自噬相关蛋白在肾透明细胞癌与癌旁组织中表达状况对比

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 自噬相关蛋白在肾透明细胞癌与癌 旁组织中表达状况对比 【摘要】 目的： 茸允上喙氐 鞍自谏鐾该飨赴癌与癌旁组织中表达 状况。方法：选取 2016 年 3 月 20 日- 2017 年 3 月 20 日本院收治的 50 例实施 根治性肾切除术患者为研究对象，手术 过程中切取患者两部分组织，一部分为 癌变组织，一部分为癌旁组织（即正常 组织） ，且将其制作为标本，对其进行 免疫组化染色测定、组织芯片制作、 IMAGE PRO PLUS6.0 软件测量，并对 自噬相关蛋白表达水平变化进行相关性 分析。结果：从免疫组化染色评分角度 分析，肿瘤组织的 ATG7（1.360.58） 、 LC3（2.050.36） 、Beclin -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 1（0.550.32）水平均低于正常组织 （2.630.78） 、 （3.480.45） 、 （2.470.69），而 ULK1（3.690.45） 、 P62（3.540.37 ） 、P- mTOR（2.990.85）均高于正常组织 （2.690.35） 、 （2.310.45） 、 （2.050.36），差异均有统计学意义 （P0.05） ；从 IMAGE PRO PLUS6.0 软 件测量结果角度分析，肿瘤组织的 ATG7（ 0.0290.010） 、 LC3（0.0210.010） 、Beclin 1（0.0030.006） 、P- mTOR（0.0380.019）均低于正常组织 （0.0340.020） 、 （0.0430.015） 、 （0.0230.016） 、 （0.0310.013），而 P62（0.0290.018 ） 、 ULK1（ 0.0320.014）均高于正常组织 （0.0200.009、0.0250.010） ，差异均 有统计学意义（P0.05 ） ；根据自噬相关 蛋白表达水平变化的相关性分析结果， P-mTOR、LC3、P62 的表达与 ATG7 的表达水平变化有关，Beclin 1 的表达 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 与其他蛋白不相关，ULK1 的表达变化 与 ATG7 和 P62 相关。结论：自噬的表 达水平在肾透明细胞癌中表现为下调状 态，而其下调可受到 ATG7、 LC3、Beclin 1、ULK1 、P62、P-mTOR 等多种自噬 相关蛋白协同影响。 中国论文网 /6/view-12982084.htm 【关键词】 自噬相关蛋白； 肾 透明细胞癌； 癌旁组织； 对比 Expression of Autophagy Related Proteins in Renal Clear Cell Carcinoma and Adjacent Tissues/XIE Qing-ling，XU Gui-bin，YAO Kai，et al./Medical Innovation of China，2017，14（17）： 001-004 【Abstract】 Objective：To explore the expression of autophagy related protein in renal cell carcinoma and adjacent tissues.Method：From March 2016 to March 2017，50 cases with -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 radical nephrectomy were selected as the experimental object.During the operation，part of cancerous tissue and adjacent tissues（normal tissue） of patients were cut out to make specimens which were processed by immunohistochemical staining，made to tissue microarray and measured by IMAGE PRO PLUS6.0 software.Correlation analysis of autophagy related protein expression were conducted.Result：According to the immunohistochemical staining score，ATG7（1.360.58） ， LC3（2.050.36） ，Beclin 1（0.550.32） of cancerous tissue were lower than ATG7（2.630.78） ， LC3（3.480.45） ，Beclin 1（2.470.69） of adjacent tissues，ULK1 （3.690.45） ， P62（3.540.37 ） ，P- mTOR（2.990.85） of cancerous tissue -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 were higher than ULK1（2.690.35） ， P62（2.310.45 ） ，P- mTOR（2.050.36） of adjacent tissues，the differences had statistical significance（P0.05）.By the measurement results of IMAGE PRO PLUS6.0 software，ATG7（0.0290.010） ， LC3（0.0210.010） ，Beclin 1（0.0030.006） ，P- mTOR（0.0380.019） of cancerous tissue were lower than ATG7（ 0.0340.020） ， LC3（0.0430.015） ，Beclin 1（0.0230.016） ，P- mTOR（0.0310.013） of adjacent tissues，and P62（0.0290.018） ， ULK1（ 0.0320.014） of cancerous tissue were higher than P62（0.0200.009 ） ， ULK1（ 0.0250.010） of adjacent tissues，the differences had statistical -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 significance（P0.05）.From the perspective of correlation analysis，the expression of P-mTOR， LC3，P62 was related to the expression level of ATG7.The expression of Beclin 1 was not related to other proteins.The expression of ULK1 was correlated with ATG7 and P62.Conclusion：The expression level of autophagy is down regulated in renal clear cell carcinoma，and its down-regulation may be affected by ATG7，LC3，Beclin 1，ULK1 ，P62，P-mTOR and other autophagy related proteins. 【Key words】 Autophagy related protein； Renal clear cell carcinoma； Para- carcinoma tissue； Contrast First-authors address：The Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510700，China doi：10.3969/j.issn.1674- -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 4985.2017.17.001 肾细胞癌属于恶性肿瘤之一，在 泌尿科较为常见。自噬主要是指细胞通 过双层膜或单层膜包裹等待降解物形成 自噬体，随后形成自噬溶酶体，并进行 多种酶的降解和消化，从而实现稳定细 胞内微环境和实现细胞内成分的更新， 其主要标志物为微管相关蛋白 1 轻链 3，常参与自噬体的形成1。近年来， 肿瘤和自噬的关系广泛受到专家重视， 且有研究表明，自噬在肿瘤形成中起到 重要作用，且部分学者认为 BECLIML 在自噬中属于抑癌基因2。而本文旨在 探索自噬相关蛋白在肾透明细胞癌与癌 旁组织中表达的临床意义，现报道如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料 本次的探索对象为 50 例实施根治性肾切除术患者，所有患 者均在 2016 年 3 月 20 日-2017 年 3 月 20 日期间收 治。在患者手术中选取一块正常肾组织 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 和一块肾癌组织，并将其制作成标本， 进行免疫组化染色。其中癌旁组织设定 为正常对照，所有患者年龄 2458 岁， 平均（38.473.47）岁，男 35 例，女 15 例；TNM 分期：期 5 例，期 16 例， 期 14 例，I 期 15 例；FUHRMAN 分 级：低分化 18 例，中分化 20 例，高分 化 12 例。纳入标准：（1）均签署书面 同意书；（2）癌旁组织距癌组织边缘 2 cm；（3）术前未进行过免疫、化疗、 放疗；（4）经病理检查，患者均确诊 为肾透明细胞癌。排除标准：（1）心 功能不全患者；（2）依从性较差患者； （3）手术禁忌证患者；（4）先天性语 言功能障碍或听力功能障碍患者； （5）危重症患者；（6）资料不全患者。 1.2 方法 （1）生化试剂：由美 国 ABCAM 公司提供一抗，包括 ATG7（ ab52472） 、ATG5（ab64227） 、 ULK1（ ab65056） 、Beclin 1（ab51031） 、 LC3（ab48394） 、P62（ab56416） 、P- -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 mTOR（ab51044） 。其中 P62 属于自噬 特异性底物，P-mTOR 的活性负性调节 自噬，以上两类蛋白的自噬负和表达相 关，而 ATG7、ATG5 、ULK1、Beclin 1、LC3 属于自噬通路蛋白，其表达的 高低能够反映出自噬含量。由北京中杉 金桥公司提供二抗、DAB、检测试剂盒 PV6000，且实施二步法检测。 （2）免疫 组化染色和组织芯片：采用 QUICK RAY 组织芯片制备仪（由韩国 UNITMA 公司提供）制作组织芯片。首 先使用梯度乙醇脱蜡水化后，在双氧水 （3%）中孵育 30 min，且封闭内源性 过氧化物酶。二抗室温孵育 30 min；一 抗在温度为 4 环境下过夜，苏木精复 染，DAB 染色。 1.3 观察指标与评定标准 使用两 种方法对结果进行判定：（1）使用 IMAGE PRO PLUS6.0 软件对组织染色 程度进行测量，同时再进行统计学分析； （2）由医生对标本进行染色结果判定， 且根据标本染色程度，进行 04 分的 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 标准打分，判定依据为颜色深浅。对比 癌组织和正常组织的免疫组化染色评分 以及 IMAGE PRO PLUS6.0 软件测量结 果。分析自噬相关蛋白表达水平变化的 相关性分析 P 值。 1.4 统计学处理 采用 SPSS 22.0 软件对所得数据进行统计分析，计量资 料用（xs）表示，比较采用 t 检验和相 关性分析，P0.05 ） ，见表 1。 2.2 正常组织和癌组织免疫组化 染色 IMAGE PRO PLUS6.0 软件测量结 果比较 肿瘤组织和正常组织 ATG7、 LC3、Beclin 1、ULK1 、P62、P-mTOR 含量对比， 差异均有统计学意义（P0.05） ，见表 2。 2.3 自噬相关蛋白表达水平变化 相关性分析 Beclin 1 的表达与其他蛋白不相关， ULK1 的表达变化与 ATG7 和 P62 相关， P-mTOR、LC3、P62 的表达与 ATG7 的表达水平变化有关。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 3 讨论 在肿瘤进展、发生过程中，为了 维护细胞增殖，需大量的氧气和营养物 质。而自噬便属于肿瘤细胞代谢应激和 抵抗缺氧的原因，在肿瘤缺乏营养素 r，通过增强自噬，无法观察到较高的 血管化区域3，反而言之，自噬的激活 能够产生肿瘤生长必须的底物和能量， 其可利于肿瘤细胞的繁殖、生存。同时 肿瘤的缺氧化状态，可导致预后较差， 且促使血管的凋亡，形成肿瘤组织4。 肿瘤的中心缺氧，还可促进侵袭细胞存 活，诱导自噬。常规情况下，在 BH3 区域中，BCL-2 和 BCL-XL 形成复合物， 当机体处于缺氧状态，可促使 Beclin 1 转化为 BNIP3，从而释放 Beclin 1 诱导 自噬激活，克服缺氧5。 自噬能够维持基因稳定性，给予 细胞提供额外的 ATP，及时清除受损细 胞和回收失活蛋白6。当机体代谢压力 达到一定程度时，可过度激活自噬，从 而促使细胞凋亡、死亡，此点能够证实， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 对于肿瘤细胞而言，自噬具有较为重要 的意义，大部分肿瘤细胞均存在凋亡障 碍，由此说明，下调的自噬能够营造良 好的肿瘤生长环境，且本次研究中，也 证实了自噬特异性底物 P62 的积累，能 够促进肿瘤的生长7。同时本次研究还 可发现，肾细胞中较低的自噬相关蛋白 的表达和较少的自噬数量，能够表明自 噬在肾透明细胞癌中的发展、发生意义， 提示自噬水平在肿瘤组织中下调8。 目前临床上，对于自噬的调控机制尚未 阐述清楚，部分学者认为调节自噬的阀 门为 mTOP 复合物活性9。Beclin 1 被 临床学者认为其是自噬体起始的阶段成 分之一，属于一种肿瘤抑制因子，有研 究表明，自噬体的形成是由于 Beclin 1 的严重缺乏。本次研究中发现，Beclin 1 和 mTOP 在肿瘤组织表达中均存在改 变现象，其提示着自噬水平下调10。 而本次研究也发现 ATG7 和 LC3 也发 生一定意义的改变，其主要提示着机体 存在潜在的调控位点11 。无论是遗传 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 13 性肾癌还是散发性肾癌，VHL（VON HIPPEL-LINDAU）基因突变起到较为 重要作用，VHL 基因突变是导致缺氧 诱导因子的聚集，而 mTOR 通路上调的 主要原因为缺氧诱导因子聚集，因此肾 癌自噬调低的主要原因为 VHL 基因突 变12。 自噬在肿瘤治疗中存在较多争议， 有研究报道，自噬通过基因敲除和药物 抑制，能够改善化疗药物耐受性，助于 疾病的恢复，在机体内存在长期影响性， 但此项结果有待进一步考察13。近年 来，临床发现多种 mTOR 抑制剂已开始 广泛应用于临床，且常用于治疗晚期肾 癌患者，其主要疗效为通过调节自噬来 达到治疗效果14 。