克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用

克隆性基因重排在淋巴瘤诊断中的应用Clinically Suspicious LNBiopsyMorphology with IHCIf necessary,Molecular DxCytogenetics/FISHEvaluation of the Suspicious Lymph NodeCarcinoma v. LymphomaFNAWith Flow CytometrySuspect LymphomaCarcinomaCLL Suspect Lymphoma,Negative orNon-diagnosticWorkup for Primary DiagnosisStaging and TreatmentFISHTreatmentNCCN NHL Lymphoma Guidelines（ 5-10% ）分子和细胞遗传学异常 抗原受体基因的克隆性重排 与类型相关的染色体异常l简要原理l检测方法l应用和策略l注意事项淋巴细胞表面受体l IG： IGH （ 14q32)IGL (2q12) (22q11)l TCR: TCR 14q11TCR 7q32TCR 7p15 TCR 14q11.2IG和 TCR基因结构及重排过程胚系可变区 恒定区胚系D-J重排V-D-J重排转录与拼接各区片段数多 重排的多样性 抗体多样性IGH IGK IGL TCRA TCRB TCRG TCRDV 66 43 38 46 47 6 8D 27 76 56 54 67 9 8J 6 5 5 61 13 5 4淋巴细胞发育过程中基因重排顺序 IG: H重排 : IgH/ 缺失 ： IgH/ TCR: ： TCR： TCR 淋巴瘤中基因重排形式 克隆性重排不同的淋巴细胞相同的重排形式淋巴细胞单克隆性增生淋巴瘤诊断和鉴别诊断的分子指标克隆性重排的检测方法 Southern 杂交 PCR法特异性探针： 胚系的特征性片段外另一不同大小的片段Southern 杂交 优点： 敏感性较高可靠性高 缺点： DNA量多（ 10ug)新鲜组织操作复杂时间长、成本高放射性同位素逐渐被 PCR方法替代PCR法原理 : VDJ重排 后相互靠拢，用适当的引物可扩增出重排片段新鲜、冻存、石蜡、显微切割或细胞学标本，不受 DNA片段的影响，仅需要少量的 DNA，时间短，敏感性高，是目前最常用的克隆性重排的检测方法。引物的选择原则l 引物位置： PCR产物长度 10-15bpl 引物本身的长度 25bpl 精确地将所有 VDJ基因片段捡出l 家族性引物或通用引物l 不同的组合具有互补性，提高阳性率l 引物数目和同源性之间平衡 该协作研究由 47个研究所组成 7个网络和一个病理 panel。它由分子生物学、免疫学、血液学、病理学等领域的专家。1998.6-2002.7， 12次国际性会议。主要目的： （ 1）开发和标准化 PCR实验操作和 PCR引物 （ 2） 评价和应用该标准化方法BMH4 CT983936的欧洲 BIOMED 2 协作研究设计了一套完整的引物和方法用于 IG和 TCR基因重排的克隆性分析，共有 14管 97对引物IGH（ A,B,C,D,E 5管）IGK（ A， B 2管）IGL（ 1管）TCRB（ A， B， C 3管）TCRG（ A， B 2管）TCRD(1 管 )Van Dongen JJM et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the Biomed-2 concerted action BMH4-C98-3936 Leukemia 2003;17:2257-2317所有引物采用相同的扩增条件和检测方法，并具有很高的敏感性和特异性，已被推荐为可疑淋巴组织增生性疾病克隆性分析的标准方法，试剂已商品化/PCR产物分析方法克隆性重排判断基本原则：1. 条带在期望的碱基大小范围内；一条或两条2. 带宽不超过 1mm,3. 边缘整齐；多克隆性： 无特异性条带，弥散带或梯状带1. 聚丙稀酰胺凝胶电泳 (PAGE)-异源双链分析+ -2. 毛细管电泳基因扫描（ genescan）单克隆性细胞产生一个或两个尖的峰，多克隆为多个小峰，呈 Gaussian分布。（本课题组曾用两种方法分析 180管皮肤淋巴瘤的 TCR基因重排，两者的符合率为 96.7%, 在 TCRB用 genescan方法稍敏感，在 TCRD用 PAGE更特异。）对照的设立 阳性对照 阴性对照内对照 :3个病例的内对照 b-actin均为阳性- + - + - + - + - + - +FR2 FR3A TCRG1 TCRG2 TCRB1 TCRB2 对照的设立2007-01-04 control and 1克隆性基因重排的应用诊断与鉴别诊断谱系确定分期克隆相关性判断 （ 1） 形态和 IHC不能得出肯定结论的淋巴组织增生性病变胃肠道、肺、涎腺、甲状腺、眼眶等部位的 MALT淋巴瘤滤泡性淋巴瘤、皮肤淋巴瘤和 T细胞淋巴瘤形态不典型，缺乏特异性标记CP2170, 66M, 胃黏膜活检CP2171, 43F, 左腮腺肿块明显的浆样分化细胞- + - + - +CP2170 ： FR1 (+), FR2(+), FR3(+)诊断： （胃）小 B细胞淋巴瘤，倾向 MALT边缘区 B细胞淋巴瘤CP2171： FR1 (+), FR2(+), FR3(-)诊断：（左腮腺）符合 MALT边缘区 B细胞淋巴瘤（ 2） 形态和免疫组化均可考虑为淋巴瘤但部位少见或发病年龄不典型基因重排克隆性分析可增加诊断的依据54M, 舌跟部肿块， PTCL1M, 左颈鸡蛋大肿块 , PTCL?17 F, 右颈部淋巴结 FL38M, 左颈部淋巴结 AILT17F, 右颈淋巴结肿大内 FR1 FR2 FR3 - + - + - + - +CD20Bcl-23. 组织小或无法取得组织病变的诊断 深部肿块的穿刺或活检标本如胃镜标本 无明显肿块，仅表现为胸腹水但要特别注意细胞的量52M ， 左眼内吸取物细胞涂片检查：见恶性肿瘤细胞，小圆细胞肿瘤，倾向淋巴瘤基因重排： FR1(+), FR2(+), FR3(-)(4) 淋巴瘤谱系的判断 T or (富于 T) B? T or NK/T? , T or -T ? 34M, 右面部肿胀 5月， CD56-, TIA+, PE+, EBER+,