荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用

荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用随着分子生物学、有机化学以及材料科学等学科的进展，最近我们又获得了好几种新型的荧光蛋白标签，这些标签可以用于细胞生物学成像研究。本文将对荧光标志物在蛋白质研究中的优势及劣势进行一番详细的介绍，文章中将重点介绍如何使用荧光标志物研究活体细胞（而不是固定细胞）中的靶蛋白。使用该方法可以对靶蛋白的表达情况、细胞中的定位情况、活性状态等指标进行研究，还将介绍将荧光显微镜与电子显微镜技术相结合的可行性问题。小分子荧光标志物染料、纳米晶体材料，即所谓的“量子点（quantum dots）”材料、自发荧光蛋白、小分子蛋白质标签等等这些材料都可以作为荧光标志物，而且将这几种材料“混合”起来是一种非常有前途的荧光标志物研究新思路。我们使用荧光技术来研究细胞生物学已经好多年了，而且在从微小的分子层面到完整的有机体层面等各个层面都可以使用荧光技术进行研究。最开始使用的方法是将小分子有机染料与各种抗体相连接，来研究各种目的蛋白。不过这种使用抗体的方法如果需要对细胞内的蛋白质进行研究时，还需要对细胞进行固定和透化操作。因此后来又发展出可以直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧光标志物。在最近这 10 年里，荧光蛋白的出现使得进行非侵入性的活体细胞成像成为了可能。使用这种荧光蛋白标志物，我们可以研究目的基因的表达情况，蛋白质运输情况以及各种细胞内动态的生物化学信号通路。使用经过遗传修饰的小分子有机荧光标志物构建的混合系统，我们还可以对蛋白质的寿命进行研究，如果再结合电镜技术和快速光淬灭技术（rapidphotoinactivation）还可以对蛋白质的定位情况进行研究。与此同时，半导体纳米晶体材料技术也得到了高度的发展，现在，这种新型的材料在亮度和光稳定性方面都要比传统的荧光标志物好得多，只不过现在这种材料的靶向性还不是很好。本文中我们将对目前荧光标志物及其相关技术的发展进行介绍，同时还将介绍荧光标志物在蛋白质表达、蛋白质活性以及蛋白质功能研究工作中的作用进行介绍。荧光标志物小分子有机染料小分子有机染料是指分子量小于 1KD 的小分子物质，这种小分子有机染料可以通过与生物大分子共价连接的方式对其进行标记，我们现在对这种染料的最佳检测波长范围、亮度，即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性都有了比较详尽的了解。利用荧光染料的分子策略包括扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。现在市面上已经有数百种这类荧光染料的商业化产品可供选择，而且还在不断增加之中。不过由于这类染料对蛋白质缺乏特异性，因此多与抗体联用（图1AC）。荧光蛋白第一批用于细胞生物学的荧光蛋白包括藻胆蛋白（phycobiliproteins）和从蓝藻（cyanobacteria）中提取的触角光合色素（photosynthetic antenna pigments）。这些生物大分子都含有多种胆汁三烯生色基团（bilin chromophores）。这些生色基团都包裹在一种基质结构中，这样就能将它们的淬灭作用降至最小，因此这些藻胆蛋白的荧光亮度要比小分子荧光染料的亮度高出两个数量级。不过这些藻胆蛋白的“个头（分子量高达 200KD）”也限制了它们在细胞内的扩散，因此，它们也只能与抗体联用，在流式细胞术试验或 ELISA 试验中用来检测细胞表面的蛋白质分子。不过如果能将这些藻胆蛋白在细胞中原位表达，那么它们的用途就会大为扩展，但问题在于胆汁三烯生色基团必须依赖脱辅基蛋白（apoproteins ）的作用。不过令人高兴的是，我们已经在这方面取得了一些成绩。自从科学家从维多利亚发光水母（jellyfish Aequorea victoria）中发现了绿色荧光蛋白（GFP）之后，生物成像领域就发生了革命性的改变。单独表达绿色荧光蛋白或与其它蛋白融合表达就可以在细胞内发出绿色荧光了，使用这种方法除了需要氧气 O2 之外，不再需要任何其它的试剂参与，因为生色基团是通过自发环化作用形成的，需要对深埋在直径约 2.4 纳米至 4 纳米的 桶（beta barrel）核心里的三个氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-氨基乙酸）进行氧化才能发出荧光。绿色荧光蛋白只是荧光蛋白大家族中的一员，这些荧光蛋白大部分都来自海洋腔肠动物，因为各自含有共价结构不同以及非共价环境不同的生色基团，所以可以发出不同颜色的荧光。在实验室中对这些荧光蛋白进行遗传修饰之后可以进一步的丰富它们的特性，比如增加亮度和折叠效率、减少寡聚体形成等。突变既可以增加荧光蛋白的光稳定性，还可以赋予荧光蛋白光操控性，比如控制荧光发射与否，或者发出哪种荧光。这种光操控性既可以是可逆的也可以是不可逆的，可以用于监测蛋白的弥散过程、运输过程和老化过程等。虽然荧光蛋白在生色基团形成的过程中会生成 H2O2，但似乎没有产生太多的活性氧簇（ROS），这一点也并不奇怪，因为荧光蛋白在进化过程中都是暴露在阳光下的。不过我们也可以对荧光蛋白进行改造使其能够形成 ROS。荧光蛋白发出的荧光一般对它们所处的生化环境都不太敏感，但是酸性环境或变性剂的存在可以淬灭荧光。不过现在我们已经有了经过改造的、能耐受酸性环境或者能对金属离子、卤化物离子和巯基二硫化物氧化还原剂起反应的荧光蛋白。量子点（QD）量子点是一种无机纳米结晶体，它可以根据其大小发出特定波长的荧光，它具有非常高的消光系数，其消光系数要比小分子荧光基团和荧光蛋白高出 10 倍至 100 倍，同时量子点的量子产率也非常好。典型的量子点都含有一个硒化镉（CdSe）或碲化镉（CdTe）核心，外面包裹一硫化锌（ZnS）外壳（图 1C）。量子点的吸收波长范围覆盖从非常短的波长至略低于其发射波长的广阔范围，因此一束单波长激发光就可以让量子点达到多重发射。对于生物学研究领域来说最重大的一项突破是研究出了能让量子点溶于水的包被材料，该材料能避免量子点被水淬灭，同时也能让量子点可以与抗体、抗生物素蛋白链菌素（streptavidin ）等分子相连接（图 1B）。不过这种结合了生物大分子的量子点体积过大（直径约 10 纳米至 30 纳米），从而阻碍了它通过细胞膜结构，这种量子点也就只能用于经透化处理的细胞，或者只能对胞外蛋白和可以被细胞内吞的蛋白进行研究。量子点的光稳定性使其能够反复成像，而其大小和电子密度特性又使得它适合用于电镜研究。在亲水的树枝状高分子聚合物（hydrophilic dendrimers）中形成的金或银纳米点材料也能发出荧光，同时也具有波长可调性。这种新型材料在细胞生物学领域的应用前景也是不可估量的。标记蛋白技术免疫标记法表 1 中列举了几种免疫标记法以及其它标记蛋白的技术。在用荧光技术检测内源性蛋白质时最常用的方法就是免疫学方法，即先用特异性抗体（一抗）识别靶蛋白，再用标记有小分子有机染料、藻胆蛋白或量子点的二抗显色（图 1A 至 C）。或者，也可以直接将荧光标志物或者生物素连接在一抗上，然后再用抗生物素蛋白链菌素检测。当把抗体直接注入细胞时或者为了对多个蛋白进行检测而使用了多种颜色的荧光时采用这种直接将标志物连接在抗体上的方法非常有效。但是如果没有高质量的抗体时最好就是将荧光标志物与靶蛋白一起融合表达来检测，尽管这种融合蛋白不能算真正意义上的“内源性蛋白”。对靶蛋白检测的精确程度取决于一抗的特异性，因此还需要用其它的方法进行佐证。使用免疫荧光标记法的劣势在于前面所述的，该方法只能用于经透化处理的细胞、胞外蛋白和可以被细胞内吞的蛋白，而且这些抗体标志物的多价性（multivalency ）还可能会导致靶蛋白形成寡聚体。在标准的免疫标记法中，荧光标记的复合体通常来说分子量都会超过 200KD，这有可能会影响到蛋白间的相互识别过程。表 1 荧光基团在蛋白质检测中的应用+、+/-、- 分别表示“应用范围较广”，“在某些领域内有所应用 ”，“较少应用”遗传标记法将荧光蛋白与靶蛋白融合在一起的遗传标记法最大的优势就是可以对靶蛋白进行精确的标记（图 1C 和 D）。用转染技术和转基因技术进行荧光标记要比用荧光染料方便得多。遗传标记法的缺点在于表达的蛋白不是“内源性”蛋白，荧光蛋白的分子大小会带来影响，融合蛋白可能会影响到目的蛋白的功能，以及荧光蛋白的限制性问题等。因此，又发展出了好几种“混合系统”，在活细胞内或细胞表面将小分子荧光标志物与目的蛋白进行共价连接，或者通过酶的作用进行连接，甚至于可以自动连接。不过这些技术中的大部分都太新了，还没有得到足够的实用检验。这些混合系统中最好的系统应该算四半胱氨酸序列（tetracysteine）-biarsenical 染料系统。该系统用一段由 12 个氨基酸残基组成的肽段对目的蛋白进行修饰，这段短肽内包含有 4 个半胱氨酸，这些半胱氨酸能够与可以透过细胞膜的 biarsenical 染料分子相结合，形成 FlAsH 或 ReAsH，发出绿色或红色荧光，这种结合过程是高亲和力的过程，只需要皮摩尔级的分子就足够了（图 1C 和 E）。同时使用小分子二巯基化合物解毒剂（dithiol antidotes）可以降低靶蛋白与染料之间的亲和力，同时减少毒性反应。Tetracysteine 基序已经经过了好几轮改良以提高它与 biarsenical染料之间的亲和力，这样只需使用很低浓度的 biarsenical 染料就可以达到目的，而且可以降低背景。这种小分子 Tetracysteine 基序对目的蛋白的影响要比荧光蛋白小得多，有人用酵母微管蛋白（tubulin）、G 蛋白和细菌致病蛋白等已经证实了这一点。这种tetracysteine-biarsenical 系统还具有其它荧光蛋白不具有的优势，比如可以用于亲和纯化（affinity purification）、荧光蛋白辅助的光灭活作用（fluorophore-assisted light inactivation）、检测蛋白质合成过程、进行脉冲追踪标记（pulse-chase labeling）以及电镜下定位等等。不过， biarsenical 染料会造成背景荧光偏高，因此在这一点上（荧光高对比度）相比荧光蛋白并不具备优势，因此还没有用于转基因动物，而且还不能同时对不同的蛋白标记上不同的颜色。Tetracysteine 序列有时也可以提供一个十六烷酰化位点（palmitoylation site），虽然这种修饰作用有时会被已经存在的原位标签（epitope tag）所阻碍。这种遗传标记法具有其独特的优势，但是还是需要用其它方法验证标记物蛋白或融合蛋白是否会影响到目的蛋白的功能及定位。荧光标记技术在原代细胞和固定组织中研究蛋白质表达情况和蛋白质定位情况时的应用用流式细胞术研究蛋白质表达情况和蛋白质活性免疫荧光技术是最适合研究内源性蛋白质的一种方法。能够特异性结合磷酸化蛋白的被荧光标记的抗体可以帮助我们清楚地观察到内源性蛋白质的活化状态，这一点对于用荧光流式细胞仪（fluorescent flow cytometry）对单细胞内的多种胞质蛋白的活性进行研究非常重要。单细胞内研究资料可以用于构建细胞信号网络，并且有可能用于在体外对病人的血细胞进行临床药物试验。目前对于胞质蛋白来说，小分子染料要比量子点更实用，因为小分子染料对于细胞的穿透性更好（表 1）。不过量子点的高亮度特性有助于提高检测的极限，而且量子点的多色特性也有助于进行多色标记。使用小分子染料、藻胆蛋白和量子点，我们可以在流式细胞仪中同时对 17 种荧光进行检测。图 1 蛋白检测中各类荧光基团的特点及应用。本组图片展示了采用不同标记方法及不同类型的荧光基团在蛋白检测中的具体应用：A 、B 图中展示的是成纤维细胞中的 -微管蛋白（-tubulin，红色）。D、E 图中展示的则为 HeLa 细胞中的间隙连接蛋白43（connexin43，绿色）。不同类型的目的蛋白及标记荧光基团（图 C）的结构均按比例显示（比例尺为 2nm）。内源性蛋白质先经一抗标记后，再用与小分子有机染料（A 图）共轭相连的二抗或与 QDs 相连的 Fab 片段（B 图）进行标记，此种标记法同样也适用于在电镜下进行观察；B 图右侧所示为用 QD565 标记间隙连接蛋白 43 后显示的间隙连接蛋白接口处情况。D 图和 E 图分别采用的是融合表达荧光蛋白标签和tetracysteine 标签标记方法。E 图中先后分别采用 FlAsH (绿色) 及 ReAsH (红色)进行标记，从而对新旧蛋白进行区分。经光氧化作用处理后，ReAsH 也可在电镜下观察到，如图 E 右侧图所示。比例尺：图 A、B 及 D：20 m（光镜）；B 图：50nm（电镜）；C 图：2nm；E 图： 2m。在光学显微镜和电子显微镜下进行蛋白质定位研究要想获得蛋白质在细胞器和其它亚细胞结构中最准确的定位信息，这莫过于使用电子显微镜了。大部分单独的荧光基团在光照下都会产生单线态氧（singlet oxygen），这些单线态氧不仅容易对荧光基团自身起到漂白作用，而且可以将局部的二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）氧化形成电镜下的嗜锇小体（osmiophilic polymer）。这种“光转化（photo-conversion）”过程最初是在荧光黄（ Lucifer Yellow）里发现的，后来又在四溴荧光素免疫荧光染色（eosin immunostaining）中发现了。最近发现，用tetracysteine 序列标记的蛋白经 biarsenical 染色后形成的 ReAsH 对 DAB 也具有光转化作用，这提示我们需要在试验操作中更加仔细进行固定操作，已达到对细胞超微结构最佳的保存效果（图 1E 和图 2H）。而且用 tetracysteine 序列标记方法还可以进行脉冲追踪标记，以此在电镜下区别出“新的”蛋白质和“老的”蛋白质（图 1E）。据报道绿色荧光蛋白对于 DAB 也有光转化作用，不过转化效率要比 ReAsH 低很多。光转化作用对于聚集在亚细胞结构中的蛋白质的作用最大。量子点在发现更多的蛋白质和在细胞内分布范围更广的蛋白质这一方面非常具有优势，它可以同时用于光镜和电镜（图1B）。量子点的高电子密度核心和其大小特性使得它可以在电镜下被发现，而且还可以借助银染的手段对量子点进行染色，进一步方便我们观察。有人用切片后标记的方法（postsectioning labeling）用量子点对核内蛋白（nuclear protein）进行了标记，证明了量子点在电镜下和光镜下的应用价值。最近有报道称有人用免疫标记方法将量子点直接对细胞和组织内的多种内源性蛋白质进行了标记，标记后可在光镜和电镜下进行观察。量子点标记后可以现在光镜下进行预筛，以检测标记效率，并划定目标区域，以方便后续的电镜检查。因为量子点的大小有差异，所以我们可以轻易的分辨出 3 种不同的蛋白质。又因为每一个量子点都可以发出荧光，可以在电镜下被检测到，因此从原理上来说可以用电镜进行所有的荧光观察研究，比如可以不用抗体而用生物素标记细胞表面蛋白，然后用标记有抗生物素蛋白链菌素的量子点进行检测等。不过因为在免疫标记法中需要对细胞进行透化处理，而且不能对细胞进行直接的、比较严苛的固定操作，因此细胞的超微结构不能得到很好的保存，这一点不如使用 tetracysteine 序列标记技术。荧光标记技术在研究活体细胞内的蛋白质动力学时的应用研究蛋白质在细胞内的弥散过程和运输过程当被标记的蛋白质在细胞内运动、重新分布时，我们可以通过直接成像技术观察到这一动态变化的过程。通过检测蛋白质在胞内的这种运动过程，我们可以对蛋白质的活化、信号传递通路，第二信使等过程进行研究。比如有人就曾经用荧光蛋白标记了血小板同源结构域（pleckstrin homology domains）观察了它们在细胞内的转运情况，用这种方法监测了多磷酸肌醇（polyphosphoinositides）在胞膜上的聚集过程。即使到了稳定阶段，蛋白质也仍然是处于不断运动、不断在各个细胞器间交换的过程中。目前有三种主要的方法可以对蛋白质这种看不见的“流动状态”进行观察，这三种方法分别是单粒子示踪技术（single-particle tracking）、相关光谱学技术（correlation spectroscopy）和光标记技术（photomarking methods）。单粒子示踪技术是对单个的分子（molecules）、聚合物（aggregates ）或细胞器（organelles ）等进行观察的技术，这些被观测的粒子必须足够亮，并且彼此之间的间隔要足够大，这样才能很好地对它们进行“跟踪”。比如低浓度的（0.5%）荧光标记肌动蛋白或微管蛋白会分别在纤维状肌动蛋白（filamentous actin）或微管（microtubules）中形成一块荧光斑点（ fluorescent speckles）。生物大分子结构的形成、变化和解散过程都可以由这种荧光斑点的动态变化过程来反映。荧光相关光谱学技术可以对荧光标记蛋白进入或离开某一激光焦点区域导致的荧光强度的改变情况进行统计学分析，以此来分析蛋白质的运动情况。荧光相关光谱学技术可以衍生出其它一系列的方法，比如影像相关光谱学技术（image correlation spectroscopy），该技术可以对荧光图像进行测量，发现不同图像间的变化情况，可以对细胞内蛋白间相互作用和蛋白动力学的总体情况进行了解。不过在上述这些方法中存在一个问题，那就是荧光基团的光化学敏感问题（Photochemical sensitivity），但这恰好是光标记技术所需要的。光标记技术也是一种图像化研究蛋白质动力学的方法。各种荧光蛋白都可以被破坏（图 2F）、被去淬灭（dequenched），或者被光活化作用改变颜色（图 2E）。经过上述处理的这些荧光标记分子就可以直接用来进行成像研究了。对主动转运过程来说，荧光标志物的大小不会是问题，但是在被动转运过程中，小分子标志物的效果要好得多。单个的量子点可以用来反复成像，因为它们的亮度和光稳定性都非常高，但是很难在活体细胞内对量子点标记的胞质蛋白质进行观测，这成了困扰量子点应用的瓶颈问题。不过在对细胞表面蛋白质进行研究时，量子点方法要比单分子活体细胞成像方法好得多。我们可以用免疫靶向的抗生物素蛋白链菌素标记的量子点（immunotargeted streptavidin-QDs）来研究甘氨酸受体的运动情况。我们已经获得了一千多张高质量的神经元细胞内源性受体的荧光图像，这些图像向我们展示了甘氨酸受体在突触外（extrasynaptic）、突触旁（perisynaptic）和突触内（synaptic ）以不同速度运动的情况。Lidke 等人最近将好几种上述研究方法和荧光标记物联用，获得了有关表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）信号通路的新发现。他们发现用量子点标记的表皮生长因子能够特异性地与 ErbB1-GFP 受体复合体共定位，并且用特异性靶向活化的ErbB1 蛋白的 Cy5 标记的抗体发现，表皮生长因子能够激活 ErbB1-GFP 受体复合体。Lidke 等人还用阿糖胞苷（Alexa）标记的转铁蛋白（transferrin ）发现，EGF-ErbB1-GFP 受体复合体是通过依赖笼形蛋白（clathrin ）的细胞内吞途径（ internalized）进入细胞的。此外，他们还发现 EGF-QD 分子的逆向转运过程是依赖受体的寡聚化过程。对光漂白的 GFP-actin 分子进行荧光恢复之后发现受体逆向转运过程的速度是与 actin 分子转运速度相同的。用不可进入细胞内的 biotin-Alexa 特异性地淬灭胞外的 EGF-QDs-streptavidin 分子，结果发现受体不会进入丝状伪足，但是可以进入胞体，因此丝状伪足可能起到了触角的作用，能够调节活化的受体进入细胞。荧光标记技术在蛋白质构象改变研究中的应用在研究蛋白质随时间、空间改变而发生构象动力学改变的时候，最为常用的一个方法就是将某一蛋白质结构域与两个荧光基团结合，形成一三明治样结构，然后对该结构的萤光共振能量转移现象（FRET）进行检测。最为常用的荧光基团有蓝绿色荧光蛋白（cyan FPs, CFP）和黄色荧光蛋白（yellow FPs, YFP）（图 2A 至 C）。图 2B 给出了一个最为典型的 FRET 试验。FRET 的效率取决于供体与受体间的距离和方向。FRET 可以反映出蛋白分子内部因为方向而不是距离改变所造成的构象改变，因为荧光蛋白分子中有一个发生交替排列或者接头长度发生微小的改变都会给 FRET 带来很大的影响，这要比两个荧光蛋白分子间的距离改变对 FRET 造成的影响大得多。连接两个荧光蛋白的蛋白质本身也可以在生化信号的影响下改变构象。如果与定位信号序列融合，这种三明治结构可以用于对胞内特定的亚细胞结构进行研究。我们已经用这种方法研究出了可用于对某些离子、环核甙酸（cyclic nucleotides）、代谢产物和神经递质等物质进行检测的指示剂，还研究出了可用于检测蛋白激酶与磷酸酶活性、蛋白酶活性、小 G 蛋白（small G proteins）活性和组蛋白乙酰基转移酶（histone acetylases）活性的指示剂。荧光标记技术在蛋白与蛋白间相互作用研究中的应用FRET 还可以用于在活体细胞内研究蛋白间的相互作用（图 2C）。此处应用的荧光蛋白长度在 6 纳米至 8 纳米之间。最近更有报道称可以在上述 CFP 和 YFP 的基础上再加上一种红色荧光蛋白（RFP），即利用三种荧光蛋白来研究高度复杂的蛋白复合体。在这种 CFP-YFP-RFP 复合体中，CFP 是 YFP 的供体，而 YFP 又是 RFP 的供体（图 2C）。这种三联体研究方法已经用于多蛋白复合体以及三聚体蛋白的研究当中。如果对 FRET 供体和受体波长或光谱重叠范围进行进一步的优化将可以进一步的改进这种三联体研究方法。荧光蛋白在某些位点断裂之后，生成的两个片段可以重新结合再形成生色基团，这就是图2D 所示的名为生物分子荧光互补技术（bim