DB51T 660-2007 猪肉中己烯雌酚残留检测方法－酶联免疫吸附测定(ELISA)法

案号： 四川省地方标准 660 2007 猪肉中己烯雌酚残留检测方法 酶联免疫吸附测定 ( ig 007布 2007施 四川省质量技术监督局 发布 660 2007 I 目 次 前言 . 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 制样 . 1 品的制备 . 1 品的保存 . 1 4 测定方法 . 1 法提要或原理 . 1 剂和材料 . 1 器和设备 . 2 定步骤 . 2 果计算和表述 . 2 5 检测方法灵敏度、准确度、精密度 . 3 敏度 . 3 确度 . 3 密度 . 3 660 2007 言 本标准按 2000 标准的结构和编写规则进行编制 本标准由 四川省畜牧食品局提出 并归口。 本标准由 四川省质量技术监督局批准 本标准起草单位： 四川省兽药残留监控中心、四川省兽药监察所 本标准主要起草人： 程江 、彭莉、岳秀英、 熊浩山、官艳丽、王海波、吴晓岚 660 2007 1 猪肉中己烯雌酚残留检测方法 酶联免疫吸附测定 ( 1 范围 本标准规定了 猪肉中己烯雌酚 残留 量 检 测 的制样和酶 联 免疫 吸附测定 法。 本标准适用于猪肉中己烯雌酚的残留量的快速筛选检测。对于可疑样品需用确证法确认 。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准 的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 准化工作导则 第 1部分：标准的结构和编写规则 (, 1997, 6682分析实验室用水规则和试验方法 农牧发 20031号 兽药残留试验技术规范（试行） 3 制样 品的制备 取适量新鲜或冷冻的空白或 供试猪肉 组织，绞碎并之使均匀，密封。 品的保存 下 冰箱中贮存备用。 4 测定方法 法提要或原理 猪肉中残留的己烯雌酚用 叔丁基甲基醚 提取， 酶 联 免疫 吸附测定 法 测定 ,其基本原理是抗原抗体反应。 酶标板的微孔包被有偶联抗原， 标样或 样品 中的 己烯雌酚 与 微孔 中预 包被 的 偶联抗原 竞争 己烯雌酚特 抗体 。 通过洗涤除去 没有与特异性 抗体 结合的酶标记抗原。加入底物液 ，结合到板上的酶标记物将底物转化为有色产物。 加入终止液，在 450光度值与试样中 己烯雌酚 浓度 呈 反比。 剂和材料 以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合 6682规定的二级水。 丁基甲基醚 腈 己烷 烯雌酚试剂盒 （采用官方备案的试剂盒 ） 己烯雌酚 系列标准溶液 0ng/ 酶标板 8条 12 孔，包被有偶联抗原 酶标记物 己烯雌酚 抗体 临用前将抗体用稀释了的复溶液按 1： 11倍稀释（ 5000的己烯雌酚抗体溶液 底物 溶 液 A 660 2007 2 底物 溶 液 B 浓缩洗涤液 临用前用水将其稀释 20倍作为洗涤液 浓缩复溶液 临用前用水将其稀释 5倍作为稀释了的复溶液 终止溶液 器和设备 标仪 （配备 450 平 感量 分析天平 感量 漩涡混合仪 荡器 织匀浆机 冻离心机 吹 仪 心管 2050量移液器 单道 20L， 50L， 100L， 1000L；多道 50 250L 定步骤 料的制备 试料的制备包括： 取绞碎后的供试样品 ,作为供试试料。 取绞碎后的空白样品 ,作为空白试料。 取绞碎后空白样品 ,添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。 取和净化 取 10000r/5 g，置 50 15旋 1荡 106000r/ 下离心 10上 层清夜移至鸡心瓶中。再加 15并两次上清液， 于 45 水浴中减压旋转蒸发至干 。 加 2鸡心瓶中， 旋涡溶解残留物， 然后将其转移至 20加 2法操作，转移至同一离心管中。在离心管中加 5 涡动 60s， 15， 6000 r/弃 去 上层液体，再加 5离心管中同法操作， 取下层液体， 60下 氮气吹干，加入 1动 60000动 60s，即可 作为试样供 分析。 品测定程序 （ 20 26条件下操作） 使用前将试剂盒置于室温（ 20 26 ）平衡 30上， 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于 2 8 。将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做两个平行实验。 加 入 50 L 标准溶液或试样溶液 到 微孔 底部 ， 每孔再 加入 50 L 己烯雌酚抗体 溶液 ， 轻轻振荡混匀， 用盖板膜封板， 25 环境 中反应 30 倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中 液体。每孔加入 250L 洗涤液， 10吸水纸拍干，如此重复操作共洗板 5 次 。 加入 100L 酶标 记物到 微孔 底部 ，用盖板膜封板， 25 环境 中反应 30出酶标板，如前述洗板 5 次。 加入 50L 底物液 A 和 50L 底物液 B 到 微孔 中 ，轻轻振荡混匀， 25 环境 避光显色 15 加入 50L 终止液 到 微孔 中 ，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450，测定每孔吸光度值（ 果计算和表述 所获得的标准或样品吸光度值的平均值除以第一个标准（ 0标准）吸光度值的平均值再乘以 100%， 660 2007 3 得到以百分比给出的吸光度值，以式（ 示： 百分吸光度值 = 100% 式中 : B 为标准溶液或供试样 品 的平均吸光度值； 为零浓度标准溶液的平均吸光度值。 以 标准溶液中 己烯雌酚 浓度 (ng/自然对数为 X 轴，百分吸光度值为 Y 轴，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。 相对应的供试样品的浓度（ ng/以从标准曲线上查出。 也可以求出回归曲线的方程，计算未知样品中己烯 雌酚的浓度。如果有专业计算机软件可直接求出