生姜蛋白酶的提取纯化工艺研究

桂林理工大学生物工程专业技能实习报告1生姜蛋白酶的提取纯化工艺研究学生姓名： 指导教师： 摘要：生姜蛋白酶是一种有待开发利用的新的植物蛋白酶。本实验对生姜蛋白酶的提取方法和纯化工艺进行了研究。实验中使用以乙醇或丙酮为溶剂的有机溶剂沉淀法和硫酸铵盐析法提取生姜蛋白酶，测定各方法提取物的蛋白含量和酶活性，确定最佳的提取方法。再通过双水相萃取和反胶束萃取两种方法纯化粗酶。双水相萃取是用 PEG4000/硫酸铵、PEG4000/NaH 2PO4-Na2HPO4 两种双水相体系，反胶束萃取是用 AOT/异辛烷、CTAB/正辛醇两种反胶束体系。关键词：生姜蛋白酶；有机溶剂沉淀法；硫酸铵盐析法；双水相萃取；反胶束萃取Research on extraction and purification of Ginger proteaseStudent: GUO Bo-hua Teacher: LI Hai-yun, LI Zi-yuan, LIU Hong-yanAbstract: Ginger protease is a pending development and utilization of new plant protease. The experiments on Extraction of ginger protease and purification process were investigated. With ethanol or acetone as extraction of ginger protease organic solvent precipitation and ammonium sulfate salting out method used in the experiment, protein and enzyme activity of the extracts, the optimum extraction method. The purification of crude enzyme of aqueous two-phase extraction and reverse micelles extraction two methods. Aqueous two-phase extraction with PEG4000/ ammonium sulfate, PEG4000/NaH2PO4-Na2HPO4 two aqueous two-phase system, reversed micellar extraction is used AOT/ isooctane, CTAB/ octanol two reverse micellar system.Key words: Ginger protease; organic solvent extraction; ammonium sulfate salting-out; aqueous two-phase extraction; anti-micelle extraction桂林理工大学生物工程专业技能实习报告2前 言生姜蛋白酶是在继木瓜蛋白酶等以后发现的一种新的植物蛋白酶，它在结构与性质上与木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及无花果蛋白酶等具有很多的相似性，被认为是木瓜蛋白酶家族的又一新成员。生姜蛋白酶在肉类嫩化、酒类澄清以及凝乳中均具有广泛的应用前景，开发潜力较大。生姜蛋白酶用于肉类嫩化，不仅可以显著提高肉的嫩度，而且可以使其具有良好的风味。生姜蛋白酶用于酒类澄清，可显著提高啤酒和葡萄酒的澄清度 1。1968 年，MiChi 等人首先报道了生姜蛋白酶。1973 年，Thompson 等人从生姜根茎中提取了生姜蛋白酶，并命名为 Zingibain，并指出它具有较高的最适温度(60 )等特性，因此有较好的应用前景。同年，Ickikawa 和 Roshie 等人用 DEAE纤维素柱层析对该酶进行了纯化，证明该酶是由两个组分(GP1、GP2)构成的，除电泳迁移率外，两个组分在其他方面基本相同；用 Sephadex G100 测得两个组分的分子量均为 22500，该酶结晶为六面体。1978 年，Ohtsuki、kozo 等人用 P100 生物胶过滤对该酶进行纯化，得出该酶分子量为 29000。1995 年，Ohtsuki 发表论文，报道了用 DEAESepharose 和 Sephadex G75 纯化生姜蛋白酶之后，用等电聚焦电泳可将该酶分为三个组分，并用 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和 TSKG2000SW 凝胶过滤再次证明该酶分子量为 29000。同年，赵帜平等以安徽舒城的生姜为原料，采用 DEAE纤维素 DE52 和 SephadexG75 纯化得两个组分，用苯酚硫酸法鉴定均为糖蛋白，并证明糖肽键型均为非 O 型。1999 年，kyung 等利用 X射线晶体衍射法研究了生姜蛋白酶 2.1A 精确度下的晶体结构。发表了以下重要研究成果：（1）生姜蛋白酶是一个含有 221 个氨基酸残基的糖蛋白，在 Asn99 和 Asn156 上有两条 N 型寡糖链，糖基含量占 8，并阐明了寡糖残基的组成及连接方式。 （2）生姜蛋白酶总体结构类似于生姜蛋白酶等其他植物巯基蛋白酶，肽链折叠成两个独立的大小差不多的结构域，两者之间有一道裂隙，活性中心就位于裂隙中。 （3）DTT 对该酶有强烈的激活作用。 （4）结晶为四聚体，阐明了单体间的连接方式。2002 年，代景泉以莱芜生姜为原料，用硫酸铵沉淀法对生姜蛋白酶进行粗提，证明了生姜蛋白酶具有酸性蛋白酶的性质，并用 DEAE纤维素 DE52 对该酶进行纯化，将该酶分为两个组分 2。生姜蛋白酶目前广泛采用的提取方法主要有沉淀法和超滤法两大类，通常采用的沉淀剂主要是有机溶剂如丙酮和乙醇，盐类如硫酸铵，以及单宁等。沉淀法大都以丙酮粉作为酶的来源，沉淀剂对酶及蛋白质进行沉淀，从而将生姜蛋白酶从大量的杂质中分离出来，制成丙酮粉后还可以在低温下长期保藏，其性质十分稳定；唐晓珍首先桂林理工大学生物工程专业技能实习报告3报道了采用超滤法提取生姜蛋白酶，基本工艺如下：生姜洗净切碎榨汁离心除去淀粉抽滤超滤取浓汁真空冷冻干燥保存。近几年的一些新的提取方法，则综合运用了上述各种方法，例如：2000 年，Kyung 在研究生姜蛋白酶的氨基酸序列时，采用如下的提取方法 5：生姜切成小块，3下，在 1000 mL 20 mM 7.0 的磷酸缓冲液中研磨，混合物搅拌 1 h 然后用纱布过滤，取滤液。滤渣再用 500 mL 缓冲液浸提，过滤，合并滤液，加入 2的氯化钠，搅拌 2 h，在 4下 15000g 离心 30 min。上清液用硅藻土过滤以除去悬浮物，然后加入硫酸铵至 20饱和度，将溶液搅拌 1 h，然后 13000g 离心 30 min，上清液继续添加硫酸铵至 60饱和度，用 NaOH 调节 pH 至 7.2，4 下搅拌 3h，离心取沉淀，用约150mL 20 mM pH 为 7.0 的磷酸缓冲液（含有 5 mM 的连四硫酸钠）溶解。溶液用截流分子量为 12000 的透析袋对 20 mM pH 为 7.0 的磷酸缓冲液（其中含有 5 mM 的连四硫酸钠，1mMEDTA）透析 16 h 以上。透析液在 4 下 10000g 离心 30min 以除去任何不溶性物质的粗酶液，并在此基础上进行层析纯化。又如：2005 年，Adulyatham 等在研究生姜蛋白酶的部分纯化和稳定性的时候采用如下的提取方法 6：鲜姜，切片，与 4 倍（w/v）的冷 Tris-盐酸缓冲溶液（ 0.05M, pH8.0）混合均匀，均质，四层纱布过滤，滤液在 5，12000g 的离心机中离心 20 min。上清液，即生姜蛋白酶，在 5保存。生姜蛋白酶属大分子物质，在超滤过程中易在膜表面聚积而产生浓差极化现象，且存在生姜蛋白酶在有机溶剂中易变性以及有机溶剂残留问题；盐析法提取的生姜蛋白酶活性较低，与应用要求相差甚远；絮凝法提取专一性不强，制得的生姜蛋白酶纯度不高，杂质含量较高；亲和层析法提取的酶纯度虽然较高，但是操作复杂，不易工业上的放大生产，且用于亲和层析的前处理液是需经过初步纯化的酶液。相对来说，双水相萃取法能有效分离提取高纯度生姜蛋白酶 3。胶束萃取是适合生化分离的新技术，成本低，溶剂可重复利用，萃取率和反萃取率都很高，条件温和，有可能解决外源蛋白的降解问题，不引起蛋白质和酶的变性，操作简便，构成反胶束的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，可直接从整细胞中提取蛋白质和酶 4。对于反胶束酶系统的研究，主要集中于反胶束中酶的定位和结构、酶催化的动力学特征、酶的催化活性及稳定性等方面。桂林理工大学生物工程专业技能实习报告41 实验原理1.1 有机溶剂沉淀蛋白质原理与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH 值和离子强度下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。例如,在冰浴中磁力搅拌下,在 4预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25),可以使冰核蛋白析出,从而纯化冰核蛋白。由于在室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀,而且伴随着变性。因此,通常要将有机溶剂冷却,然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的提取液。1.2 盐析法蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。1.3 双水相萃取原理双水相萃取是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境的影响，使其在上、下相的浓度不同。对于蛋白质，只要选择合适的双水相体系，控制一定条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化的目的。1.4 反胶束萃取原理表面活性剂在溶液中形成反胶束，非极性基团在外，极性基团则排列在内，形成一个极性核，此极性核具有溶解极性物质的能力，当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白的水溶液接触后，蛋白及其他亲水性的物质能够溶于极性核内部的水中，由于周围的水层和极性基团的保护，蛋白不与有机溶剂接触，从而不会造成失活。桂林理工大学生物工程专业技能实习报告52 实验部分2.1 材料、试剂与仪器2.1.2 实验原料新鲜生姜。2.1.3 主要试剂磷酸缓冲液（0.05mol/L,PH7.5） 、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（0.05mol/L,PH6.0） 、丙酮、聚乙二醇（40%PEG4000 溶液） 、40%硫酸铵溶液、20%PH6.5 的 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液、无水乙醇、AOT（0.05mol/L） 、异辛烷、正辛醇、CTAB（0.05mol/L） 、0.1mol/L KCl 溶液、0.2M KCl 溶液、0.4M KCl 溶液、0.1M NaCl 溶液、0.2M NaCl 溶液、0.4M NaCl 溶液、40%PBS 缓冲液、牛血清蛋白溶液（0.1mg/mL） 、盐酸（0.2mol/L） 、1%酪蛋白、三氯乙酸（0.4mol/L） 、考马斯亮蓝 G-250 溶液。2.1.4 主要仪器紫外分光光度计、离心机、搅拌机、恒温水浴、移液管、天平、电子天平、冰箱、刻度试管。2.2 实验方法2.2.1 生姜蛋白酶的常规提取纯化工艺2.2.1.1 生姜蛋白酶的提取取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜 50 g，切成小块，按料液比 1：2 加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5） ，研磨匀浆 30 min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）洗涤后，收集滤液 4静置2h 后，离心（4000rpm，10 min）去除沉淀，上清液用磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）定容至 100mL（生姜蛋白酶溶液 A） ，4冰箱贮存待用。取样按 2.2.6 方法测定蛋白质含量，按 2.2.7 方法测定酶活。2.2.1.2 乙醇沉淀法取生姜蛋白酶溶液 A 20mL，加入 1.5 倍的无水乙醇进行沉淀，4静置 过夜后，离心（4000rpm，10 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶） 。沉淀用 0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至 10mL（生姜蛋白酶溶液 B） 。取样按 2.2.6桂林理工大学生物工程专业技能实习报告6方法测定蛋白质含量，按 2.2.7 方法测定酶活。2.2.1.3 丙酮沉淀法取生姜蛋白酶溶液 A 20mL，加入 1.5 倍的 4预冷丙酮进行沉淀，4静置 过夜后，离心（4000rpm，10 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶） 。沉淀用 0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸 磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至 10mL（生姜蛋白酶溶液 C） 。取样按2.2.6 方法测定蛋白质含量，按 2.2.7 方法测定酶活。2.2.1.4 盐析法取生姜蛋白酶溶液 A 20mL，加入固体硫酸铵至 40%饱和度，4静置 30min 后，离心（4000rpm，10 min） ，收集上清液继续加入硫酸铵至 60%的饱和度，4静置 过夜后，离心（4000rpm，10 min） ，收集沉淀。0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至 10mL（生姜蛋白酶溶液 D） 。取样按 2.2.6 方法测定蛋白质含量，按 2.2.7 方法测定酶活。2.2.2 生姜蛋白酶聚乙二醇/硫酸铵双水相萃取工艺2.2.2.1 生姜蛋白酶的提取取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜 50 g，切成小块，按料液比 1：2 加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5） ，研磨（粉碎）匀浆 30 min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）洗涤后，收集滤液4静置 2 h，离心（4000rpm，10 min）去除沉淀，上清液加入 1.5 倍的 4预冷丙酮进行沉淀，4静置过夜后，离心（4000rpm，10 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶） 。沉淀用 0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至 25mL。取样按 2.2.6 方法测定蛋白质含量，按 2.2.7 方法测定酶活。2.2.2.2 聚乙二醇/硫酸铵双水相体系相图的绘制以 PEG4000/硫酸铵体系为例进行相图的绘制。取 40%PEG4000 溶液（%）10 mL 于三角瓶中，用 40%硫酸铵溶液（%）装入滴定管中滴定至三角瓶中溶液恰好浑浊，记录硫酸铵消耗的体积。再用滴定管加入适量水，使体系澄清，计量加入的水，并继续用硫酸铵滴定至恰好浑浊，如此反复操作，记录每次硫酸铵消耗的体积，计算每次出现浑浊时体系中 PEG 和硫酸铵的浓度（%） ，并填入表 1 中。以硫酸铵的浓度（%）为横坐标，PEG 浓度（%）为纵坐标，绘制出 PEG4000-硫酸铵双水相体系相图。桂林理工大学生物工程专业技能实习报告7表 1 PEG4000/硫酸铵双水相体系相图制作表（ PEG4000= 4 g; 温度 t=27）三角瓶中编号H2O 累计添加量（ mL）硫酸铵溶液读数（mL）纯硫酸铵累积量（g）溶液总体积（ mL）PEG4000 浓度（ %） 硫酸铵浓度 （%）1 0 42.7 0.68 11.7 34.19 5.812 0.3 42.9 0.76 14.6 27.40 5.213 0.6 43.3 0.92 16 25.00 5.75 4 0.8 43.4 0.96 17.1 23.39 5.615 1 43.7 1.08 18.4 21.74 5.876 1.2 44.2 1.28 19.9 20.10 6.43 7 1.4 44.8 1.52 21.6 18.60 7.078 1.6 45.4 1.76 23.1 17.32 7.62 9 1.8 45.7 1.88 24.4 16.39 7.7010 2 46.3 2.04 25.8 15.50 7.91 2.2.2.3 聚乙二醇/硫酸铵双水相体系萃取生姜蛋白酶称取不同分子量的 PEG(1000、2000、4000)溶解于水配置成 40%浓度的系列溶液备用。硫酸铵配制成 40%溶液备用。按下表加入各物质，振荡均匀后静置 2h 待其分相，记录分相情况。若分相，分别读取上下相体积，并测定上下相中蛋白含量和蛋白酶活性。表 2 PEG/硫酸铵双水相萃取生姜蛋白酶体系组成40%PEG 溶液mL40%硫酸铵溶液mL粗酶液mL水mL总体积mL4.5 4.5 1 0 104.5 4 1 0.5 104.5 3.5 1 1 104 4.5 1 0 104 4 1 0.5 104 3.5 1 1 103.5 4.5 1 0 103.5 4 1 0.5 103.5 3.5 1 1 10桂林理工大学生物工程专业技能实习报告8按以下各式计算相比R、酶分配系数Ke（比酶活） 、蛋白分配系数Kp：上上eK上pK2.2.3 生姜蛋白酶聚乙二醇/磷酸盐双水相萃取工艺2.2.3.1 生姜蛋白酶的提取取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜 50 g，切成小块，按料液比 1：2 加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5） ，研磨（粉碎）匀浆 30 min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）洗涤后，收集滤液4静置 2 h，离心（4000rpm，10 min）去除沉淀，上清液加入 1.5 倍的 4预冷丙酮进行沉淀，4静置过夜后，离心（4000rpm，10 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶） 。沉淀用 0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至 25mL。取样按 2.2.6 方法测定蛋白质含量，按 2.2.7 方法测定酶活。2.2.3.2 聚乙二醇/磷酸盐双水相体系相图的绘制以 PEG4000/NaH2PO4-Na2HPO4（pH6.5）体系为例进行相图的绘制。取 40%PEG4000溶液（%）10 mL 于三角瓶中，用 20%pH6.5 的 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液（%）装入滴定管中滴定至三角瓶中溶液恰好浑浊，记录 NaH2PO4-Na2HPO4消耗的体积。再用滴定管加入适量水，使体系澄清，计量加入的水，并继续用 NaH2PO4-Na2HPO4滴定至恰好浑浊，如此反复操作，记录每次 NaH2PO4-Na2HPO4消耗的体积，计算每次出现浑浊时体系中PEG 和 NaH2PO4-Na2HPO4的浓度（%） ，并填入表 3 中。以 NaH2PO4-Na2HPO4的浓度（%）为横坐标，PEG 浓度（%）为纵坐标，绘制出 PEG4000/NaH2PO4-Na2HPO4双水相体系相图。桂林理工大学生物工程专业技能实习报告9表 3 PEG4000/ NaH2PO4-Na2HPO4 双水相体系相图制作表（PEG4000= 4 g; 温度 t= 27）三角瓶中编号H2O 累计添加量（mL）硫酸铵溶液读数（mL） 纯硫酸铵累积量（g）溶液总体积（mL）PEG4000 浓度（% ） 硫酸铵浓度 （% ）1 0 4.6 0.24 11.3 35.40 2.12 2 0.4 4.8 0.32 11.8 33.90 2.71 3 0.7 4.9 0.36 12.2 32.79 2.95 4 0.9 5.1 0.44 12.5 32.00 3.525 1.1 5.2 0.48 12.75 31.37 3.766 1.3 5.3 0.525 13 30.77 4.00 7 1.5 5.5 0.6 13.3 30.08 4.518 1.7 5.65 0.66 13.55 29.52 4.879 1.9 5.8 0.72 13.8 28.99 5.2210 2.1 5.9 0.76 14.05 28.47 5.412.2.3.3 聚乙二醇/磷酸盐双水相体系萃取生姜蛋白酶40%聚乙二醇溶液：称取不同分子量的 PEG(1000、2000、4000)溶解于水配置成 40%浓度的系列溶液备用。40%PBS 缓冲液：按一定比例配置 pH 系列（6.0、6.5、7.0）的 PBS 缓冲液。按表 4 加入各物质，振荡均匀后静置 2h 待其分相，记录分相情况。若分相，分别读取上下相体积，并测定上下相中蛋白含量和蛋白酶活性。表 4 PEG/NaH2PO4-Na2HPO4 双水相萃取生姜蛋白酶40%PEG 溶液mL40%PBS 溶液mL粗酶液mL水mL总体积mL4.5 4.5 1 0 104.5 4 1 0.5 104.5 3.5 1 1 104 4.5 1 0 104 4 1 0.5 104 3.5 1 1 103.5 4.5 1 0 103.5