全国结核病耐药性基线调查报告

全国结核病耐药性基线调查报告篇一：124 例耐多药结核分枝杆菌基因突变特征分析124 例耐多药结核分枝杆菌基因突变特征分析 梁亚萍 11 赵丽丽 2 高漫 1 摘要：目的 对临床分离的耐多药结核分枝杆菌相关基因的突变特征进行分析。方法 对 124 例耐多药结核分枝杆菌和 50 株敏感株的耐药相关基因（异烟肼 inhA、 katG和 oxyR-ahpC 间隔区;利福平 rpoB ）进行序列测定，分析其基因突变情况。结果 异烟肼耐药 inhA 基因突变率为%；katG 基因突变率为%（87/124） ，主要位于 315 位；oxyR-ahpC 间隔区突变率为% ；inhA、 katG 两种基因同时突变率%，三种基因同时考虑突变率%。利福平 rpoB 基因突变的检出率高达%，突变主要发生在 531、526、516 位点。 结论 我省耐多药菌异烟肼耐药相关基因最常见突变为 katG 315、inhA C-T（-15） 、axyR-ahpC 间隔区(-10) C-T，利福平为 rpoB531、526、516。结合 MDR-TB 耐药相关基因的特征分析，可以建立一种快速、准确、特异的适合于我省的检测结核耐多药性的新方法。 关键词：结核分枝杆菌 耐多药 基因测序 突变 Analysis of characteristics of genetic mutation of 124 cases of multidrug-resistant mycobacterium tuberculosis Liang Yaping11Zhao Lili2Gao Man1 AbstractObjective: To analyze the mutation characteristics of multidrug-resistant mycobacterium tuberculosis related :Resistant genes of 124 cases of multidrug-resistant mycobacterium tuberculosis and 50 sensitive strains (inhA,katG and oxyR-ahpC spacer of isoniazid;rpoB of rifampicin)were given sequence determination to analyze the gene :Gene mutation rate of inhA was %; gene mutation rate of KatG was % (87/124),mainly in the 315;gene mutation rate of oxyR-ahpC spacer was %;mutation rate of inhA, katG at the same time was %,mutation rate of the three genes at the same time was %.Gene mutation rate of rpoB of rifampicin was %,and mutation occurred mainly in the 531,526,516 :The most common mutation of multidrug-resistant isoniazid genes in our province were katG 315, inhA C-T (-15),oxyR-ahpC spacer (-10) C-T,and the rifampicin were rpoB531,526, analysis of combining the feature of MDR-TB resistance related gene can establish a rapid, accurate, specific and suitable new method to detect multidrug-resistant tuberculosis. Key words: Mycobacterium tuberculosis ;Multidrug-resistant;Gene sequencing;Mutation 【中图分类号】：R52【文献标识码】：【文章编号】： 我国的耐药结核病流行情况较为严重，是全球 27 个耐药结核高负担国家之一，据全国结核病耐药基线调查结果显示1：我国肺结核病患者中耐多药结核（MDR-TB，指结核分枝杆菌同时对异 1 基金项目：陕西省卫生科研项目（) 作者简介：梁亚萍，女，本科，副主任检验师，主要从事结核病实验室诊断相关工作 烟肼、利福平耐药）耐药率为%。我省是结核病的重灾区，耐多药率高达%2，MDR-TB 的增多严重影响了结核病的化疗效果，使患者治疗费用高治愈率低，死亡率高，已成为我省结核病控制的难题。结核分枝杆菌耐药通常与某些基因突变有关，但不同地区的耐药相关基因突变特征有所不同。本研究对我院来自我省各地的结核患者 124 株耐多药结核分支杆菌进行了耐多药相关基因测序，异烟肼耐药相关基因 inhA、katG 和 axyR-ahpC,利福平耐药基因ropB，分析我省耐多药基因的突变特征，从而建立一种快速、准确、特异的适合于我省的检测结核耐多药的新方法。1 材料和方法标本来源：本研究菌株是收集本院 XX 年 8 月-XX 年2 月来自于我省陕北、陕南以及关中结核患者的 174 株结核分枝杆菌临床分离株，其中 124 株耐多药菌株和 50 株敏感菌株。 药敏试验:采用美国 BD 公司的 BACTEC MGIT 960 行利福平、异烟肼快速药敏实验，药物浓度及操作过程严格按照 MGITTM Procedure Manual 要求进行3。 DNA 模板的制备：采用 CTAB 法4提取结核分枝杆菌DNA。 PCR 扩增及序列测定：聚合酶链反应（PCR）引物序列见表 1，采用 50ul 反应体系。反应参数：95预变性5min；95 变性 40s，64退火 40s，72延伸 1min,35个循环，然后 72延伸 7min。PCR 扩增产物经%琼脂糖电泳后送北京擎科生物技术有限公司测序。 表反应引物及目标片段位置 基因 引物名称引物序列（5-3 ）位置片段大小（bp)inhA inh A-F TGC CCA GAA AGG GAT CCG TCA TC 16732781673732 455 inh A-R ATC AGG AAT GCG TCC GCG GA katG katG-F AAC GAC GTC GAA ACA GCG GC21548862155340 455 kat G-R GCG AAC TCG TCG GCC AAT TC oxyR-ahpCoxyR-ahpC-F GAG ACC GGC TTC CGA CCA CC27259432726235 293 oxyR-ahpC-R GCT GGT AGG CGG GGA ATT GAT rpoB rpoB-F CTT GCA CGA GGG TCA GAC CA 760829761371543 rpoB-R ATC TCG TCG CTA ACC ACG CC PCR 序列分析：以 H37RV 作阴性对照,使用个性化perl 脚本对序列结果进行对比分析。 2 结果 异烟肼主要耐药相关基因突变分析 异烟肼耐药机制较为复杂，对异烟肼耐药相关基因 inhA、 katG 和 oxyR-ahpC 间隔区检测后显示，在 124 株耐多药菌株中 18 株inhA 基因突变，主要发生在启动子区,其中 12 株发生 C-T（-15）突变,4 株 发生 T-C （-8) 突变和 2 株其他区突变，这些菌中还有 12 株联合 katG 突变；87 株发生了 katG 基因突变,均为单个点突变,其中 82 株为 katG315 突变，5 株联合了 oxyR-ahpC 间隔区的突变；19 株 axyR-ahpC 间隔区发生的突变，主要发生在(-10) C-T 有 6 株,还有一些其他突变，5 株联合 katG 突变。利福平主要耐药相关基因突变分析利福平耐药分子机制比较明确，主要由 rpoB 基因突变引起，本实验扩增了543bp 相关片段，包含了 81bp 耐药决定区，即密码子 507-533 区。124 株耐多药菌中，118 株发生了 rpoB 基因突变，其中 99 株为点突变，19 株联合突变，这些突变位点主要位于利福平耐药决定区，最多的是 531 位点突变 62 株，其次526 位突变 29 株，516 位点为 14 株。另外 50 株敏感菌在异烟肼、利福平扩增区未检出突变。 3 讨论 利福平、异烟肼是抗结核一线主要药物，在结核病的治疗中起着重要作用，MDR-TB 是当今结核病化疗失败的重要因素之一，并被广泛重视，耐多药结核病的控制关键在于早期选择敏感药物联合治疗5。目前用 BACTEC MGIT 960 检测结核菌药物敏感性，前提是培养阳性才能进行药敏实验，总共需花费 23 天左右时间6，临床医生对于没有药敏结果的这种病例，只能通过经验用药，难以满足临床需要，所以一种快速、简便的耐多药检测方法对于病人的及时有效的治疗极为重要。已有研究表明7-9,利福平和异烟肼耐药性的产生主要与 rpo B、kat G、inh A 基因的突变有关，但由于结核分枝杆菌在生长过程中受到各种因素的影响,在不同地区其突变类型和频率还是存在差异性。研究我省主要基因突变发生的特征,可为今后建立敏感、快速和特异的耐药诊断技术提供理论基础。 其中异烟肼耐药机制相对较为复杂，本次研究对异烟肼耐药相关基因 inhA、 katG 和 oxyR-ahpC 间隔区的分子特征进行分析，结果显示：124 例耐多药菌中 inhA 基因突变的检出率为%（18/124） ；katG 基因突变率为%（87/124） ，而且 katG 基因突变高度集中，主要位于 315 位点，占 katG 基因突变的%（82/87),315 位点密码子由 AGC 突变成 ACC，丝氨酸变为苏氨酸,；oxyR-ahpC 间隔区突变率为%（19/124） 。inhA、 katG 两种基因突变同时检出率%（93/124） ，三种基因检出率%（107/124） ，这与中国疾病预防控制中心传染病预防控制所国家重点实验室报道基本一致10。 利福平耐药主要由 rpoB 基因突变引起，本院 124 例利福平耐药的菌株中，118 株发生突变，rpoB 基因突变的检出率高达%（118/124） 。118 例耐药菌中，突变主要发生在 rpoB 531 检出率%(62/118),531 位密码子由 TCG 突变为TTG，丝氨酸变为亮氨酸 ；rpoB 526 检出率 %（ 29/118 ） ；rpoB 516 检出率%（14/118）位点，rpoB531、526、516 占全部 rpoB 基因突 11-13变的%（105/118） ，这与陈燕、Yuan X 及国外学者报道一致，说明通过检测 rpoB 基因突 变来检测利福平结核分枝杆菌耐药的可靠性很高，另外还有 6 株未检测出 rpoB 突变的耐药菌，可能是其他基因突变引起。通过对我省 MDR-TB 耐药相关基因的特征分析，说明异烟肼 oxyR-ahpC 间隔区突变在我省耐多药菌中也较常见，增加 oxyR-ahpC 间隔区的检测，可提高基因突变的检出率，仅考虑 inhA、 katG 两个基因会对 MDR-TB 漏检，影响耐多药患者治疗。综上所述，对异烟肼从 katG 315、inhA C-T（-15） 、axyR-ahpC 间隔区(-10) C-T 这三个基因，利福平的 rpoB531、526、516 考虑建立一种快速、准确、特异的适合于我省的检测耐多药结核的分子生物学技术，对我省医疗卫生技术的进步以及结核病的控制具有积极促进作用和意义。 参考文献 1 中华人民共和国全国结核病耐药性基线调查报告（XX-XX）R.北京：人民卫生出版社，XX. 2 邹远妩，王婷，杨莉,等.431 例复治患者结核分枝杆菌对一线抗结核病药物耐药分J.临床肺科杂志,XX，19(9):1729-1730. 3 梁亚萍，高漫.BACTEC MGIT 960 用于结核分枝杆菌快速培养的初步评价J.中国预防医学杂志，XX,12 （6）:521-522. 4 Somerville W,Thibert L,Schwartzman K,et of Mycobacterium tuberculosis DNA:a question of containmentJ.J Clin Microbiol,XX,43(6):2996-2997. 5 邓海清,陈保文,杨蕾,等.结核病药效评价用结核分枝杆菌参考菌株的筛选J.中国生物制品学杂志,XX,28(02):160-166. 6 张娟,蒋俊,张红.MGIT960 与罗氏培养法在结核分枝杆菌培养及药敏试验中的比对分析J.中国防痨杂志，XX,33（06）:361-364. 7 Zhang Z,Lu J,Wang Y. 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