《蔬菜中三唑磷残留的测定 酶联免疫吸附法》编制说明

贵州省食品安全地方标准蔬菜中三唑磷残留的测定酶联免疫吸附法编制说明（征求意见稿）北京勤邦生物技术有限公司1、任务来源本标准的制定是根据“贵州省重大科技专项计划项目”“贵州省茶叶、蔬菜质量安全评价、检测、预警与可追溯关键技术研究与应用”项目要求而确定的，同时根据贵州省卫生和计划生育委员会办公室关于同意贵州苕粉等25项贵州省食品安全地方标准立项的通知（黔卫计办函201594号）文件的通知要求，我单位承担的茶叶、蔬菜中三唑磷残留的快速检测酶联免疫吸附法贵州地方标准于2015年11月获得立项。2、标准制定的背景和必要性三唑磷，又名三唑硫磷，英文通用名TRIAZOPHOS，化学名称O,O二乙基O1苯基1,2,4三唑3基硫代磷酸酯。纯品为浅棕黄色液体，20时在水中的溶解度为3040MG/L，可溶于大多数有机溶剂；对光稳定，在酸、碱介质中水解，140分解。三唑磷具有强烈的触杀和胃毒作用，杀虫效果好，杀卵作用明显，渗透性较强，无内吸作用，是一种中等毒性、广谱有机磷杀虫剂、杀螨剂，兼有一定的杀线虫作用，已在我国水稻、棉花、蔬菜和苹果等作物上登记，主要用于防治粮食、棉花、果树、蔬菜等主要农作物上的许多重要害虫。由于三唑磷的应用效果好，相对甲胺磷等高毒农药其毒性低，因此，在农作物上应用较广泛。然而，三唑磷的大量使用也给一些食用农产品及环境带来了残留问题。三唑磷属有机磷农药，中等毒性，对神经、肝、肾、心、肺及生殖系统等多脏器均有明显的毒副作用，其中毒主要机理是抑制胆碱酯酶的活性。欧盟规定三唑磷最大残留限量（MAXIMUMRESIDUELIMIT，MRL）为不得检出的农药品种；日本“肯定列表制度”中规定，除了小麦、大麦、黑麦、玉米、荞麦、其他粮谷、棉籽和棉籽油设定了最大残留限量，其余适用“一律标准”，即001MG/KG；我国国家标准GB27632016食品安全国家标准食品中农药最大残留限量中限定三唑磷的MRL为稻谷、麦类、旱粮类等谷物005MG/KG，棉籽及结球甘蓝、节瓜等蔬菜01MG/KG，柑橘、苹果、荔枝等水果02MG/KG。因此，建立三唑磷残留的快速检测技术，加强监测、科学使用三唑磷，对于保障人类健康与食品安全，降低环境污染，减少对农副产品出口产生的影响等具有重要意义。贵州属于传统的农业省，农业人口和农业产业比重较大。近年来，我省充分发挥资源优势，加大农业结构调整力度，突出抓好蔬菜等优势特色产业。蔬菜面积1763万亩，蔬菜已成为我省农业结构调整的支柱产业和农民收入的主要来源。然而随着我省蔬菜产业的不断发展壮大，质量安全也逐渐凸显。蔬菜中残留的农药会通过食物链进入人体，危害人类健康，而且农产品会因质量安全问题被进口国（地区）拒绝、扣留、退货、索赔和终止合同，制约我省的经济发展。因此，加强蔬菜等农产品中三唑磷等农药的检测和控制是一项刻不容缓的工作。本项目建立三唑磷的酶联免疫吸附（ELISA）法，采用特异性强的单克隆抗体，检测灵敏度可达到1G/KG，对蔬菜样本的最低检测限为50G/KG，满足我国国家标准规定的最大残留限量，样本加标回收率为60120，检测结果准确度高，并且该方法具有特异性强、快速方便、不需要昂贵仪器设备等优点，适合大批量样品的集中快速筛查，可为我省蔬菜等农产品的质量安全监管控制提供技术支撑和重要保障，对我省食品安全快速检测方法的发展具有重要意义。3、国家标准、行业标准以及其他省外标准的制定发布情况在国际标准化组织（ISO）标准体系、国际分析化学师协会（AOAC）标准体系和欧盟标准委员会（CEN）标准体系中，均尚未检索到单独针对三唑磷的检测方法标准；我国标准体系中提供的测定蔬菜中三唑磷的方法均是多残留检测方法，有国家标准（GB/T50092182008、GB/T207692008）、行业标准（NY/T13792007、NY/T7612008、SN/T01482011）和地方标准（DB34/T10762009），主要采用液相色谱法、液相色谱质谱法、液相色谱串联质谱法、气相色谱法和气象色谱质谱法等分析仪器检测方法。这些仪器法具有检测度高、灵敏度高、稳定性好等优点。但仪器方法的推广具有一定的局限性，仪器昂贵、操作方法繁琐耗时，不适合用于现场监管和企业大规模质量筛查，不能满足农业大省贵州省质量监管部门以及企业对蔬菜中三唑磷的现场快速筛选、检测需求。4、主要工作过程、主要编制成员、参加成员1、主要工作过程该标准由北京勤邦生物技术有限公司（以下简称勤邦生物）组织专家成立了标准编制工作组，并负责编制起草工作，确定标准的主要技术内容。编制组成立后，进行了广泛的调查和研究工作，主要包括以下几个方面（1）详细查阅了国内、国外有关标准和相关专业期刊上发表过的参考文献等技术资料，并对这些资料进行了详细的对比，从方法的先进性、可靠性和实用性等几个方面考虑，选取了几个代表性的参考资料作为标准起草中的主要技术参考文本。（2）及时购置相关的实验试剂、标准品和其他材料；已得到三唑磷半抗原；将三唑磷半抗原与牛血清白蛋白和卵清蛋白分别进行偶联得到免疫原和包被原；已将制备获得的抗原通过免疫小鼠获得三唑磷单克隆抗体；完成抗原抗体筛选、配对，获得最优抗原、抗体稀释倍数组合；建立了酶联免疫吸附法的反应体系，摸索不同条件对方法进行最优化，最终确定了最佳的检测方法。（3）针对蔬菜样品与其他参考资料中样品之间的差异，开展多种蔬菜酶联免疫吸附法的试验，包括白菜、胡萝卜，这是方法的重要步骤和关键环节。不同样品用同一种方法进行试验和验证，确保本检测方法能够灵敏、特异、准确地检测出蔬菜样品中三唑磷的含量。如方法的检测限，对20份空白样本进行检测，以检测结果的平均值加上3倍标准差来确定检测限；方法的准确率，通过对50G/KG、100G/KG、200G/KG三种浓度添加的蔬菜样本进行检测，得到本检测方法的回收率，盲样测定与仪器方法的结果进行比对，确保本方法的检测结果可靠。（4）在技术指标完成试验工作之后，严格按照标准样本的格式，起草编写标准文本内容和编制说明内容。2、主要成员、参加成员序号标准名称主要编制成员参加成员1蔬菜中三唑磷残留的测定酶联免疫吸附法贵州省农产品质检中心、北京勤邦生物技术有限公司蔡韬、冯才伟、扶胜、李占斌、张莉、陆洋、袁旭、卢平、王震、周雪莉、罗华兰、丁静五、标准主要内容确定的依据1、主要技术内容确定的依据技术内容确定的依据方法的检测限为50G/KG，主要是依据我国国家标准GB27632016食品安全国家标准食品中农药最大残留限量中限定三唑磷的MRL为稻谷、麦类、旱粮类等谷物005MG/KG，棉籽及结球甘蓝、节瓜等蔬菜01MG/KG，柑橘、苹果、荔枝等水果02MG/KG。因此，本方法的检测限能够符合相关部门的要求。方法的定量限、准确率、特异性等技术指标确定主要依据一是兽药残留检测试剂盒（条、卡）备案技术资料要求及审查工作程序的规定要求；二是农业部农牧发20031号文件“关于发布兽药残留试验技术规范（试行）的通知”中的规定要求；三是按照国际食品法典委员会（CAC）通用要求。其他参数、公式、性能要求、实验方法、检验规则等主要依据包括GB/T112009标准化工作导则第1部分标准的结构和编写规则ISOIECDIRECTIVES,PART3,1997,RULESFORSTRUCTUREANDDRAFTINGOFINTERNATIONALSTANDARD,NEQ；GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。2、标准技术内容和技术指标的论证21酶联免疫吸附法主要材料制备211半抗原的合成三唑磷是小分子物质，不具备免疫原性，只有反应原性，需与大分子载体蛋白共价结合后才能使动物免疫系统识别，产生相应的抗体。本研究先对三唑磷小分子进行结构改造获得半抗原，然后将半抗原与载体蛋白（BSA、OVA等）偶联制备人工抗原。具体操作如下100ML三口烧瓶中加入10ML二氯甲烷和05当量的三唑磷，降温至5，搅拌下加入101当量的乙酰氯，控温加入2当量的三氯化铝，控温5反应6小时后，加稀盐酸和冰水，乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥有机相，减压蒸干溶剂，石油醚乙酸乙酯体系重结晶得乙酰化物。100ML三口烧瓶中加入上步乙酰化物，10ML吡啶溶解，加12当量的羧甲基羟胺，65反应5小时，乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥有机相，减压蒸馏，得到半抗原产物，经核磁鉴定，结构正确，鉴定图谱如下024681012PPM图1三唑磷半抗原结构式鉴定氢谱图212抗原的合成2121免疫原的合成将三唑磷半抗原与牛血清白蛋白进行偶联得到免疫原，具体操作如下取5MG三唑磷半抗原用1MLDMF溶解，取30MGEDC和NHS用02ML水充分溶解后加入三唑磷半抗原溶液中，室温下搅拌24H，即可得到反应液A；称取50MGBSA充分溶解在38MLPBS（PH72）中，将反应液A逐滴缓慢加到蛋白溶液中，于室温下搅拌24H；用001MOL/LPBS于4透析3D，每天换液34次，以除去未反应的小分子物质；分装，于20保存备用。2122包被原的合成将三唑磷半抗原与卵清蛋白进行偶联得到包被原，具体操作如下取5MG三唑磷半抗原用1MLDMF溶解，取30MGEDC和NHS用02ML水充分溶解后加入三唑磷半抗原溶液中，室温下搅拌24H，即可得到反应液A；称取50MGOVA充分溶解在38MLPBS（PH72）中，将反应液A逐滴缓慢加到蛋白溶液中，于室温下搅拌24H；用001MOL/LPBS于4透析3D，每天换液34次，以除去未反应的小分子物质；分装，于20保存备用。2123三唑磷免疫原与包被原的鉴定方法确定偶联是否成功一般通过紫外扫描法鉴定半抗原与载体蛋白的偶联是否为有效偶联，因为半抗原与蛋白在紫外下有不同的特征吸收，当偶联成功时，偶联物的紫外吸收会有二者的叠加效应出现，因此比单独的蛋白特征吸收会发生一定的偏移，可用于检测偶联是否成功。偶联比的测定用纯水稀释三唑磷半抗原、BSA、OVA及两种蛋白与三唑磷半抗原的结合物，配制成一定浓度的溶液，然后用紫外分光光度计进行全波长扫描，得到它们的紫外吸收光谱图。根据公式KA/CL分别计算出三唑磷半抗原、BAS、OVA的摩尔消光系数。在载体蛋白和三唑磷半抗原的最大波长处检测偶联物的光吸收值，按公式计算两种物质在偶联物中的摩尔浓度比，即偶联比CA/CB（A偶264KBSA280A偶280KBSA264）/（A偶280K三唑磷264A偶264K三唑磷280）蛋白含量的测定将偶联物稀释到适当倍数后，测定280NM和260NM的分光光度值，按公式计算蛋白的浓度即偶联物的浓度蛋白质（MG/ML）145OD280074OD260免疫原和包被原的鉴定结果将三唑磷半抗原、载体蛋白以及两者的结合物配制成一定浓度的溶液，然后用紫外分光光度计进行全波长扫描，经过计算分析得到人工抗原的结合比和浓度。三唑磷BSA和三唑磷OVA结合比分别为15和17。213抗体的制备2131动物免疫以三唑磷BSA作为免疫原，免疫雌性BALB/C小鼠（810周龄）。免疫方案如下首免时，每只小鼠用150G的三唑磷BSA（以载体蛋白计）与FCA按13比例混合制成的乳化剂，颈背部皮下多点注射；二免和三免时，将FCA换成FICA，剂量和方法同上。每次免疫间隔时间为2周。融合前3天每只小鼠腹腔注入100G三唑磷BSA进行加强免疫。2132单克隆抗体的制备三免后第7天，采血清测效价。效价达16105以上的小鼠于四免后第12天，摘除眼球放血，并分离阳性血清作对照。无菌操作取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合（比例数81）。融合剂为聚乙二醇（PEG）4000，作用2MIN，随后即加入20ML无血清的1640营养液（时间4MIN）。离心后，用20ML完全营养液悬浮混匀。将细胞悬液分别加入已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中（4板），01ML/孔置37饱和湿度、含5CO2的培养箱中培养。待细胞长至孔底的1/21/3时，用间接竞争ELISA方法筛选。阳性细胞迅速扩大培养并采用有限稀释法进行亚克隆。1014天后，取细胞上清检测，计算阳性率。阳性率100时，得到稳定的细胞株。采用体内诱生腹水法进行大量单克隆抗体的制备，将BALB/C小鼠（68周龄）腹腔注入灭菌石蜡油05ML/只，10天后，再注入阳性细胞1106个/只，植入细胞后第7天起，每天观察小鼠腹部，待小鼠腹部明显膨大，用9针头穿刺腹腔抽取腹水。每只小鼠可采腹水约23ML/次。离心去脂肪层和细胞层后，用饱和硫酸铵法纯化，分装冻存。阳性细胞经过3次亚克隆，阳性率达90，得到了2株稳定分泌单克隆抗体的细胞。22检测方法的建立221抗原、抗体的筛选1）用常规包被液（PH96，005MOL/L的碳酸盐缓冲液）将1、2、3抗原分别进行11104、13104、19104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，PBST洗液洗涤1次，用常规封闭液（PH72，含有5卵清蛋白，5奶粉，01MOL/L磷酸盐缓冲液）封闭，37恒温避光反应2H，甩干；2）向板孔中加入三唑磷标准品溶液50L，用常规酶标二抗稀释液（PH72，6山羊血清，02MOL/L磷酸盐缓冲液）稀释12000的酶标二抗50L，用常规抗体稀释液（PH72，含有8牛血清白蛋白，01MOL/L磷酸盐缓冲液）稀释12104，14104，18104，116104的1、2、3抗体各50L，25反应30MIN，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物液A液和B液各50L，25反应15MIN，加入50L终止液终止；4）按以上操作方法，分别测定零标准品OD值及0025G/L标准品的OD值，计算抑制率，以零标准品OD值为1520，0025G/L标准品抑制率为7080作为评定标准，选择较好的抗原抗体组合和抗原抗体工作浓度见表1（A）（C）。表1（A）方阵法确定最佳的抗原、抗体及最佳的工作浓度（表格中W表示1104）1抗原2抗原3抗原抗体稀释倍数检测项目11W13W19W11W13W19W11W13W19W0G/L标准品OD值21481951684210717581523262321418491G/L标准品OD值1936166314721915158126422691727168512W抑制率（）9085879089838681910G/L标准品OD值179616171481765149713162120186316721G/L标准品OD值1815148212361649123810751707154615114W抑制率（）10191839382818182900G/L标准品OD值1583139413051489135212431654143812951G/L标准品OD值14391275103613751147097814761354129318W抑制率（）9091799284788994991抗体116W0G/L标准品13511183104912781049092714411741046OD值1G/L标准品OD值11709540707095608610603125309480762抑制率（）868067748265878072表1（B）方阵法确定最佳的抗原、抗体及最佳的工作浓度（表格中W表示1104）1抗原2抗原3抗原抗体稀释倍数检测项目11W13W19W11W13W19W11W13W19W0G/L标准品OD值248621781754316226620472054167812451G/L标准品OD值226916614928962143199821231436107812W抑制率（）91768491809710385860G/L标准品OD值205418721552648209716731735145113391G/L标准品OD值1881553126523721863161417071254094814W抑制率（）9182818988969886700G/L标准品OD值1593150613721783157613951505132811672抗体18W1G/L标准品OD值1318127308461814153114131911360926抑制率（）82846110197818785790G/L标准品OD值1346132710491544135211681337115209841G/L标准品OD值100309560587140610950845111810790685116W抑制率（）747255918072839369表1（C）方阵法确定最佳的抗原、抗体及最佳的工作浓度（表格中W表示1104）1抗原2抗原3抗原抗体稀释倍数检测项目11W13W19W11W13W19W11W13W19W0G/L标准品OD值3215278420932582217619682748225319861G/L标准品OD值28722168184523161909178325062034185712W抑制率（）8977888987909190930G/L标准品OD值25962231874214918541527223519471671G/L标准品OD值24671894170317651439106118931615150814W抑制率（）9584908277698482903抗体18W0G/L标准品OD值2148196514862072145613821873147313781G/L标准品OD值175416391492133411631054125412421065抑制率（）81831006480766784770G/L标准品OD值173415312491415128410961529136511071G/L标准品OD值158612850963134210590738127409590632116W抑制率（）918377948267837057由表1（A）（C）可知，2抗原13104稀释，3抗体14104稀释时，零标准品OD值在1520之间，1G/L标准品抑制率为77，均符合要求。222反应温度确定1）包被抗原用常规包被液将2抗原进行13104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，用PBST洗液洗涤1次，用常规封闭液封闭，37恒温避光反应2H，甩干；2）加样方式向板孔中加入50L标准品/样品溶液、50L用常规酶标二抗稀释液稀释12000的酶标二抗和50L用常规抗体稀释液稀释14104的3抗体，混匀，分别在25、37下反应30MIN，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物A液和B液各50L，25反应15MIN，加入50L终止液终止；4）按照以上操作方法，分别测定零标准品OD值、1G/L标准品OD值、空白白菜样本OD值，计算抑制率，以零标准品OD值为1520，空白蔬菜样本OD值接近零标准品OD值，抑制率在7080为判定标准，选择较好的反应温度（见表2）。表2反应温度的确定试验反应温度零标准品OD值1G/L标准品OD值抑制率（）空白白菜OD值251842130171182037213619149002281由表2可知，25条件下，加入50L标准品/样品溶液、50L酶标二抗和50L抗体工作液进行反应时，测定的零标准品OD值在1520之间，1G/L标准品的抑制率在7080之间，空白蔬菜样品的OD值与零标准品OD值偏差较小。223抗原、抗体反应时间确定1）包被抗原用常规包被液将2抗原进行13104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，用PBST洗液洗涤1次，用常规封闭液封闭，37恒温避光反应2H，甩干；2）加样方式向板孔中加入50L标准品溶液、50L用常规酶标二抗稀释液稀释12000的酶标二抗和50L用常规抗体稀释液稀释14104的3抗体，混匀，分别在25下避光反应15、30、60MIN，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物A液和B液各50L，25反应15MIN，加入50L终止液终止；4）按照以上反应方式，测定零标准品OD值，重复两次，每次做6个对照孔，计算不同反应时间测定值的变异度CV（见表3）。表3抗原、抗体反应时间确定抗原、抗体反应时间（MIN）153060测定项目第一次第二次第一次第二次第一次第二次1409147118391772193921741384156217161943223522971316139518221862156208215051306181418312107222513531441751177922921983OD值1477153717219032073235板内CV576531375662板间CV583859由表3可知，小分子抗原、抗体、酶标二抗按照上述量加入混匀后，25反应30MIN，零标准品OD值在1520之间，且变异相对较小。224底物液显色时间的确定1）包被抗原用常规包被液将2抗原进行13104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，用PBST洗液洗涤1次，用常规封闭液封闭，37恒温避光反应2H，甩干；2）加样方式向板孔中加入50L标准品/样品溶液、50L用常规酶标二抗稀释液稀释12000的酶标二抗和50L用常规抗体稀释液稀释14104的3抗体，混匀，25下避光反应30MIN，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物A液和B液各50L，25反应10、15、20或30MIN，加入50L终止液终止；4）按照以上反应方式，分别测定零标准品OD值，1G/L标准品OD值，空白蔬菜样本OD值，计算1G/L标准品的抑制率，以零标准OD值为1520，空白白菜样本OD值接近零标准品OD值，1G/L标准品抑制率在7080为判定标准，选择底物液显色时间（见表4）。表4底物液显色时间的筛选试验显色时间（MIN）零标准品OD值1G/L标准品OD值抑制率（）空白白菜OD值1014681158791534151960152478192820237218998021733025392322912340由表4可知，底物液显色时间为15MIN时，零标准品OD值在1520之间，空白白菜OD与零标准品OD值偏差较小，1G/L标准品的抑制率在7080。225包被液的筛选1）包被抗原用1、2、3、4包被液将2抗原进行13104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，用PBST洗液洗涤1次，用常规封闭液封闭，37恒温避光反应2H，甩干；2）加样方式向板孔中加入50L标准品溶液、50L用常规酶标二抗稀释液稀释12000的酶标二抗和50L用常规抗体稀释液稀释14104的3抗体，混匀，25反应30MIN，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物A液和B液各50L，25反应15MIN，加入50L终止液终止；4）按照以上反应方法，分别测定零标准品OD值，1G/L标准品OD值，每种包被液设置2次重复，以零标准OD值为1520，1G/L标准品抑制率在7080为判定标准，选择合适的包被液（见表5）。表5包被液筛选的试验（N2）1包被液2包被液3包被液4包被液零标准品平均OD值2216203174419511G/L标准品平均OD值203155912611313平均抑制率（）92777267由表5可知，当包被液为3时，零标准OD值为1744，在1520之间，1G/L标准品抑制率为72，在7080之间。226封闭液的筛选1）包被抗原用3包被液将2抗原进行13104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，用PBST洗液洗涤1次，用1、2、3、4封闭液封闭，37恒温避光反应2H，甩干；2）加样方式向板孔中加入50L标准品溶液、50L用常规酶标二抗稀释液稀释12000的酶标二抗和50L用常规抗体稀释液稀释14104的3抗体，混匀，25下避光反应30MIN，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物A液和B液各50L，25反应15MIN，加入50L终止液终止；4）按照以上反应方法，分别测定零标准品OD值，1G/L标准品OD值，每种封闭液设置3次重复，以零标准OD值为1520，1G/L标准品抑制率在7080为判定标准，选择合适的封闭液（见表6）。表6封闭液的选择试验（N3）零标准品平均OD值1G/L标准品平均OD值平均抑制率（）零标OD值CV1封闭液2177172379942封闭液1815150183813封闭液1653127977854封闭液1969178491126由表6可知，选择3封闭液时，零标准OD值为1653，在1520之间，1G/L标准品抑制率为77，在7080之间，且变异系数较小。227封闭条件筛选1）包被抗原用3包被液将2抗原进行13104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，用PBST洗液洗涤1次，用2封闭液封闭，37恒温避光反应2H、4恒温避光反应16H，甩干；2）加样方式向板孔中加入50L标准品溶液、50L用常规酶标二抗稀释液稀释12000的酶标二抗和50L用常规抗体稀释液稀释14104的3抗体，混匀，25下避光反应30MIN，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物A液和B液各50L，25反应15MIN，加入50L终止液终止；4）按照以上反应方法，整板测定零标准品OD值，重复测定2次。以零标准OD值为1520，变异相对较小且节省时间为判定标准（见表7）。表7封闭条件筛选（N2）封闭条件零标准品平均OD值零标准OD值板内CV零标准OD值板间CV37恒温避光反应2H185568694恒温避光反应16H17397074由表7可知，用2封闭液，在37恒温避光反应2H时，零标准OD值为1855，在1520之间，板内板间变异相差较小，实际操作更便利。228抗体稀释液的筛选1）包被抗原用3包被液将2抗原进行13104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，用PBST洗液洗涤1次，用2封闭液封闭，37恒温避光反应2H，甩干；2）加样方式向板孔中加入50L标准品/样品溶液，50L用常规酶标二抗稀释液稀释12000的酶标二抗和50L用1、2、3、4抗体稀释液稀释14104的3抗体，混匀，25下避光反应30MIN，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物A液和B液各50L，25反应15MIN，加入50L终止液终止；4）按照以上反应方法，分别测定零标准品OD值、1G/L标准品OD值、9G/L标准品OD值和9G/KG白菜样品OD值，每种抗体稀释液设置2次重复，以零标准OD值为1520、1G/L标准品抑制率在7080、9G/L标准品OD值和9G/KG添加的白菜样品OD值偏差较小为判定标准，确定抗体稀释液（见表8）。表8抗体稀释液的筛选试验（N2）零标准品平均OD值1G/L标准品平均OD值抑制率（）9G/L标准品平均OD值9G/KG蔬菜平均OD值1抗体稀释液1874143376061105942抗体稀释液2005156378068306033抗体稀释液1927163885052805764抗体稀释液165010896604620488由表8可知，1抗体稀释液测定的零标准OD值在1520之间，1G/L标准品抑制率为76，在7080之间，9G/L标准品OD值和9G/KG添加的白菜样品OD值偏差均较小。229酶标二抗稀释液及其最佳工作浓度的选择1）包被抗原用3包被液将2抗原进行13104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，PBST洗液洗涤1次，用3封闭液进行封闭，37恒温避光反应2H，甩干；2）加样方式向板孔中加入标准品溶液50L、用1、2、3酶标二抗稀释液分别进行11000、12000、13000稀释的酶标二抗50L和用1抗体稀释液稀释3抗体50L，混匀，25反应30MIN，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物液A液和B液各50L，25反应15MIN，加入50L终止液终止；4）按照以上反应方法，分别测定零标准品OD值，1G/L标准品OD值，计算抑制率，每种检测设置2次重复，以零标准品OD值为1520，1G/L标准品抑制率在7080为判定标准，选择合适的酶标二抗稀释液及最佳工作浓度（见表9）。表9酶标二抗稀释液及最佳工作浓度的选择（N2）稀释浓度零标准品平均OD值1G/L标准品平均OD值平均抑制率（）1100020281721851200017541508861酶标二抗稀释液1300014931147772酶标二抗稀释液11000216189488由表9可知，用2酶标二抗稀释液对酶标二抗以12000稀释时，零标准品OD值在1520之间，1G/L标准品抑制率在7080之间。2210稀释后的酶标二抗保存性试验用2酶标二抗稀释液对酶标二抗以12000稀释，置于37烤箱中保存，观察其在6D内的检测情况。1）包被抗原用3包被液将2抗原进行13104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，PBST洗液洗涤1次，用2封闭液进行封闭，37恒温避光反应2H，甩干；2）加样方式向板孔中加入标准品溶液50L、用2酶标二抗稀释液稀释12000的酶标二抗50L和用1抗体稀释液3抗体50L，混匀，25反应30MIN，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物液A液和B液各50L，25反应15MIN，加入50L终止液终止；4）按照以上反应方法，分别测定零标准品OD值，1G/L标准品OD值，计算抑制率，每种检测设置2次重复，以零标准品OD值开始值为1520且6D内下降幅度不大于25，1G/L标准品抑制率在7080为判定标准，考察稀释后酶标二抗的稳定性（见表10）。表10稀释后的酶标二抗保存性试验（N2）稀释液种类37保存时间零标准品平均OD值1G/L标准品平均OD值抑制率（）1天1937150478217801311744天16451152705天154111287336天1492106271由表10可知，2酶标二抗稀释液对酶标二抗以12000稀释后置于37烤箱中保存，零1200019461505771300014521149791100022692075911200018471586863酶标二抗稀释液130001615134483标准OD值开始值为1520且6D内下降幅度不大于25、1G/L标准品抑制率均在7080，满足要求。2211建立的检测方法的综合评价及标准曲线的建立1）根据上述方式选定的原材料的浓度、加样方式、反应温度、反应时间为分析条件，用浓度为0G/L、1G/L、3G/L、9G/L、27G/L、81G/L的三唑磷标准溶液进行ELISA检测，测定OD值。2）以三唑磷药物浓度对数值（LG三唑磷，G/L）为横坐标，各对应浓度的抑制率（B/B0）为纵坐标，制作标准曲线，计算回归方程及相关系数，根据线性方程计算IC50。以优化的ELISA条件，对所有浓度的标准溶液进行测定，每个浓度设置3个重复，根据测定结果制作标准曲线，测定零标准品OD值、IC50、变异系数、R2、1G/L标准品抑制率及对空白白菜样本添加50G/KG的回收率（见表11）。表11综合试验结果（N3）测定项目零标准品OD值IC50R21G/L标准品抑制率（）50G/KG白菜的回收率（）测定平均值186461099607985三唑磷标准品浓度（G/L）图2试剂盒标准曲线（标准品浓度分别为0，1，3，9，27，81G/L）23蔬菜样本前处理方法抑制率（）1）用均质器均质样本；2）称取白菜、胡萝卜试样10G005G于50ML聚苯乙烯离心管中，20ML甲醇，置于振荡器上振荡5MIN；3）3000R/MIN以上，2025离心5MIN；4）取上层有机相1ML至10ML洁净干燥的玻璃试管中，于5060水浴氮气流下吹干；5）加入90L甲醇，涡动10S,再加入910L复溶工作液，涡动1MIN，充分混合，取50L用于分析。24检测方法技术参数确定241灵敏度分别测定3个批次试剂盒标准曲线的IC50抑制浓度，确定该值浮动范围，测定结果见表12。表12三唑磷酶联免疫试剂盒IC50统计表批号IC50（G/L）第一批515256545958第二批52546535764第三批6495265953IC50的平均值55标准曲线IC50范围4664由以上测定结果可知，三唑磷酶联免疫快速检测试剂盒标准曲线IC50值的波动范围为4664G/L。最低检测限为三唑磷试剂盒测定实际样本的最小可检出量，其高低关系到试剂盒能否实际应用问题。由于在前处理过程中样本提取程序较多，而且受许多客观因素（样品的种类、样品来源地区、技术人员操作熟练程度等）影响，故回收结果有一定的差异。经测定后统计，本试剂盒符合该类试剂盒样本回收测定要求。结果见表13表14。表13空白白菜测定结果统计表（G/KG）样本号J1J2J3J4J5J6J7J8J9J10测定值15729023137025416822515856样本号J11J12J13J14J15J16J17J18J19J20测定值2331591484526117415615270392平均值163（检测限计算公式）标准差96最低检测限451LODX3其中X为重复测定空白样品的平均值，N为样品数量。表14空白胡萝卜测定结果统计表（G/KG）样本号J1J2J3J4J5J6J7J8J9J10测定值124213122613912121735357124样本号J11J12J13J14J15J16J17J18J19J20测定值2553281022322191331932321255平均值178（检测限计算公式）标准差98最低检测限473LODX3其中X为重复测定空白样品的平均值，N为样品数量。总结本试剂盒空白白菜的最低检测限为451G/KG，空白胡萝卜的最低检测限为473G/KG。242准确度和精密度准确度是指测定值与真实值间的符合程度，试剂盒的准确度常用回收率表示；精密度是反映测定方法对某一特定样品多次测定所得结果的重复程度，常用变异系数表示。以50G/KG、100G/KG、200G/KG三个浓度分别对白菜、胡萝卜样品进行添加回收试验，每种样品做6个平行，每个样本重复2次，计算添加样本回收率和批内、批间变异系数，结果见表15。表15样品准确度及精密度试验添加浓度123456回收率平均值批内CV批间CVNX2X2NN1NX2X2NN1白菜实测值375547254345532542354375回收率7519458691065847875892108实测值422545555205491538053945回收率8459111041983761789888113实测值4624885239544243350回收率9249761047988486691388107实测值8428271042910722770回收率84282710429172277852121实测值8768279829147211127回收率8768279829147211127908139实测值801822904791102895100回收率80182290479110289588398127实测值183514242128164516121754回收率917571210648225806877866126实测值19172017150418031618141回收率9585100857529015809705856128实测值18371402156118391921986200回收率91857017805919596993879128128胡萝卜实测值468540853735394547355335回收率9378177477899471067884124实测值379548653955369550494765回收率75997379173910098953871126实测值4344735349144139350回收率86894610698288278692195121实测值85597103173970754回收率85597103173970754841146实测值7398828319511042792回收率7398828319511042792873116实测值858018168888171048100回收率85801816888817104887097125实测值18351492146815091922017200回收率917574673475459610085853131115实测值160717921737179618991606回收率80358968685898949580387061实测值14691541724210819591835回收率734577862105497959175886126在50G/KG、100G/KG和200G/KG浓度处的准确度范围为70110，批内、批间变异系数均小于15。243仪器比对随即抽取白菜、胡萝卜样品各20份，用本方法和仪器方法分别进行检测。仪器方法按照GB/T50092182008水果和蔬菜中多种农药残留量的测定中所述的检测方法，方法的检出限为100G/KG。本检测方法对白菜、胡萝卜样品的检测限为50G/KG。两种样本均以仪器方法检出限为阳性判定线，低于阳性判定线的值，检测结果以“”表示，高于或等于阳性判定线的值以实际检测结果表示，结果见表16表17。表16仪器比对结果（白菜样本）单位G/KG样品试剂盒气相色谱质谱样品试剂盒气相色谱质谱11121212481305