SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤_第1页
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤_第2页
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤_第3页
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤_第4页
全文预览已结束

下载本文档

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

1、.sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)实验原理和操作步骤实验原理:sds-page是对蛋白质进行量化,比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。sds是一种去垢剂,可与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。sds蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后,电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。试剂和器材:试剂:1. 5x样品缓冲液(10ml):0.6ml 1mol/l的tris-hcl(ph6.8),5ml 50%甘油,2ml 10%的sds,0

2、.5ml巯基乙醇打开二硫键的作用,1ml 1%溴酚蓝,0.9ml蒸馏水。可在4保存数周,或在20保存数月。2. 凝胶贮液:在通风橱中,称取丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加重蒸水溶解后,定容到100ml。过滤后置棕色瓶中,4保存,一般可放置1个月。3. ph8.9分离胶缓冲液: tris 36.3g ,加1mol/l hcl 48ml,加重蒸水80ml使其溶解,调ph8.9,定容至100ml, 4精品.保存。4. ph6.7浓缩胶缓冲液: tris 5.98g ,加1mol/l hcl 48ml,加重蒸水80ml使其溶解,调ph6.7,定容至100ml, 4保存。5. temed(四乙

3、基乙二胺)原液6.10%过硫酸铵(用重蒸水新鲜配制)7. ph8.3 tris-甘氨酸电极缓冲液:称取tris 6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸馏水约900ml,调ph8.3后,用蒸馏水定容至1000ml。置4保存,临用前稀释10倍。8. 考马斯亮蓝g250染色液:称100mg考马斯亮蓝g250,溶于200ml蒸馏水中,慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸,最后补足水到250ml,搅拌1小时,小孔滤纸过滤。器材:电泳仪,电泳槽,水浴锅,摇床。 实验操作精品.(一)样品制备将蛋白质样品与5x样品缓冲液(20ul5ul)在一个eppendorf管中混合。放入100加热 510min,取上清点样。(二

4、)分离胶及浓缩胶的制备1 将玻璃板、样品梳、spacer用洗涤剂洗净,用ddh2o 冲洗数次,再用乙醇擦拭,晾干;2 将两块洗净的玻璃板之间加入spacer,按照bio-rad mini /说明书提示装好玻璃板;3 按如下体积配制10分离胶8.0 ml,混匀;ddh2o 3.0 ml1.0 mol/ltris-hcl缓冲溶液,三羟甲基氨基甲烷 ph=8.8 2.1 ml30% acr-bis甲叉双丙烯酰胺 2.8 ml10% sds 十二烷基磺酸钠,使蛋白质变性80 ul10%ap过硫酸铵,助氧化剂,加速胶的凝固 56 ultemed催化过硫酸钠产生自由基,从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合 6 ul4 向玻璃板间灌制分离胶,立即覆一层重蒸水,大约20 min后胶即可聚合;5 按如下体积配制6浓缩胶3.0 ml,混匀;ddh2o重蒸水 1.0 mol/ltris-hcl ph=6.8 30% acr-bis2.0 ml 400 ul 600 ul10% sds 10% ap temed36ul 24ul 4ul6 将上层重蒸水倾去,滤纸吸干,灌制浓缩胶,插入样品梳;精品.7 装好电泳系统,加入电极缓冲液,上样20 l;8 稳压200v,溴酚蓝刚跑出分离胶时,停止电泳,约需45 min1hr.9 卸下胶板,剥离胶放入染色液中,室温染色12 hr;加入脱色液,置于80 r

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论