挑战杯社科类论文作品

1快速诊断 PRRSV 高热变异株和北美株的 RT-PCR 检测试剂盒的研究与应用第一部分 文献综述1 猪繁殖与呼吸综合征猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory，PRRS） ，俗称“蓝耳病” ，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Virus，PRRSV ）引起猪的一种繁殖障碍和呼吸系统的传染病，具有很强的传染性，不同年龄、品种和性别的猪均能感染，临床表现为母猪繁殖障碍，呈现流产、死胎、木乃伊胎及弱仔等症状，仔猪及育成猪主要表现为呼吸系统症状。本病于 1987 年在美国北卡罗来纳州首次发现，然后迅速向世界各地蔓延，先后在加拿大、日本、德国、荷兰、西班牙、法国、英国、丹麦等国家发生 1-7。1991 年初，我国台湾地区出现此病流行，于 1996 年分离到了引发该病的病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，从而证实了本病在我国发生与蔓延的流行状况 8。1995 年孙颖杰等在我国进口美国的种猪中检测出 5 头种猪的病毒抗体呈阳性，同年中国农业科学院哈尔滨兽医研究所郭宝清等首次从国内疑似 PRRS 的猪场中分离到 PRRSV，从而证实了本病在我国大陆地区的存在 9。简中友等 10对采自（1995-1996 年）国内有生殖病史及疑似有 PRRS 猪场的 47 份血清样品进行检测也证实 PRRS 在我国已经存在并正在流行；随后有关本病在国内猪场频繁发生的报道就一直没有停止。现在本病己在世界各主要养猪国家和地区广泛存在和流行，已成为现代规模化养殖的主要疫病之一，严重影响养猪业的发展，给养猪业带来重大的经济损失。2 猪繁殖与呼吸综合征病毒分子学研究进展猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种具囊膜的单股正链 RNA 病毒，归属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属 11，与该科其他成员之间在病毒形态、基因组、复制方式和蛋白组成上相似，但它们之间并无血清学交叉反应。病毒粒子呈球形，直径 45-65nm，十二面体对称，核衣壳约 25-35nm，上有长约 5nm 突起，外绕一层脂2质双层膜，易被脂溶性溶剂如氯仿、乙醚等溶解，在氯化铯密度梯度中浮密度为1.13-1.19g/cm3，在蔗糖密度梯度中为 1.18-1.23g/cm312。病毒无凝血性，不凝集猪、绵羊、山羊、牛、兔、豚鼠、鸡、鸭、鹅和人 O 型红细胞，但病毒用非离子除垢剂处理后，再用脂溶剂处理，则可凝集小鼠的红细胞。病毒对多种巨噬细胞具有亲噬性，包括肺泡巨噬细胞（PAM） 、外周血单核细胞、肺血管内巨噬细胞（PAM ）等接种后 24-72h 可观察到特异的细胞病变，病毒量可达 105-106/ml。猪脾巨噬细胞、脑小胶质细胞以及传代细胞系 MA-104、Marc-145、CL-2621 和 CRL-1117 等均可复制病毒。病毒在巨噬细胞中复制具有抗体依赖性病毒增强作用(ADE)。 Yoon13的研究证实同一毒株对抗体的中和作用与抗体效价呈负相关，表明抗体的存在可增强对细胞的感染。PRRSV 基因组存在高度变异性，通过氨基酸序列比较发现，PRRSV 更接近于小鼠乳酸脱氢酶病毒（LDV） 。根据病毒基因组的差异，PRRSV 可分为两个血清型：欧洲型（LV 株为代表株）和美洲型（ATCC-VR-2332 株为代表株） 14，病毒的两个血清型间的氨基酸的同源性为 78-81%，美国和欧洲分离的病毒毒株，在抗原特异性上存在差异。我国目前分离的 PRRSV，应用多价血清和单克隆抗体检测，近似于美洲株，是否有欧洲型毒株存在尚不清楚。PRRSV 为不分节段、聚腺苷酸化、有囊膜的单链正股 RNA 病毒，其基因组长约为 15kb，含有 9 个开放阅读框架（ORFs） 15，病毒基因组的每个阅读框和相邻阅读框有部分重叠。ORF1 是最大的一个阅读框，长约 12kb，约占病毒基因组的 80%，包括 ORF1a 和 ORF1b，位于基因组的 5， 端，编码病毒 RNA 聚合酶，其上有长约189 个核苷酸的 5， 端非编码区，高度保守。ORF2 和 ORF7 为编码病毒基因组的结构基因，主要编码病毒的功能性蛋白。在 ORF7 终止密码子之后是 3， 非编码区，含有 poly（A）结构，其长度在 14-23 个核苷酸之间（平均长度为 17 个核苷酸） 16，在 poly（A）尾上游有一个高度保守的八核苷酸序列。3 ， NCR 在两种血清型毒株中的同源性尾 76%，Meng 等 16认为这段序列的功能是聚合酶的结合区，用以启动负链 RNA 的合成。3 PRRSV 高热变异株和北美株概述2006 年 6 月，我国部分地区养猪场发生了无名高热病，主要是猪繁殖与呼吸障碍综合征病的变异株引起的“高热病”或“无名高热病” ，引起养猪界的恐慌，可谓3我国养猪业的一场浩劫，造成严重的经济损失。该病引起了国务院和农业部的高度重视，世界动物卫生组织（IEO）及国际兽医界也投予关注目光。对此农业部组织相关部门进行科技公关，确定该病的病原为高致病性蓝耳病病毒（猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒）的变异毒株，称为 PRRSV 高热变异株。该变异毒株与 1996 年在我国流行的蓝耳病病毒相比，毒力和致病力都显著增强。宁宜宝等 17在 2007 年研究表明，从我国南方某猪场分离出美洲型猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的变异毒株。周艳君等 18从来自不同地区的患“高热病” 的死亡猪的多份样品中分离到蓝耳病病毒 ORF5 核苷酸和氨基酸序列分析表明这些新分离到的毒株具有很高的同源性，但与 1996 年分离的毒株有很大的差异。童光志等 19对中国大陆 1996 年-2006 年猪繁殖与呼吸综合征病毒的 GP5 蛋白的遗传变异进行分析，结果表明中国大陆 1996 年-2006 年猪繁殖与呼吸综合征病毒株与 VR-2332 株( 北美型病毒代表株)具有较高的氨基酸同源性 (85.5-99.0)，而与LV(欧洲型病毒代表株 )同源性较低(53.5-57.0 )，说明我国主要流行的毒株均为北美型，而且分成两个遗传关系相距较大的亚群，分别位于北美型毒株进化树的两极亚群 I 所有毒株在病毒的主要中和抗原表位的抗体结合位点都发生变异：而亚群 II 则在此处高度保守在两个潜在的毒力相关氨基酸(R13 和 R151)处，亚群 I 所有毒株均与标准强毒 VR-2332 一致，而亚群 II 所有毒株则与疫苗株 RespPRRSVRepro 一致从氨基酸序列的变异特征来看，亚群 I 毒力更强，而且比较容易逃避机体体液免疫：从地理分布位置来看，亚群 I 主要集中在我国的东南沿海一带。4 猪繁殖与呼吸综合征诊断方法研究进展4.1 临床诊断猪繁殖与呼吸综合征的主要特征是各种年龄猪都可感染发病，病猪表现为发热、嗜睡、厌食；繁殖母猪受精率下降，妊娠母猪发生流产、死产、木乃伊胎及体弱仔猪；种公猪感染后精液质量和精子活力受到影响；仔猪和育肥猪出现咳嗽、喷嚏、呼吸急促和呼吸困难，耳部及肢体皮肤发给。猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株间的毒力变化差异很大，从而在不同地方及不同猪群中的症状表现不一。这些年来，本病的临诊表现及流行病学也出现了新的变化，如隐型感染及慢性感染病例显著上升，持续性感染在猪群中较为普遍。由于本病同其它引起猪繁殖障碍性的疾病：如猪细4小病毒病（Porcine Parvovirus Infection） 、伪狂犬病 (Porcine Pseudorabies)、猪瘟(Swine Fever)、日本乙型脑炎(Epidenmic Encephalitis B)、布鲁氏菌病(Brucellosis)等，表现出极为相似的症状，并伴随混合感染和继发感染，综合考虑流行病学及临床表现来对 PRRS 进行初步诊断，已显得越来越困难。因此，仅仅根据流行病学及临床表现的特点已很难对本病做出诊断。4.2 病毒分离病毒分离是诊断该病最确切的一种方法，一般采用相应细胞分离，常用的分离PRRSV 的细胞有猪原代肺泡巨噬细胞(PAM)，MA104 细胞系的克隆 Marc-145，CL2621 细胞等。尽管可以从许多组织分离到 PRRSV，但血清和肺组织分离成功率最高 20,21，病毒分离时最好采用死胎或活产仔猪的肺、心、脑、肾、肝、脾、淋巴结等组织的匀浆混合物，然后接种于适当的细胞培养物。尽管可以从许多组织中分离到 PRRSV，但血清和肺组织分离成功率高，尤其血清采样方法方便可靠，因感染 PRRSV 后 12-24 小时即可在感染猪的血液中发现较高滴度的 PRRSV，分离物接种 PAM 细胞后一天即可出现 CPE，细胞呈现灶状、变圆、膨大，随后皱缩、脱落形成空洞。不同分离株在细胞培养上生长增殖情况各不相同，有些毒株在每一代细胞培养 3-4 天即可出现 CPE,但有些毒株则在第三代才出现 CPE，这对结果的判定造成一定的影响。荷兰中央兽医研究所 Wensvoort22在世界上首次分离到 PRRSV，从病毒培养特性、致病性等方面证实该病原为一种新的病毒。随后，美国研究人员用其它细胞也从北美洲分离到 PRRSV。国内郭宝清、陈博文、姜平、杨汉春、刘文兴、林绍荣、卢银华、许立华等用类似方法相继从一些地方分离到 PRRSV。4.3 核酸探针技术（ISH）核酸探针技术是在分子标记基础上以病毒RNA基因组为模板制备探针，在cDNA合成后进行Southern-blotting，特异的核酸探针会在不同病毒基因组cDNA上产生特异的条带。Cruliere等 23-25利用猪瘟病毒基因组 RNA构建cDNA ，与牛病毒性腹泻病毒进行序列分析，合成了6个探针，按照它们在病毒基因组的位置，根据特异杂交带区分出了猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒以及绵羊边界病病毒。赵启祖等 26研制了猪瘟病毒石门血毒核酸探针，可检测病毒RNA的存在和对病毒RNA进行定量检测，灵敏度达220 pg。核酸探针技术特异性强、准确可靠，可用于不同毒株的分离和鉴定，但诊断费用较高。5国内外学者应用生物素标记的方法制备了互补的ORF1b和ORF7的两种寡核苷酸探针，建立了检测福尔马林固定的肺和淋巴结组织中的PRRSV-RNA杂交技术 27。Sur等 28应用地高辛标记方法制备了PRRSV特异的 cDNA探针，用于检测甲醛固定的石蜡组织切片，在感染后期仍可检测取病毒RNA，ISH特异性好、快速、敏感，可用于临床诊断和抗原定位。4.4 RT-PCR 技术病毒分离诊断法中细胞培养是一项工作量大，需要时间长，技术性较强的工作，而血清学方法诊断 PRRS，操作步骤较繁琐，另外，由于 PRRSV 各毒株之间的抗原性存在较大的差异，迄今尚无一种血清学方法能检测到所有的 PRRSV 毒株，况且血清学方法最早也只能检测到感染后一周以上的 PRRSV 抗体，因此需要寻找一种有效的 PRRSV 诊断方法。最近国外和国内均建立了 RT-PCR 检测方法。国外应用 PCR 诊断 PRRSV 已取得很大进展，许多学者根据 PRRSV 不同的 ORF 序列，设计了不同引物，建立了检测 PRRSV 核酸的 RT-PCR 方法。可以直接从 PAM 分离培养物、临床样品(肺泡巨噬细胞、血清和血浆，肺脏组织以及精液等)中扩增出预期的片断，并获得较高的敏感性和特异性。一些学者在 ORF1b 的基础上扩增引物，建立了 RT-PCR 方法来检测PRRSV 的 RNA 核苷酸，并将其与病毒分离和血清学方法进行比较，证明 RT-PCR方法比其它两种方法更敏感更有效，在感染后 24h 就可检测出病毒 RNA 核苷酸，而在检测血清样品中，当可能存最低浓度的循环病毒时，在感染初期及感染晚期(28d)均有用 RT-PCR 检测为阳性，而用病毒分离法检测有些样品却为阴性。同时他们还建立了针刺耳静脉，用滤纸片收集全血取样的方法，这样可以减少污染机会，且可进行大量猪群的检测。我国娄高明等 29根据 PRRSV 的 ORF7 序列，设计一套引物建立了 RT-PCR 方法，试验结果证明其效果较好，且可从基因水平上区分 PRRSV美洲型和欧洲型，而且对国内疑似为 PRRSV 送检样品进行检测，确定其为美洲型。因此 PRRSV 山东分离株 ORF7 基因的原核表达与 RT-PCR 快速检测方法无疑是一种快速、准确、灵敏的诊断方法。4.5 免疫过氧化酶酶单层细胞实验（IPMA）IPMA 是最早建立检测 PRRSV 抗体的方法，可用 PAM、CL26521 或 MARC-145 细胞完成，该方法敏感性较好，特异性性强。在欧美等国 PRRSV 感染的研究中6已广泛应用。Wensvoot 等 30,31首先建立了 IPMA 检测 PRRSV 血清抗体的方法，并能在感染后 6 天血清中检测到 PRRSV 抗体。该方法是将已接种病毒的培养细胞，在一定时间内固定，再先后加入待测血清和酶标二抗，经过一段时间反应后，加入底物显色，通过普通倒置显微镜，即可判读结果。国内王刚等 32用 IPMA 检测北京三个猪场，结果欧洲株抗体阳性率为 9.6%，美洲株抗体阳性率为 51%，且证明其特异性及敏感性与间接免疫荧光抗体试验（IFA）差异不大，但 IPMA 结果判定有一定的主观性，不能自动显示，且大规模检测太贵，因此未得到广泛应用。4.6 免疫胶体金技术Mager 等 33用特异性单抗 MAbSDOW-17 建立了检测 PRRSV 抗原的免疫金银染色方法（IGSS） ，他们用 10TCID50、HVA-92-1 和 10TCID50HVA-92-2PRRSV 毒株鼻内分别人工接种 3 周龄的仔猪，接种后第 6 或 8 天扑杀，结果在酒精固定、福尔马林固定及冷冻保存的肺脏组织中检测到 PRRSV 抗原，在接种后第 4、6、8 天后从酒精固定的扁桃体、胸腺、淋巴结、肾脏等组织中检测到抗原。4.7 酶联免疫吸附试验(ELISA)酶联免疫吸附试验(ELISA)酶免疫分析技术是继荧光技术后发展起来又一先进检测技术，其基本原理是将特异性反应系统、间接放大系统和显示系统结合起来，用于检测抗体或抗原 34。Albina 等 35用 PRRSV 细胞培养物经纯化后制备抗原建立了检测 PRRSV 抗体间接 ELISA 方法，当阳性抗原孔 OD 值与空白对照孔的 OD 值之比大于 5 时即判定为阳性。因纯化抗原制备不易，兼具有散播病毒的可能，其后，一些学者建立了重组抗原 ELISA 方法，其中以 N 蛋白最为理想。Takikawa 等 36对ELISA 方法进行了改进，使 ELISA 检测更敏感，且具高度特异性。国内学者相继建立间接 ELISA、Dot-ELISA 以及单抗捕获 ELISA 方法。ELISA 因具快速、经济、客观，半自动化的特点，能自动显示结果，更适于短时间内检测大批样品。4.8 血清中和试验（SN）血清中和试验是一种特异高的方法，可区别 PRRSV 的不同毒株，但 PRRSV的 SN 抗体在血清中出现的时间晚，敏感性较差，不适于早期诊断。Yoon 等对 SN进行了改良，在试验中加入 20%新鲜健康猪的血清以增加补体含量，使 SN 检测时间提前到了感染后的 9-11 天，但 SN 抗体持续时间较长，可长达 6 个月 37。由于中和试验操作费时，技术要求高，目前仅限于实验室研究。74.9 血凝（HA）和血凝抑制（ HI）实验PRRSV 不凝集多种动物的红细胞，但可以凝集 BALB/C 小鼠红细胞，病毒材料经吐温 80 和乙醚处理后活性增强，效价增强 4-8 倍，可达 1:128。用 MARC-145细胞培养的 PRRSV，经乙醚和吐温处理后，在 4和 37均可凝集小鼠红细胞并且这种凝集反应能被 PRRSV 特异性抗体所抑制。但对牛、羊、马、猪、豚鼠、鸡、鹅的红细胞却没有凝集作用。此法简单，但能否直接检测组织中的 PRRSV 还需探索。由于本方法处理病毒还存在一些尚未解决的问题，所以在我国还未广泛使用。4.10 间接免疫荧光抗体试验（IFA）Yoon 等 38首次报道了用 IFA 检测 PRRSV 血清抗体，且广泛应用于北美。IFA具有较好的敏感性和特异性，可用 PAM、CL26521、MARK-145 培养物进行 IFA。国内郭宝清等应用 IFA 检测了全国 10 个地区的猪场，其中阳性约为 40%，阳性猪场的平均阳性为 58.5%39。因 IFA 需要细胞培养和显微镜观察，结果判定具一定的主观性，无法自动显示，临床应用具有一定的限制。4.11 荧光定量聚合酶链式反应温国元等 402004年将PCR 技术、荧光能量共振转移和核酸杂交技术相结。采用荧光定量PCR技术对猪瘟病毒进行快速定量检测。试验证明，该方法的检测灵敏度可达10-9 拷贝 /Ix L。通过该方法与RT-PCR、多重PCR的比较发现该方法检测灵敏度比RT-PCR高100倍，与多重PCR具有相同的灵敏度，并且该方法避免了常规PCR电泳检测所带来的高污染率。该方法具有快速、灵敏、低污染率的优点。2005年武汉大学病毒学国家重点实验室又将该技术应用于猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病病毒(PRV) 的检测。采用数据库序列搜索和同源性分析，选取相应的靶序列，设计出CSFV与 PRV的PCR引物和探针，建立了CSFV 和PRV 荧光定量的PCR检测技术，该方法定量检测的线性范围为101-108拷贝病毒核酸分子，最小检测限为1O拷贝。荧光定量PCR检测技术比传统的检测方法的灵敏度提高了2-3个数量级，重复性检测的变异系数小于5%。具有耗时短、步骤简单、高通量和定量检测病毒等特点，适用于动物组织中猪瘟病毒和伪狂犬病病毒的快速定量检测，实现病毒检测技术的定量化、标准化和科学化。85 结语由于PRRSV的广泛传播给世界养猪业带来了严重危害，本病已引起各国的高度重视，相关研究不断展开，各种检测技术不断涌现。但由于现阶段对本病的研究还不够成熟，各种检测技术尚存在着不足之处，需进一步优化。本研究选取了PRRSV 的高热变异株和北美株，建立快速RT-PCR检测方法，并在此基础上进行相应试剂盒的研制。利用所研制的试剂盒对“高热病”进行快速检测，同时根据所扩增出的特异性片段区分两毒株，为更好的预防和控制该病的发生提供技术保障。随着相关学科和技术的不断发展，以及对本病研究的进一步深入，相信会有一种特异性强、灵敏性高、简便易行的新型检测诊断方法终将问世，并得以推广应用。9第二部分 实验部分1 材料与方法1.1 试验用毒株以及临床病料实验室提供的 PRRSV 高热变异株（H-VR-2332） 、PRRSV 普通北美株（VR-2332） 、猪瘟病毒（CSFV ） 、日本乙型脑炎病毒（JEV ） 、猪伪狂犬病病毒（PRV ） 、猪细小病病毒（PPV） ，采自四川（150 例） 、重庆（85 例） 、江苏（10 例） 、广西（40 例） 、云南（35 例）共 320 份疑似 PRRS 病料。1.2 病毒核酸抽提试剂 Total RNA 抽提试剂 RNAiso Reagent 购于宝生物工程（大连）有限公司，H-PRRSV PCR 检测试剂盒购于北京世纪元亨公司，饱和酚、氯仿、异丙醇，乙醇。1.3 PCR 相关仪器 MyCycler PCR 扩增仪由美国伯乐公司生产，核酸抽提用离心机为德国 Sigma公司生产，凝胶成像系统购于日本索尼公司。各种型号的 Eppendorf 管、微量加样器、无菌操作台、冰箱。1.4 特异性引物 根据 Genbank 已发表的 PRRSV 高热变异株和普通北美株的 Nsp2 基因序列，在林华博士的指导下，利用引物设计软件 Primer 5.0 各设计出 1 对特异性引物，分别扩增出 186bp、470bp 目的片段。1.5 病料的处理剪取约 1.0g 的样品组织于灭菌的磨浆器中，剪碎组织，加入 3mL 左右的生理盐水，进行研磨，将组织匀浆倒入 Eppendorf 管中，置于-20冰箱中反复冻