食品中金黄色葡萄球菌的分布及其肠毒素基因的研究PPT课件

食品中金黄色葡萄球菌的分布及其肠毒素基因的研究,目的意义 近年来，随着消费者对食品安全的关注及国际贸易环境的要求，食品安全问题得到了前所未有的关注。而由致病性微生物和其他有毒、有害因素引起的食物中毒和食源性疾病的发病率是衡量食品安全状况的直接指标，是食品安全问题最直接的体现。 金黄色葡萄球菌是引起 细菌性食物中毒的重要病原菌之一 ，无论在发达国家还是在发展中国家由金葡菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒中均占有较大比例。该菌在自然界中分布广泛，并且在人体主要存在于皮肤、粘膜，特别是鼻咽部，30%80%的人群为该病原菌的携带者，因此，金葡菌污染食品的机率较大。 对于病原菌的分离鉴定、污染监测和对食物中毒等突发事件的追踪干预，其最终目的是找出感染源及传播途径，预防食源性疾病的发生和蔓延。而快速追本溯源的有效手段是分子亚分型的方法。我国金葡菌研究领域内，该研究仍为空白 ，鉴定手段仍停留在血清，生化反应等表现水平上，从而限制其溯源及鉴定能力。通过不同食品样品，研究金葡菌的来源分布，通过对金葡菌进行鉴定分析，研究金葡菌的分布，为食品安全标准的制定，食品安全检测提供依据；在此基础上，依据金葡菌中存在的三种肠毒素基因（肠毒素有多种类型，其中SEA毒性最强，引起的食物中毒最多，SEB耐热性强于其他种肠毒素，SEE出现率较低）研究这三种致病因子的分布，找出不同来源金葡菌菌株间的分布规律，为金葡菌的监控、暴发流行的检测及追踪污染源提供依据。,研究现状： 葡萄菌属系微球菌科，现有19个种，从人体上检出的有12个种，如金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌等。产肠毒素的葡萄球菌有两种：金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。一般认为产生凝固酶是葡萄球菌致病力的良好指标，而表皮葡萄球菌虽具有致病力，但凝固酶阴性。,金黄色葡萄球菌生物学特性： 形态与染色：典型的金葡菌为球形，直径0.8m左右，显微镜下排列成葡萄串状。金葡菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜。革兰氏染色阳性。 培养特性：金葡菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37，最适生长pH7.4 。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径12mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金葡菌有高度的耐盐性，可在10%15%NaCl肉汤中生长。 生化特性：金葡菌可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，V-P反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。金葡菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。,金葡菌流行病学特点： 1.季节分布，多见于春夏季。 2.中毒食品种类多，主要以各类熟肉制品、乳及乳制品、蛋及蛋制品，其次为含有乳制品的冷冻食品，个别的淀粉类食品等。 3.食物中金葡菌来源及肠毒素形成条件：金葡菌在自然界中无处不在，人和动物的鼻腔、咽喉、消化道带菌率较高。健康人带菌率为20%30%，上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。一般说，金葡菌可通过以下途径污染食品：食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。,影响肠毒素形成的条件： 1.食物受污染的程度：食物受金葡菌污染的程度越严重，繁殖越快越易形成毒素。 2.食物存放的温度：在37内，温度越高，产毒时间越短。 3.食物存放的环境：通风不良易形成肠毒素。如污染金葡菌的剩饭在通风不良的条件下存放，极易形成毒素。 4.食物种类，及性状。含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，或含油脂较多的食物，肠毒素易生成。如带金葡菌的生肉馅在37下经1819h产生肠毒素，而在肉馅中加入馒头碎屑或淀粉时，在同样的温度下只需8h就能产生毒素。 金葡菌肠毒素是个世界性卫生问题，美国CDC报告在美国由金葡菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，某些欧洲国家如匈牙利、芬兰等占50%以上。我国每年发生的此类中毒事件也非常多。,致病性： 金葡菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。 金葡菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶： 溶血毒素：外毒素，分四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起机体局部缺血或坏死； 杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； 血浆凝固酶：当金葡菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关。 脱氧核糖核酸酶：金葡菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金葡菌。 肠毒素：SE主要是由血浆凝固酶和耐热核酸酶阳性的菌株产生的一类结构相似、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质。研究表明，所有的毒素都有以下共同特性：1.具有引起急性肠胃炎的能力（催吐）2.刺激非特异性T细胞增殖的超抗原特性3.对热河蛋白酶消化作用的抵抗能力4.分子内都存在二硫键。肠毒素导致葡萄球菌胃肠炎性食物中毒和刺激非特异性T细胞增殖的超抗原特性分属毒素蛋白质的不用结构区域所控制，但他们之间存在很大的相关性，多数情况下，超抗原活性的损失往往会伴随肠毒素活性的减少。,金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素,共有A、B、C(C1、C2、C3)、D、E、G、H、I、J、K、L、M、N、O14个血清型。爆发性食物中毒中最常见的血清型为A和D型,B和C型次之,其中A型的毒力最强,B型的耐热性强于其它型,E型的出现率最低。据报道含有106一108cfu/g(ml)的金黄色葡萄球菌可以产生导致食物中毒症状有效量的肠毒素。当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品,如肉与肉制品、牛奶和奶制品、蛋等,在温度条件适宜时,经8I0h即可产生相当数量的肠毒素。肠毒素可耐受100煮沸30min而不被破坏。并能抵抗胃肠道中蛋白酶的水解作用,因此,破坏食物中存在的金黄色葡萄球菌需在100加热食物2h。肠毒素刺激肠上皮细胞,通过环磷腺苷和环磷鸟苷分泌途径,及两个独立于环式核苷酸的途径钠、水分泌,产生腹泻。同时有研究表明,金黄色葡萄球菌对小肠粘膜细胞无直接的破坏作用,而以完整的分子经消化道吸收入血,到达中枢神经系统后刺激呕吐中枢而导致以呕吐为主要症状的食物中毒。 此外,金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肤酶等。,分离鉴定方法,金黄色葡萄球菌的检测方法主要有传统的分离鉴定法、免疫学检测法和核酸检测法。目前,由于PCR技术具有特异性、敏感性、快速性等特点被广泛应用于金黄色葡萄球菌的检测。其特异的引物主要依据金黄色葡萄球菌的特异毒性基因序列或其基因组中的特异序列而设计。与此同时,金黄色葡萄球菌的亚分型方法在近几年也得到了很快的发展,尤其是以DNA为基础的遗传亚型的建立。它主要包括脉冲场凝胶电泳(PFGE)、核糖体(Ribotyping,RBT)分型和DNA序列分析等。脉冲场凝胶电泳对金黄色葡萄球菌的分辨率高、敏感性强,但它检出的菌株间小的遗传差异在流行病学上是没有意义的;而且,即便在两个样本间检测出相同的脉冲场凝胶电泳型,也并不一定意味着两个分离株之间存在必然的联系。核糖体分型使用内切核酸酶如EcoRI能将金黄色葡萄球菌菌区分为与表型和毒力相关的不同基因型,但分辨率和准确性不够高。,以DNA序列分析为基础的亚分型主要指多位点序列分型(MLST),它通过对多个基因或基因片段进行测序来确定细菌的亚型及各分离株之间的遗传相关性。一般来说MLST的靶基因是通过中性改变而引起的多样化基因(通常是看家基因),而不选用阳性选择引起的多样化基因(毒性基因),因为这些基因并不能反映分离株之间的遗传进化关系。但另一方面毒性基因的多样性高,对其测序区分能力更强。作为致病性的金黄色葡萄球菌,能产生多种毒素蛋白,其中引起食物中毒的主要是肠毒素,所以越来越多的学者把研究的重点转移到关于肠毒素基因在菌株间分布规律的摸索上来。肠毒素是一类结构相关、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质,除了SEA、SEB、SEC、SED、SEE等5种早已被鉴定的血清型外,近几年还发现了SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN和SEO等新型的肠毒素。由于缺乏简单特异的检测方法,新发现的各型肠毒素与食物中毒之间的关系尚未明确。国外有采用PCR方法检测新发现的肠毒素基因的报道,也有少量的各型肠毒素基因分布的报道。,金黄色葡萄球菌的鉴定,传统的金黄色葡萄球菌的分离鉴定方法是Baird一Parker平板分离,然后通过革兰氏染色镜检,溶血试验,最后是血浆凝固酶试验鉴定。而通常血浆凝固酶试验阳性与否被作为判定金黄色葡萄球菌的金标准,但此方法存在着假阳性。本次试验又补充了针对金黄色葡萄球菌nuc特异基因的PCR方法验证,可以更加准确的鉴定菌株。 在分离金黄色葡萄球菌所用到的Baird一Parker培养基中,含有甘氨酸、氯化锉和亚磅酸钾这三种成分。其中,前两种是起到抑制非致病葡萄球菌的作用;后一种是起到抑制革兰氏阴性菌的作用。通过生理生化试验和镜检的结果表明,这三种成分并不能充分抑制杂菌,进而增强了其最后试验结果假阳性的可能性,从而PCR方法的验证就更为重要。,预防措施,1.防止食品受到金黄色葡萄球菌的污染:定期对生产加工人员进行健康检查,患局部化脓性感染(如疥疮、手指化脓等)、上呼吸道感染(如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等)的人员要暂时停止其工作或调换岗位。另外,牛奶厂要定期检查奶牛的乳房,不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶;奶挤出后,要迅速冷至10以下,以防毒素生成、细菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶为原料,注意低温保存。患局部化脓感染的禽、畜尸体应按病畜、病禽肉处理,将病变部位除去后,按条件可食肉经高温处理后以熟制品出售。 2.防止金黄色葡萄球菌的生长和产毒:金黄色葡萄球菌主要污染一些蛋白质含量较高的低酸性食品,当这些食品被污染后,于室