达。 Western Blot测定TRPM8、P2X3受体、PKA、PKC的表达，以及鞘内分别注射TRPM8拮抗剂、P2X3受体拮抗剂对以上指标的表达情况。2.2.2 研究TRPM8和P2X3受体之间可能存在的相互作用及机制，以下为实验技术路线： (1) 研

35、究TRPM8通道和P2X3受体对神经元调节相互表达的影响：背根节神经元根据分组分别给予TRPM8激动剂；P2X3激动剂；TRPM8激动剂+ P2X3激动剂；TRPM8拮抗剂+ TRPM8激动剂+ P2X3激动剂； P2X3拮抗剂+ TRPM8激动剂+ P2X3激动剂。采用定量PCR技术、免疫组化方法检测各组背根节神经元上TRPM8、P2X3受体的表达。(2) 研究TRPM8通道和P2X3受体对神经元在功能上相互影响的信号机制：a. 观察TRPM8通道对P2X3受体的影响：根据分组分别给予P2X3受体激动剂；TRPM8激动剂+P2X3受体激动剂；TRPM8拮抗剂+TRPM8激动剂+P2X3受体激

36、动剂；PLC拮抗剂+TRPM8激动剂+P2X3受体激动剂；PKA/PKC拮抗剂+P2X3受体激动剂。采用共聚焦检测各组背根节神经元上Ca2+i变化、膜片钳记录背根节神经元全细胞电流，从而探讨TRPM8通道和P2X3受体可能存在的相互作用及机制。b观察P2X3受体对TRPM8通道的影响：根据分组分别给予 TRPM8激动剂；P2X3受体激动剂+TRPM8激动剂； P2X3拮抗剂+ P2X3受体激动剂+TRPM8激动剂；PKA/PKC拮抗剂+ TRPM8激动剂。采用共聚焦检测各组背根节神经元上Ca2+i变化、膜片钳记录全细胞电流，从而探讨TRPM8通道和P2X3受体可能存在的相互作用及机制。2.3

37、可行性分析：(1) 立题依据充分 本课题是申请者在广泛查阅国内外相关文献资料在痛觉生理的研究基础上提出的。我们前期研究表明在神经病理性疼痛模型中P2X3受体表达增加所致的ATP反应敏感性增强及兴奋性提高可能在坐骨神经损伤所致的神经痛的发生、发展中发挥了重要的作用。在此基础上本研究以背根节神经元为着眼点，研究TRPM8通道和P2X3受体参与神经病理性疼痛的相互作用机制。设计具有较强的创新性，立论有据，立题充分，观察指标合理。(2) 研究方法成熟，有较好工作基础 本课题组长期从事病理性疼痛发病机制的研究，已掌握多种神经痛模型的制备及本项目中所涉及的实验方法，包括神经元培养、免疫组织化学技术、分子生

38、物学技术、全细胞膜片钳记录技术。(3) 本课题组成员搭配合理 本课题组成员基本都经过硕士或博士研究生阶段训练，分别承担过不同级别的研究课题，具有较强的科研创新能力和较全面的研究技术；并且课题组成员较年轻、精力充沛，为保质保量、按时完成本课题提供了有力的保障。(4) 实验条件较好 本实验室以及学校中心实验室、药理学实验室和细胞工程实验室（省重点实验室）具有先进的研究设备和技术条件。学校已经建立细胞培养、免疫组织化学技术、分子生物学等实验平台，学校中心实验室、药理学重点实验室和细胞工程实验室具有本实验所需的膜片钳记录系统、激光共聚焦扫描显微镜、冰冻切片机、大型图像分析仪。所以，各项实验条件均具备，

39、能够满足本课题研究的需要。本研究所需的药品均能在国内外购置到。总之，我们具备了足够的人力、物力、技术和时间，如能获得国家自然科学基金的资助，能保证本课题的顺利完成。3、本项目的特色与创新之处TRPM8通道是一种温度敏感的冷感受体，P2X3受体介导疼痛信息的传递，且TRPM8和P2X3受体均高表达在背根节感觉神经元，但二者之间是否存在相互作用参与神经病理性疼痛的调节尚不清楚。本课题以在疼痛的发生和维持中起重要作用的背根节感觉神经元为切入点，观察TRPM8和P2X3受体在神经病理性疼痛中的相互作用及其相关机制。有关这一方面的研究将促使我们深入认识背根节感觉神经元TRPM8、P2X3受体在疼痛发生及

40、维持过程中所起的作用及相关机制。本项目在思路和实验设计上具有较大的创新性。 该研究将会进一步深入阐明病理性疼痛发生、发展的机制，为开发以TRPM8为靶点的新型镇痛药提新的思路。4、年度研究计划及预期研究结果（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）4.1 预期研究计划 研究内容分几部分交叉进行，大致进度如下：2015.01-2015.12：实验前准备、定购试剂及预实验，疼痛行为学变化.2016.01-2016.12：观察慢性坐骨神经痛大鼠背根节神经元TRPM8通道和P2X3受体的表达变化；参加国内学术会议一次。2017.01-2017.12：分离培养背根节神经元，观察TRPM8通道

41、和P2X3受体之间的相互作用及其信号机制。2018.01-2018.12：补充实验，结果统计分析，撰写及发表论文，完成项目。4.2 预期研究成果:(1) 明确TRPM8和P2X3受体参与痛觉信息的调制；阐明TRPM8和P2X3受体之间相互作用参与调节背根节神经元功能活动及其相关机制。(2) 成果以论著形式发表，力争在本领域有影响的学术期刊发表SCI论文12篇，在国内核心期刊发表论文12篇。(3) 培养硕士研究生2名、青年教师1名。5、研究基础与工作条件5.1 工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）:课题组成员都经过硕士或博士研究生阶段训练，分别承担过不同级别的研究课题，熟

42、练掌握多种实验技能，包括细胞培养、免疫组织化学、分子生物学、全细胞膜片钳记录等技术。我们团队的前期研究发现在神经病理性疼痛模型中P2X3受体表达增加所致的ATP反应敏感性增强及兴奋性提高可能在坐骨神经损伤所致的神经痛的发生、发展中发挥了重要的作用。我们在前期工作中能成功分离培养出表面光滑的背根节神经元，适合于膜片钳全细胞电流的观察。经过不断的努力、不断的积累和完善，本课题组已具备较强的科研创新能力和较全面的研究技术，为本课题的完成提供了有力保障。稳定培养出大鼠背根节神经元5.2工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家实验室、国家重点实验室和部门开放实验室等研

43、究基地的计划与落实情况）:本教研室现有行为学、免疫组化、分子生物学、细胞培养、电生理等多个实验平台。 拥有低温冰箱、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、Western blot 、PCR仪等。学校中心实验室、药理学实验室和细胞工程实验室（省重点实验室），具有膜片钳记录全套设备、激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪、冰冻切片机、大型图像分析仪等。已具备进行本项目研究所需条件。5.3 承担科研项目情况（申请人和项目组主要参与者正在承担的科研项目情况，包括自然科学基金的项目，要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、与本项目的关系及负责的内容等）无5.4 完成自然科学基金项目情况（对申请人负责的前一个已结

44、题科学基金项目（项目名称及批准号）完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘要（限500字）和相关.成果的详细目录）无申请人简介 申请人：秦榜勇，男，42岁，主任医师1.个人简介秦榜勇，男，1971年8月14日出生，贵州遵义人。1994年毕业于遵义医学院临床医学专业，毕业后一直在遵义医学院附属医院麻醉科从事临床麻醉和疼痛诊疗工作。2001年遵义医学院麻醉学硕士研究生毕业,导师：余志豪、喻田教授。2008年硕士研究生导师。2011年任麻醉医学系麻醉药理学教研室副主任。2012年贵州省口腔麻醉专业委员会常务委员，2013年中国药理学会麻醉药理学专业委员会

45、委员。发表论文 篇，其中核心期刊 篇。 1994.07-1999.12 遵义医学院附属医院麻醉科 住院医师1999.12-2004.12 遵义医学院附属医院麻醉科 主治医师2004.12-2010.12 遵义医学院附属医院麻醉科 副主任医师2010.12- 遵义医学院附属医院麻醉科 主任医师2011.09- 遵义医学院麻醉医学系麻醉药理学教研室副主任2.教育经历1989.09-1994.07 遵义医学院临床医学专业 本科1998.09-2001.07 遵义医学院麻醉学专业 硕士研究生2007.07-2008.12 北京安贞医院麻醉科心血管手术麻醉专业 进修学习2013.03-2013.05 四

46、川大学华西医院麻醉科疼痛诊疗专业 进修学习3.研究工作经历1998.09-2001.07：硕士研究生阶段学习。主要研究体外循环心脏超激化停搏在体和离体对缺血心肌保护的研究。2001.07-至今：主要从事临床麻醉药理与疼痛诊疗有关的研究。4.科研成果发表论文：以第一作者发表的有关论文：1. 秦榜勇，胡红专，曹保峰，朱昭琼.依托咪酯持续输注对犬肾上腺素及去甲肾上腺素的影响.中国现代医学杂志，2011；21（24）：2949-2951.2.胡红专，秦榜勇，曹保峰，朱昭琼.静脉输注不同剂量依托咪酯对犬肾上腺皮质功能的影响.中华麻醉学杂志，2012；32（3）：382-383.(通讯作者) 3. 秦榜勇，喻田，张红，梁小丽.PBL教学在麻醉药理学理论教学中的尝试.中国医药导报，2012；