精准用药治疗奶牛乳房炎技术规程-编制说明

1、精准用药治疗奶牛乳房炎技术规程编制说明一、项目来源、起草单位和起草人本标准是根据“内蒙古自治区市场监管局关于下达2020年第2批内蒙古自治区地方标准制修订项目计划的通知（内市监标准字2020166号）”，由内蒙古自治区农牧业科学院组织有关科技人员，制定精准用药治疗奶牛乳房炎技术规程。由内蒙古自治区农牧业科学院提出并起草；主要起草人为王丽芳、姚一萍、史培、张三粉、宋洁、钟华晨、杨健、郭晨阳、连海飞、羿静、冯小慧。二、制定本标准的目的意义奶牛乳房炎不仅给乳制品加工业带来巨大损失，而且还危害公共卫生安全和人类的健康。几十年来世界各地把抗生素列入治疗乳房炎的首选药物，然而由于长期反复使用，使病原体对药

2、物产生了耐药性，降低了疗效，且使奶中抗生素的残留增加，严重危害人类健康（Oliveira等,2015），每年约有70万人死于多重耐药细菌的感染（Krmker等,2017）。因此采用精准用药，减少细菌耐药性产生具有重要意义。三、制定标准的依据本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草，以实用性、科学性和可操作性为基本原则。本标准的主要参数，在对奶牛乳房炎治疗时，建议优先选择耐药率R5%的药物，其次是25%R5%的药物，主要技术指标来源于农业农村部奶产品质量安全风险评估重大专项“生鲜乳中乳房炎源病原微生物耐药性评估”和内蒙古自治区科技成果转化项目“植物提取物对奶牛乳房炎防控技术示范推广”。四

3、、编制过程（一）、标准制定过程 根据农业农村部奶产品质量安全风险评估重大专项“生鲜乳中乳房炎源病原微生物耐药性评估”和内蒙古自治区科技成果转化项目“植物提取物对奶牛乳房炎防控技术示范推广”的要求，主要起草人于2018年上半年查阅了国内外相关文献，确定了实施方案，根据实施方案的具体要求，对乳房炎源生鲜乳中大肠杆菌等病原微生物进行了分离鉴定和药敏试验，建立了耐药菌谱图；进一步于2019年在实施内蒙古自治区科技成果转化项目“植物提取物对奶牛乳房炎防控技术示范推广”中，在奶牛养殖场进行了推广示范。结果表明，奶牛养殖场应用本规程，可以精准选择药物，减少了牛奶中抗生素的残留，降低了耐药性产生，有效防控了奶

4、牛乳房炎的发生。根据试验结果，形成精准用药治疗奶牛乳房炎技术规程初稿，然后由主要起草人牵头成立标准起草组，形成工作组讨论稿；于2020年8月编制形成了征求意见稿。（二）、试验过程1 试验材料1.1 仪器设备电子天平、高压灭菌锅、生物安全柜、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、高速离心机、小离心机、PCR仪、微波炉、DNA电泳设备、凝胶成像系统、麦氏比浊仪、移液器（包括多通道300l，单通道5 ml/1 ml/200 l/10 l/2.5 l）、-20冰箱、-80冰箱。1.2 试剂耗材乳头药浴液、70%酒精棉球、实验服、一次性乳胶手套、口罩、纸巾、无菌10 ml、50 ml离心管、封口膜、试管架、泡沫箱

5、、冰袋、记号笔、5%绵羊鲜血平板（BHI琼脂加5%绵羊血，需要自行配制）、无菌血清、脑心浸液肉汤、LB肉汤、60%无菌甘油（使用分析纯甘油与双蒸水配制，配制后进行灭菌）、双蒸水、5 ml/1 ml/ 200 l/10 l 灭菌枪头、2 ml灭菌离心管、9 cm直径的培养皿、1l和10 l两种规格的无菌接种环，锥形瓶、量筒、16 S rDNA引物、PCR试剂盒、及电泳胶制备所需试剂、DNA marker、MHB肉汤、比浊管、质控菌株ATCC 29213/25922。1.3 药敏板96孔组合式药敏MIC&MBC测试盒（冻干型）购买自天津市金章科技发展有限公司，产品信息详见说明书。2 试验方法2.1

6、 病料采集 采集患乳房炎病畜乳457批次。2.2 细菌的分离、纯化、保存2.2.1分离将奶样混匀，用无菌接种环蘸取奶样，划线接种到直径为9 cm的5%绵羊血琼脂平板，将平板放在 37 的恒温培养箱中培养，剩余的奶样置于4冰箱中保存，备用。24 48 h后观察菌落生长情况及形态特征，并做好记录。2.2.2纯化用1 l的无菌接种环挑取典型单个菌落， 接种到不同的肉汤中于 37 恒温摇床培养箱中增菌培养。8 16 h后用1 l的无菌接种环在血平板上进行划线培养，将平板放在 37 的恒温培养箱中培养 24 48 h。若无杂菌生长则认为该细菌已是纯化的细菌，若有杂菌生长则需重新纯化。2.2.3分离菌保存

7、从血平板上挑取已经纯化的典型单个细菌接种到肉汤中，于 37 恒温振荡培养箱中增菌培养8 16 h，按照400 l菌液加入200 l 60%无菌甘油的比例进行菌种保存，充分混匀，制成终浓度为20%的甘油菌，封口，做好标记-80冰箱冷冻保存。2.3 病原菌分子生物学鉴定 2.3.1 细菌基因组DNA的小量提取用水煮法或细菌基因组 DNA 小量提取试剂盒进行提取（具体方法参照分子克隆指南或相关产品说明书）。2.3.2 16S rDNA基因的PCR扩增以提取出的细菌基因组DNA为模板，根据GenBank上的DNA序列设计通用引物.其引物序列为：Bacterial 16s-F：ACGCGTCGACAGA

8、GTTTGATCCTGGCT，Bacterial 16s-R：CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT。反应程序为：94预变性5 min；94变性45 s，55 退火45 s，75延伸90 s，反应进行30个循环；72延伸10 min。预期目的条带大小为1500 bp。2.4 药敏试验采用肉汤稀释法，测定地方分离菌对抗菌药物的MIC值及耐药性。2.4.1 测试药物种类的选择根据牧场常用的乳房炎防治药物，参照美国临床和实验室标准化协会（CLSI）或欧盟药敏试验标准（EUCAST）推荐的药敏检测技术规程对已分离鉴定的葡萄球菌、链球菌、肠杆菌科细菌等主要乳房炎病原菌进行药物敏感性实验（

9、最小抑菌浓度，MIC），监测的药物种类见表1。表1 奶牛乳房炎病原菌监测药物种类病原菌类别监测药物种类病原菌类别监测药物种类革兰氏阳性菌（葡萄球菌、链球菌、芽孢杆菌等）青霉素氨苄西林阿莫西林/克拉维酸钾苯唑西林头孢噻吩头孢噻呋红霉素克林霉素庆大霉素多西环素氟苯尼考利福昔明万古霉素环丙沙星磺胺异恶唑复方新诺明革兰氏阴性菌（大肠杆菌、绿脓杆菌、不动杆菌等）氨苄西林阿莫西林/克拉维酸钾头孢噻吩头孢噻呋美罗培南链霉素卡那霉素庆大霉素四环素多西环素氟苯尼考多粘菌素E利福昔明环丙沙星磺胺异恶唑复方新诺明2.4.2 受试菌液制备挑取已经鉴定的单个菌落接种到肉汤中（肠杆菌用MH肉汤，葡萄球菌用MH肉汤，链球菌

10、用含5%血清的MH肉汤），置于37 恒温摇床培养箱中培养。葡萄球菌培养8 12 h左右、 链球菌培养20 24 h左右，肠杆菌科则培养4 6 h左右。随后使用比浊仪检测菌液的浓度，最终制成0.5个麦氏浊度单位的细菌悬浊液（约1108 CFU/mL）。将0.5个麦氏浊度单位的细菌悬浊液稀释1000倍，此时细菌悬浊液（约1105 CFU/mL），此后将100 l的细菌悬浊液加入100 l的稀释药物中（约5104 CFU/mL）。制备好的细菌悬浊液在30 min内接种并培养。2.4.3 最小抑菌浓度（MIC）检测采用CLSI推荐的微量肉汤（测试链球菌科时在肉汤中加入5%的血清）稀释法测定细菌对药物敏

11、感性，具体步骤如下：2.4.3.1移液器吸取先吸取100 l无菌肉汤加入到第12孔中，作为空白对照，然后吸取100 l稀释好的菌液依次加入到96孔反应板的第1 11孔中。2.4.3.2 在37 恒温培养箱中培养16 h 20 h，进行MIC结果的读取。2.4.3.2.1 只加细菌孔生长良好且只加MH肉汤孔无细菌生长时，可进行下一步。2.4.3.2.2 细菌对某种药物的MIC，即细菌抑制细菌生长的最低抑菌浓度，一般判定是参考细菌生长孔前一孔的浓度，即为MIC值（用甲氧苄啶和磺胺类药物进行测试时，培养基中的拮抗剂容易导致微生物的少量生长；所以，当相比对照孔某一孔的药物浓度能抑制80%的微生物生长时

12、即可判定该浓度为终点浓度）。2.4.4 数据处理先确定大肠杆菌ATCC25922标准菌株、金黄色葡萄球菌ATCC29213标准菌株的MIC数据是否符合质控（表2）要求，在此基础上确认各菌株的MIC检测结果有效性。表2 常规质量控制表格药物名称金黄色葡萄球菌ATCC29213大肠杆菌ATCC25922青霉素0.25-2-氨苄西林0.5-22-8阿莫西林/克拉维酸钾（2：1）0.12/0.06-0.5/0.252/1-8/4苯唑西林0.12-0.5-头孢噻吩0.12-0.54-16头孢噻呋0.25 1.00.25 1红霉素0.25-1-克林霉素0.06-0.25-庆大霉素0.12-10.25-1多

13、西环素0.12-0.50.5-2氟苯尼考2 82 8利福昔明0.004-0.0154-16万古霉素0.5-2-环丙沙星0.12-0.50.004-0.015磺胺异恶唑32-1288-32复方新诺明0.5/9.50.5/9.5美罗培南0.03-0.120.008-0.06链霉素-卡那霉素1-41-4四环素0.12-10.5-2多粘菌素E-0.25-2注：“-”代表无质控标准。3、结果11表3 革兰氏阳性菌药敏试验结果克林霉素红霉素头孢噻呋头孢噻吩苯唑西林奥格门汀氨苄西林青霉素复方新诺明磺胺异恶唑环丙沙星万古霉素利福昔明氟苯尼考多西环素庆大霉素L1321280.250.51281/0.58320.

14、12/2.4320.251284110.25J10.250.25210.251/0.5240.25/4.86480.50.25110.25J212812810.250.51/0.52160.12/2.41680.50.2520.250.25J30.250.250.50.250.250.25/0.12180.12/2.4163210.2520.250.5J40.251280.250.250.250.5/0.25480.12/2.416320.50.2520.250.25J50.251280.250.511/0.516160.12/2.416320.50.2520.250.25L2321280.2

15、50.250.250.25/0.120.250.250.12/2.480.50.50.251161L3321280.250.250.250.25/0.120.250.250.25/4.81610.50.5184L40.250.250.250.250.250.25/0.120.250.250.12/2.4410.50.251160.25L50.250.250.250.250.250.25/0.120.250.250.25/4.840.250.250.51160.25注：数值代表MIC值。J表示金黄色葡萄球菌，L表示无乳链球菌。表4 革兰氏阴性菌耐药性试验结果庆大霉素卡那霉素链霉素美罗培兰头孢噻呋

16、头孢噻吩奥格门汀氨苄西林复方新诺明磺胺异恶唑环丙沙星利福昔明多粘菌素E氟苯尼考多西环素四环素D10.5210.250.582/142/3864320.50.51622D24163212162/120.12/2.4640.25464441D41210.250.2542/120.12/2.4320.250.250.25241D41140.250.2581/0.510.12/2.420.250.250.5232128D5322561280.25412864/3212864/120810240.25320.5832128D60.25110.250.2588/440.12/2.420.250.250.2

17、50.541D70.5240.250.584/240.12/2.41280.250.251442D8322561280.251281288/412864/120810240.258241632K10.251160.250.512832/16160.5/9.510240.25812816K20.25120.250.2521/0.5320.12/2.480.2540.511632D90.5240.25112832/1680.12/2.4160.2581482D1082561280.2512812816/81280.25/4.8160.2512811281616D110.5240.250.2584/

18、2416/3045120.2580.541632D120.2521280.2512812816/812864/120810240.254241616D130.2580.254148/420.25/4.8440.250.5844D1464256128212812816/812864/120810241128112832128D150.25240.25184/240.12/2.4640.2540.52816D160.5280.250.582/120.12/2.4320.2541482D170.25440.250.584/240.25/4.8640.2540.5444D180.25140.250.2

19、542/120.12/2.4320.2520.5442K10.5240.250.2512/1160.12/2.4160.2516411616K211620.250.524/2160.12/2.4640.25161141K30.251620.250.2514/2160.12/2.41280.25161141注：数值代表MIC值。 D表示大肠杆菌，K表示克雷伯氏菌。（四） 主要参考文献1. 杜琳,王丽芳,冯小慧,张三粉,宋洁,姚一萍,史培.奶牛乳房炎克雷伯氏菌的分离鉴定及药敏试验J.黑龙江畜牧兽医,2019(01):77-80+180.2. 杜琳,王丽芳,冯小慧,张三粉,宋洁,姚一萍,史培,申捷.我国部分地区奶牛乳房炎主要病原菌的分离鉴定及药敏试验J.动物医学进展,2018,39(03):124-128.五、采用国际标准本标准未采用国际标准。六、与现行法律法规和强制性标准的关系为贯彻落实党的十九大精神，紧紧围绕实施乡村振兴战略和党中央、国务院关于农业绿色发展的总体要求，加快推进养殖业绿色发展，大力推进质量兴农绿色兴农品牌强农，农业农村部农办医201813号文件中规定，开展兽用抗菌药使用减量化行动试点工作，以减少抗生素的滥用和乱用。本标准采用精准用药以防治奶牛乳房炎的发生，因此完全符合现行法律法规和强制性标准，不存在任何与现行法律法规