付瑞玲毕业答辩

硕士研究生：硕士研究生： 付瑞玲付瑞玲 导导 师：师： 范雄林范雄林 副教授副教授华中科技大学同济医学院病原华中科技大学同济医学院病原微生物学系微生物学系结核杆菌特异抗原 CFP21和 MPT64融合蛋白的重组表达、纯化及其免疫原性研究背景Estimated TB incidence rates, WHO 2004 0 - 2425 - 4950 - 99100 - 299No estimate300 or moreEstimated new TB cases (all forms) per 100 000 population结核病结核病 (TB)是经呼吸道传播的、严重危是经呼吸道传播的、严重危 害害全球人类健康的重大公共卫生问题全球人类健康的重大公共卫生问题 全球感染者占总人口的全球感染者占总人口的 1/3；我国感染人数我国感染人数 5.5亿；亿； 感染者发展为结核病的可能性为感染者发展为结核病的可能性为 5-10%； 缺乏特异的诊断方法；缺乏特异的诊断方法； 缺乏有效的疫苗缺乏有效的疫苗我国和全球结核杆菌感染者我国和全球结核杆菌感染者3. 值值潜伏感染者的筛检和预防措施潜伏感染者的筛检和预防措施 筛检方法：筛检方法： 非特异性非特异性 TST 的活性的活性 成份是成份是 纯蛋白衍生物纯蛋白衍生物 (PPD)，一种结核分枝杆菌，一种结核分枝杆菌非特异的混合物非特异的混合物 ,其检测结果可被目前临床上广泛使用的疫苗其检测结果可被目前临床上广泛使用的疫苗 卡介苗卡介苗免疫所干扰。免疫所干扰。 较特异性较特异性 更特异性更特异性 无无 预防疫苗：无预防疫苗：无研究目的1 建立更加特异2 寻找发展感染清除疫苗的适宜靶抗原3. 值值结核杆菌特异抗原的选择结核杆菌特异抗原的选择 RD1区 RD2区M. bovisM. tuberculosisM. Kansasii M.marinumM. lepraeM. szulgaiM. bovisM. tuberculosisBCG substrains（ 1921-1931） 保护性抗原如保护性抗原如 CFP21、 MPT64，分别能够刺激强，分别能够刺激强的迟发型变态反应和诱导结核病人和他们的接触者的外周血产的迟发型变态反应和诱导结核病人和他们的接触者的外周血产生高水平的干扰素生高水平的干扰素 重组表达重组表达 CFP21和和 MPT64的的 融合蛋白，建立了全血融合蛋白，建立了全血 IFN-水平分析技术水平分析技术 (rCM-WBIA)，检检测测 LTBI的的以及以及 评估该蛋白作为感染清除疫苗靶抗原的可能性评估该蛋白作为感染清除疫苗靶抗原的可能性CFP21和和 MPT64蛋白蛋白 研 究 人 群年 龄 范 围 （ 岁）受 试 者（人）男女比例结 核病患者 3810 10 4： 6密切接触者 3518 36 16： 20TST-对 照 203 40 22 18注 :所有参与者均为自愿 。实验流程IPTG诱导受试者TST- TSTrCM-TST-rCM-TST+rCM+TST-rCM+TST+rCM+TST+2.SDS-PAGEWestern blot1.构建原核表达质粒3.纯化 rCM4.建立rCM-WBIA TST健康者密切接触者研究结果研究结果Table1 Primer list and thermal cycle parameters for cloning of M.tuberculosis recombinant antigensAntigen Primer orientation and sequence （ 5-3） PCR parameters Amplicon sizeCFP21 F A A G G A T C C G A T C C G T G T T C G G A C A T C G C G G T C G R:GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCTCCGGCGTGATCGAGCCTGTTCGCC94 for 5 minThen 30 cycles94 for 1 min60 for 1 min 72 for 45 sThen 72 for 5 min608 bpMpt64 F:GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCGCGCCCAAGACCTACTGCGAGGAGR:GAAAGCTTCTAGGCCAGCATCGAGTCGATCGC 94 for 5 minThen 30 cycles94 for 1 min60 for 1 min 72 for 45 sThen 72 for 5 min671 bprCMF CFP21FrCMR MPT64R94 for 5 minThen 30 cycles94 for 1 min60 for 1 min 72 for 90 sThen 72 for 10 min1234bp2.SDS-PAGEWestern blot1.构建原核表达质粒3.纯化 rCM4.建立rCM-WBIA Fig.1 PCR results and the identification of the recombinant plasmid pPro2164. Lane 1, the recombinant plasmidpPro2164 digestion with BamHI and HindIII; Lane 2, PCR result of the fusion gene fragment encoding CFP21 andMPT64 with a 45bp linker; Lane 3, PCR result of the gene encoding mature MPT64; Lane 4, PCR result of the geneencoding mature CFP21; M represents DNA molecular marker.1.克隆原核表质粒Fig.4. IPTG induction of rCM in recombinant E. coli BL21(DE3). Lane 1, protein weight marker; Lane 2, protein expression in E. coli not induced with IPTG; Lane 3, protein expression in E. coli 4 hours post IPTG induction; Lane 4, protein expression in E. coli6 hours post IPTG induction. Fig. 2B. Western blot analysis .利用rabbit anti-His6 antibody和化学发光技术2.SDS-PAGEWestern blot蛋白纯化Fig.5. Purification of M. tuberculosis rCM in recombinant E. coli BL21. Lane 1, Marker Lane 2 ,supernatant after wash with Denaturing Binding Buffer; Lane 3, supernatant after wash with Denaturing Wash Buffer;Lane 4, supernatant after wash with Native Wash Buffer; Lane 5, purified elution with Native Elution Buffer.19 Kda121 Kda85 Kda45 Kda34 Kda25 Kda1 2 3 4 5试验方法的确立 超过 500pg/ml的人为感染者或患者；低于 500pg/ml为非感染者。IFN-水平 cut-off 值的确立PBS刺激 IFN- 水平 的平均值 为 30 15pg/ml PHA刺激 IFN- 水平的平均值为 5407.3 4593 pg/ml 健康的 TST-的未暴露人群（ n=40）的的 IFN- 水平的平均值 为 250110 pg/ml 500 pg/ml设为 IFN- 分析的 cut-off值Fig.7. rCM-WBIA 分析不同人群 产 生的 IFN-水平。22401062250110 14501179表 1 TST 与 rCM-WBIA 分析 结 果的比 较 rCM-WBIA TST+ -+-20 4 242 10 12合计 22 14 36合计表 2 rCM-WBIA 诊 断密切接触者的 结 果评 价指 标 点 值 标 准 误 95% CI灵敏度 90.9 0.48 89.96， 91.84特异度 71.4 0.075 71.25， 71.55Youden指数 0.62 0.13 0.37， 0.87符合率（ %） 83.3 014 83.02， 83.57Kappa值 0.64# 0.13 P0.001#： Kappa值在 0.45-0.75为 中、高度 一致， Kappa值0.75为极好的一致性。rCM-WBIA分析密切接触者的结果Fig .9. Comparison of TST and rCM-WBIA. The cut-off value for rCM-WBIA positive was calculated from 40 healthy unexposure persons and was set at 500pg/ml. A total 36 household contacts could be classified into four catalogues depending on the cut-off value.TST硬结直径与 IFN- 释放的关系 Fig.10. TST硬结直径与 IFN-释放的关系A：表示 TST-组与 TST+组和 TST+组之间 IFN-释放量都有显著性差异。B：表示 TST+组与 TST-组和 TST+组之间 IFN-释放量都有显著性差异。C：表示 TST+组与 TST+组和 TST-组之间 IFN-释放量都有显著性差异 。讨 论目的基因的获取 ：在设计中运用 GeneSOEing技术通过引入 Linker 序列构建CFP10-MPT64融合基因，并构建基因表达质粒 pProEXHTb- CFP10-MPT64。该技术对两个和多个基因的拼接十分有效，能保证重组基因片段的完整性和与原序列的一致性。 Linker序列具有良好的柔韧性和折叠性，并有足够的长度保证融合抗原中 CFP10和 MPT64形成与天然抗原类似的空间结构，从而形成具有各自抗原性较大的分子量的融合抗原。表达载体的选择： 原核表达载体 pProEXHTb所表达的重组蛋白带有的 6个连续组氨酸残基，可结合在 Ni2+-NTA柱上，又因咪胍可竞争地结合在 Ni2+-NTA柱上而将重组蛋白置换下来 融合蛋白的提取纯化提供了一种有效方法。rCM-全血 IFN-分析在 结 核病患者和感染者 诊 断中的意 义 TST和 rCM-WBIA分析分别诊断此次密切接触人群中 LTBI 的感染率分别为 61.1%和 66.7%。与常规的 TST比较， rCM-WBIA检测 LTBI的灵敏度（ 90.9）和特异度（ 71.4）。rCM-WBIA和 TST的总体一致率高达 83.3%，显示了良好的诊断一致性 (k =0.64)。该新方法操作