川佛手总黄酮提取及抗氧化性研究

340 一 江苏农业科学 2010 年第 3 期姜立春，黄成思，杨 澈，等川佛手总黄酮提取及抗氧化性研究J江苏农业科学，2010(3)：340342川佛手总黄酮提取及抗氧化性研究姜立春，黄成思 ，杨 澈 ，阮期平(1绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室 ，四川绵阳 621000；2吉林师范大学，吉林四平 136000)摘要：研究药用植物川佛手总黄酮的最佳提取工艺，为该药材质量研究奠定基础。以佛手作为研究材料，采用单 因素和正交试验优化了提取工艺，用 pH 值梯度法和溶剂萃取法对粗黄酮进行了纯化精制，并对其抗氧化性进行了研 究。结果表明：川佛手总黄酮的最适宜提取工艺是提取温度 60 ，超声功率为 420W，提取时间 40 min，超声提取 2 次，采用乙醇浓度 70，料液比为 1：15。精制后的佛手总黄酮对猪油抗氧化能力较强，其抗氧化能力强于柠檬酸。 该提取工艺操作简单，经济省时，方便可行。关键词：川佛手；总黄酮；超声 波辅助法；提取 工艺；抗氧化性中图分类号：$666901 文献标志码：A 文章编号：10021302(2010)03034003佛手(bergamot)系芸香科柑橘属植物佛手 CitrusmedicaLvarsarcodactylis(Noot)Swingle的干燥果实。味辛、苦、 酸，性温，人肝、胃、肺经。有舒肝理气，和胃止痛之功，用于肝胃气滞、胸胁胀痛、胃脘痞满、食少呕吐等症 J，主要分 布于 热带和亚热带。佛手在我国栽培历史悠久，分布 较广，四川 、 浙江、福建、江苏、广东、广西等省区都有种植。在中国药典(2005 年版)和其他文献记载中，不同产地佛手均来源于 同一种植物，商品佛手因产地不同有广佛手、川佛手、金佛手和建佛手之分 。药理实验表明，佛手 有解痉与中枢抑制作用、对心血管系统作用、抗过敏和抗炎等作用 。黄酮类物 质是一类有多种生物学功能特性的物质，广泛用于医药、保健 食品中，具有抗菌消炎、抗辐射、调节毛细血管壁的渗透、血管的脆性、防止血管破裂、止血和对紫外线有极强的吸收以及很 好的抗氧化等作用 。本研究以总黄酮为检测指标，紫外分 光光度法为检测手段，利用单因素分析和正交试验设计，对川佛手中总黄酮提取 工艺进行了研究，为质量控制以及药理活性等方面研究提供 技术依据。1 材料与方法11 材料和仪器川佛手(四川省中江县)、芦丁(上海试剂二厂)、猪油(湿 法熬制，市售板油洗净后文火中熬炼而成，装入容器中低温保 存)，其他试剂均为分析纯。紫外可见分光光度计(Uhrospec 3300pro)，超纯水系统(MilliQ)，旋转蒸发仪(BuChi)，数控超声波清洗器(KH 一 600DB)，电子天平 (FA1104)，真空 干燥 箱 (DZF 一 6050)，恒温水浴锅 (HH 一 6)。12 试验方法121 材料处理 将川佛手饮片放入恒温干燥箱内 ，调节温度 5O，干燥 24h。将干燥后的佛手饮片用药物粉碎机粉收稿日期：20091015 作者简介：姜立春(1977 一 )，男，四川绵阳人，硕 士，讲师，从事天然产物和微生物方面的研究。Email：jiangjichun126COI1。 通信作者：阮期平，博士，教授，从事微生物与生化药学方面的研究。E mail：rqp2200070 yahoocornvii。碎，将粉末过 3 号筛，收集过筛后的粉末 。122 标准曲线绘制 准确称取经干燥恒重的芦丁标准品 200mg，用浓度 30的乙醇溶解并定容至 100mL，摇匀得浓 度为 02mgmL的芦丁标准液。分别称取此标准溶液 0、 10、20、40、60、80、100mL 于 7 支 25mL 容量瓶中。分别于 7 支容量瓶依续首先加入 30 乙醇溶液至 l25mL，再 加入 07 mL 质 量分数为 5 的亚硝酸钠溶液，摇 匀，放置6min，然后加入 07mL 质量分数为 10的硝酸铝溶液，摇 匀，放置 6min，后加入 5mL1molL 的氢氧化钠溶液混匀，最 后用 30的乙醇定容至刻度，放置 10rain。以蒸馏水为空白 参比，于 510nm 测定吸光度值，以吸光度 Y 为纵坐标，黄酮浓度 为横坐标，绘制标准曲线 。123 提取溶剂的选择 (1)水提取法。精确称取佛手粉 4g共 4 份，各用 20mL 石油醚回流 2h 脱脂去杂质。分别将 4 份脱脂后的佛手粉用定性滤纸过滤，用石油醚洗脱滤液直 至无色，收集滤渣。将滤渣放入烘箱内 50干燥，收集干燥 后的干粉。向干粉中加入蒸馏水 ，将 3 份混合物分别放入 50、60、70、80恒温水浴锅中浸提 1h，浸提过程中定时振 荡。1h 后将浸提液分别过滤，收集滤液得到粗黄酮提取液， 然后用旋转蒸发仪浓缩至 25 mL，准备测吸光度计算提取率 和测定提取物中黄酮含量。(2)乙醇提取法。方法见水提取 法，其中用冷凝回流装置分别置于 50、6O、7O、8O恒温水浴锅回流 1h，测定提取物中黄酮含量。 (3)超声波辅助法提取工艺。方法见水提取法，其中加入 70的乙醇 40mL，分别于50、60、70、80，360W 超声辅助提取 1h，测定提取物中黄 酮含量。124 正交试验方案设计 试验结果可知超声辅助提取佛手中总黄酮得率最高，为了综合考虑各种影响因素的主次顺序，从单因素试验结果中挑选出影响提取率较大的 4 个因素， 为了全面考察这 4 个因素的作用大小和优化组合，根据超声 时间、提取次数、超声温度、超声频率设计了 4 因素 3 水平的 正交试验(其中固定因素乙醇浓度为 70，料液 比为 1g：15 mL)。125 粗黄酮纯化 获得川佛手中总黄酮的粗提液 ，首先用 试纸检测其 pH 值在 46 之 问，然后用旋转蒸发仪减压浓 缩，得到浸膏，用蒸馏水溶解 约至 10mL，将 得到的样品溶液姜立春等：川 佛手总黄酮提取及抗氧化性研究 341，转入分液漏斗，用等体积正丁醇(约为 10mL)萃取 46 次，直至正丁醇颜色基本恢复原色为宜，收集几 次萃取的正丁醇层，弃去下层水层。将合并的 46 次正丁醇层约为 4060mL，用等体积的 1 NaOH 溶液同样萃取 46 次，弃去上层有机溶剂正丁醇层，合并几次 1 NaOH 层，将合并后的溶 液用浓盐酸调节 pH 值重回到 46，再用正丁醇反萃取 46 次，最后收集几次萃取后的正丁醇层，弃去下层水层。将最后合并得到的正丁醇层用旋转蒸发仪浓缩得到浸膏，称 重，再用 70的乙醇溶解成相应浓度的精制黄酮提取液 ，为下一步抗 氧化试验做准备。126 总黄酮含量测定 取定容后的佛手提取液 1 mL 于25mL 容量瓶 ，加入 14mL30的乙醇 ，再加 07mL 质量分 数为 5的亚硝酸钠溶液，摇匀，放 置 6min，然后 加入 07mL质量分数为 10 的硝酸铝溶液，摇匀，放置 6 min，再加入5mL1molL 的氢氧化钠溶液混匀 ，最后用 30的乙醇定容 至刻度，放置 10min。于波 长 510nm 处测定 吸光度值，根 据 标准曲线计算总黄酮含量。13 抗氧化性能测定新鲜猪板油切成 Q 小 块，湿法 熬炼，双 层纱布过滤除去残O O O O O 0 O O 0渣，冷却密封后放人低温冰箱备用。添加物用少量乙醇溶解，各加入 20g 新鲜猪油 中，置 50水浴中缓慢加 热融化油样，并在升温过程中不时搅拌使成均相，另取一瓶加同样猪油为空白。(601)恒温箱中强化保存，每隔 12h 搅拌 1 次， 并交换在烘箱中的位置，以确保环境条件 相同。每 24h 定 时 测定 POV值 。每次样后充分振摇，以混入 足够的空气。取双 份平行样，按 GBT500937 一 l996 测定 POV 值，以 POV 值达到 20meqkg 油计算其诱导期，比较不同抗氧化剂的抗氧化性 。计算公式为：POV()=1269C( 一 )100 (1000m)；式中， 为样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积 (mL)； 为空白试剂消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积 (mL)；C为硫代硫酸钠标准溶液的浓度 (molL)；m 为样品 质量 (g)；1269 为碘 的摩尔质量 (gmo1)。 和 的测定 是精确称取 3g样品，置 于碘量瓶中，加入 30mL 氯仿 一冰乙 酸混合溶液样品，再加入 1mL 饱和碘化钾溶液，摇匀，放置暗 处 5min，然后加水 100mL，以 0002molmL 硫代硫酸钠标准 溶液滴定至淡黄色时，加 1mL 淀粉指 示剂，继续 滴定至蓝色 消失为止。以空白试剂滴定为参考。空白试剂消耗硫代硫酸 钠标准溶液的体积为 296mL。分别在猪油 中加入了同浓度 的提取液己二酸四乙酸二钠 (EDTA)和柠檬酸，每 24h 测 定1 次 POV 值，确定其抗氧化性强弱。2 结果与分析21 标准曲线绘制以“122”所示方法进行测定，由 图 1 得 回归方程 Y= 11578x+00028，r =09999。由 r2 值可知，吸光度与芦丁 浓度有良好的线性关系。22 正交试验设计通过预试验，比较提取方法，包括水提取 、乙醇回流提取、超声提取，结果超声提取法提取率较高。从以上单因素试验 可以看出，提取率受到超声时间、浸提次数、提取温度、超声频浓度 (mgmL) 图 1 芦丁标准曲线率这 4 个因素的影响较大，为了全面考察这 4 个因素的作用 大小和优化组合，设计了 4 因素 3 水平 【J9(3 )的正交表进行试验 (表 1)。其结果见表 2 和表 3。表 1 正交试验因素水平1553 0776 51434 P OO50225 O113 7460 尸 Oo5F0()5(2，2)=19，Fo0l(2，2)=99。由表 2、表 3 可知，以上 4 个因素对佛手黄酮提取率 的影 响大小依次为：提取 时间 (A)提 取温度 (B)提取 次数(D)超声功率(C)，提取时间的影响最大。表明佛手黄酮 超声提取最佳工艺组合为：A，B：C D：，即在温度为 6O，料 液比为 1g：15mL，用 70乙醇超声提取 2 次，每次 40ainr。 在此条件下佛手黄酮得率达 512。在最优条件下，重复试验 5 次，平均得率为 536。江苏农业科学23 方法学考察231 精确度试验 精确量取 20mL 质量浓度为 020gL 的标准溶液，置于 25mL 量瓶，加体积分数 95乙醇至刻度，测吸光度。重复操作 5 组，RSD 值为 0683 。232 重复性试验 根据正交试验结果 ，重复操作 5 组，根据测定结果计算 RSD 值为 1489。233 加样回收率试验 取药材 05 g，加入质量浓度为20gL 的标准溶液 25mL，按照试验所得最佳提取工艺处 理药材，得到供试液，重复操作 6 组。510nm 处测其吸光度， 计算药材总黄酮含量。测得加样回收率为 9958，RSD 值为 2589 。24 佛手中黄酮类化舍物对猪油的抗氧化活性研究 大量研究结果表明，黄酮类化合物 B 环中的邻二羟基对黄酮类化合物的抗氧化活性起主要作用。黄酮类化合物是通 过形成共振稳定的具有醌式结构的自由基而起抗氧化作用的，在这一点上，C4 一羟基和 c4 一羰基对黄酮和异黄酮的稳 定作用是最重要的因素。除此之外，影响黄酮类化合物抗氧 化作用的结构因素还有 c3 位羟基和 c5 位羟基。黄酮类与0 、OH 的反应相当于一个连锁反应在终结阶段的反应 ，在消除 0 、OH 一 FgI) 的反应 0 中起着氢供体的作用，使具有高度氧化活性的自由基还原，从而达到消除的 目的。241 佛手不同浓度提取物的抗氧化性能比较 川佛手总黄酮粗提物、精制物对猪油的抗氧化能力随时间变化情况见图 2。试验结果表 明：在猪油中添加佛手总黄酮后，可显著抑制猪油的氧化，无论是粗提物还是精制物均具有明显的抗氧化性，且随浓度 的增大而增强。在初期，二者 均可降低 POV值，说明佛手黄酮不仅能抑制猪油的自动氧化，而且能很好地 去除猪油中已有的过氧化物 。川 I 佛手精制黄酮与同浓度 的粗制黄酮相比，其抗氧化能力均强于同浓度粗制黄酮，并且随着时间的延长，抑制能力降低。1008060402O2010 年第 3 期lOO 一 。目一0 山8060402O00 1 2 3 4 5时间 (d)图 3 不同抗氰剂对猪油的抗氧化作用3 讨论通过单因素和正交试验设计确定超声波辅助法提取川佛手黄酮的最适宜工艺条件为：乙醇体积分数 70，提取时间 40rain，提取温度 60，提取 2 次，超声功率为 420w，固定因 素料液比为 1g：15mL。各因素对黄酮提取量影响的主次顺 序为：提取时间(A)提取温度(B)提取级数(D)超声功率 (C)。在最优条件下，重复 5 次，平均得率为 536。该法简便快捷，得率较高，重现性好，可为工业生产提供技术参考。将川佛手粗黄酮溶于 70乙醇中，过滤、减压蒸馏，分别 依次加入正丁醇和 1氢氧化钠进行萃取精制。将精制后的 黄酮提取液和粗黄酮提取液同浓度用于抗氧化试验，结果表 明精制后的黄酮提取液抗氧化能力有所增强，说明这种简单的精制方法比较有效。川佛手黄酮在猪油中的抗氧化性能试验说明川佛手黄酮对猪油有较强的抗氧化能力，随添加量的增加，抗氧化能力也随之增强。抗氧化能力强于同浓度柠檬酸低于 EDTA。表明佛手黄酮是一种良好的天然抗氧化剂，可创造经济价值，值得进一步开发利用。参考文献：1国家药典委员会中国药典：一部 s北京 ：化学工业出版社，2