硅对干旱胁迫下番茄根系细胞超微结构及线粒体活性氧代谢的影响.doc

园 艺 学 报 2014，41（12）：24192426 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: 收稿日期：20141017；修回日期：20141204 基金项目：山东省现代农业产业技术体系专项资金项目（SDAIT-02-022-05） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：） 硅对干旱胁迫下番茄根系细胞超微结构及线粒体活性氧代谢的影响 曹逼力，刘灿玉，徐 坤* （山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室/农业部黄淮地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，山东泰安 271018） 摘 要：以番茄品种金棚1号为试材，采用水培方法，研究了PEG-6000模拟干旱胁迫条件下，硅对根系细胞超微结构及线粒体活性氧代谢的影响。结果表明，随干旱胁迫时间的延长，番茄植株根系活力逐渐降低，丙二醛（MDA）含量逐渐升高，细胞线粒体超氧阴离子生成速率和过氧化氢（H2O2）含量亦逐渐升高，而超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）及过氧化氢酶（CAT）活性在胁迫初期迅速增强，达峰值后又快速降低；施硅处理显著抑制了干旱胁迫引发的上述变化。干旱胁迫处理12 d时，施硅较不施硅处理番茄根系的MDA含量、超氧阴离子生成速率和H2O2含量分别降低了25.14%、8.34%和20.25%，而根系活力、SOD活性、POD活性和CAT活性分别提高了139.62%、243.19%、65.53%和125.55%。施硅处理还减轻了干旱胁迫导致的根系细胞质壁分离程度，缓解了线粒体、细胞核、生物膜等的损伤。 关键词：番茄；硅；干旱；细胞超微结构；线粒体；活性氧代谢 中图分类号：S 641.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）12-2419-08 Effects of Silicon on Ultrastructure and Active Oxygen Metabolism in Mitochondria of Tomato Roots Under Drought Stress CAO Bi-li，LIU Can-yu，and XU Kun* （College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，State Key Laboratory of Crop Biology，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops in Huang-Huai Region，Ministry of Agriculture，Taian，Shandong 271018，China） Abstract：The effects of silicon on ultrastructure and active oxygen metabolism in root mitochondria were studied with a tomato（Solanum lycopersicum）cultivarJinpeng 1in cultured hydroponics under PEG-6000 simulated drought. The results showed that with the extension of drought stress，the root activity of tomato plants gradually decreased. Malondialdehyde（MDA）content，mitochondrial superoxide anion（）productivity rate and hydrogen peroxide（H2O2）content gradually increased，but the activities of superoxide dismutase（SOD），peroxidase（POD）and catalase（CAT）rapidly increased in the early stage of drought stress，and then rapidly decreased after peak. The application of silicon significantly effected the change of the related indicators caused by drought stress. After 12 days of drought stress，the content of 2420 园 艺 学 报 41卷 MDA， and H2O2 in roots of tomato with silicon were lower than that of tomato without silicon by 25.14%，8.34%，20.25%，respectively. But root activity，SOD activity，POD activity and CAT activity were higher by 139.62%，243.19%，65.53%，125.55%，respectively. In addition，the application of silicon not only reduced plasmolysis of tomato root cells，but also relieved the damage of mitochondria，nuclei and biofilms. Key words：tomato；silicon；drought；cell ultrastructure；mitochondria；active oxygen metabolism 植物根系作为土壤水分的直接吸收器官，可对干旱胁迫迅速作出应激反应（桂世昌 等，2010；刘艳 等，2010）。干旱主要破坏根系的渗透调节功能、保护酶系统及膜系统，尤其膜系统通常被认为是干旱胁迫损伤的原初关键部位（孙涌栋 等，2008）。干旱胁迫下植物体内过量的自由基引起膜脂过氧化，产生的MDA可与蛋白质交联、结合，使细胞膜失活，严重时会致使植物细胞死亡（桂世昌 等，2010）。在细胞程序性死亡的过程中线粒体起着重要作用（Loeffler & Kroemer，2000）。由于线粒体既能进行氧化磷酸化，生成ATP，又能产生活性氧，造成脂质过氧化（赵云罡和徐建兴，2001），所以维持细胞线粒体的结构完整和正常生理功能具有重要的生物学意义。 干旱胁迫下根系细胞内的线粒体膜结构发生破坏，主要与膜脂过氧化伤害有关（Smith et al.，1982；Yamamoto et al.，2002）。卫星等（2010）报道，干旱胁迫下水曲柳根系线粒体内H2O2和MDA含量增加，线粒体膜裂解。而植物在抵御干旱胁迫过程中，甜菜碱、脯氨酸、有机酸、保护酶及钾、硅等可通过调节不同的代谢途径发挥作用（Farooq et al.，2009），其中硅元素既可影响细胞的结构（Romero-Aranda et al.，2006），也可调节相关生理代谢（Ma et al.，2004）。Isa等（2010）研究发现，水稻对硅的吸收沉积增加了细胞壁的强度和刚性；同时加入外源硅还可显著提高干旱胁迫下小麦（Gong et al.，2005）、草坪草（杜建雄和刘金荣，2010）、黄瓜（周秀杰 等，2010）的SOD、POD和CAT活性，降低小麦（Pei et al.，2010）、水稻（明东风 等，2012）在干旱胁迫下叶片的H2O2和MDA含量，从而增加生物膜的稳定性。钱琼秋等（2006a，2006b）研究发现，硅能显著降低盐胁迫下黄瓜根系线粒体的H2O2和MDA含量，增强线粒体抗膜脂过氧化能力，维持膜的完整性。 番茄（Solanum lycopersicum）虽然对硅的吸收速率较低（Takahashi et al.，1990），但作者研究发现，水培番茄添加适量的硅，可显著促进幼苗生长，提高光合速率和水分利用效率（曹逼力 等，2013）；梁永超等（1993）的研究也表明，番茄在砂培、土培条件下施用硅肥，植株生长势均较对照增强，产量提高30%以上。为了探讨硅在维持番茄根系细胞结构与功能中的作用，采用水培方法研究了硅对PEG模拟干旱胁迫下番茄根系细胞超微结构、根系活力及活性氧代谢的影响，旨在明确硅缓解植物干旱胁迫的生理机制。 1 材料与方法 1.1 材料培养与处理 试验于2013年810月在山东农业大学园艺实验站日光温室进行，供试番茄品种为金棚1号，采用1/2Hoagland营养液水培育苗。温室内环境进行常规调节，晴天午间光强1 400 1 800 mol m-2 s-1，昼/夜温度28 32 /18 21 ，相对湿度67% 92%。待幼苗长至约4叶1心时移至直径15 cm、高15 cm的塑料盆中，以泡沫板固定幼苗，每盆定植1株，每2 d更换一次全量Hoagland营养液。待幼苗长至8叶1心时选取生长一致的番茄幼苗进行如下处理：对照：Hoagland营养液；PEG：Hoagland营养液 + 1% PEG-6000；PEG + Si：Hoagland营养液 + 1% PEG-6000 + 1.2 12期 曹逼力等：硅对干旱胁迫下番茄根系细胞超微结构及线粒体活性氧代谢的影响 2421 mmol L-1 Si，试验所用硅源为Na2SiO3 9H2O。每处理90盆，分成3组，随机区组排列。分别于试验处理0、1、3、5、8和12 d时11：00时取样测定相关代谢指标，采用邓肯氏新复极差法检验数据差异显著性。于试验处理12 d时取根样制片，观察根系细胞超微结构。 1.2 测试指标与方法 番茄根系活力以TTC法（李合生 等，2000）测定。 根系线粒体制备参考杨玖英等（2004）和钱琼秋等（2006b）的方法进行，具体操作步骤如下：4 超纯水洗净待测根系，称取20 g，加入4 提取液内含0.4 mmol L-1甘露醇，0.7%聚乙烯吡咯烷酮（PVP），0.1%牛血清蛋白（BSA），2 mmol L-1乙二胺四乙酸（EDTA），0.05% 巯基乙醇的50 mmol L-1 Tris-HC1，pH7.450 mL，在4 下迅速捣碎成糊状，经4层纱布过滤收集滤液，滤液经1 000 g离心15 min取上清液；为去除细胞核残骸再3 000 g离心15 min，最后取上清液于12 000 g下离心15 min，所得沉淀为粗制线粒体。用15 mL 4 提取液将沉淀洗涤3次，再经（20%、36%、52%、60%）蔗糖梯度离心，最后提取的线粒体用保存液（内含5 mmol L-1的EDTA，0.05 mmol L-1的PBS，pH 7.4）悬浮。 分别取线粒体悬浮液，用NBT还原法（Gioniannopolitis & Ries，1977）测定SOD活性，用愈创木酚法（Kochba et al.，1977）测定POD活性，按Dhindsa等（1982）的方法测定CAT活性，采用羟胺氧化法（Rauckman et al.，1979）测定超氧阴离子产生速率，按Patterson等（1984）的方法测定H2O2含量，用硫代巴比妥酸法（Cavalcanti et al.，2004）测定MDA含量。测定上述指标时以线粒体蛋白（mg）表示线粒体量，用Bradford（1976）的方法测定蛋白含量。 选取不同处理番茄根系侧根根尖，截取1 2 mm小段，迅速浸入装有2.5%戊二醛溶液（pH 7.5）的小玻璃瓶中，经抽气至根样沉至瓶底固定24 h后取出，经磷酸缓冲液冲洗后，再以0.1%锇酸固定2 h，再次以磷酸缓冲液冲洗，经乙醇多级脱水后，用环氧丙烷置换，再进行Epon812环氧树脂渗透包埋。采用美国RMC Power-Tome-XL型超薄切片机切片，醋酸铀和柠檬酸铅双染，于Hitachi H-7650透射电子显微镜下观察根系细胞超微结构。 2 结果与分析 2.1 干旱胁迫下硅对番茄根系活力及线粒体膜质过氧化水平的影响 图1表明，随干旱胁迫时间的延长，番茄幼苗根系活力逐渐降低，但培养液中加硅则显著抑制了根系活力的下降，如干旱胁迫3 d时，模拟干旱胁迫的PEG处理比对照降低了46.72%，而PEG + Si 图1 硅对干旱胁迫下番茄根系活力和根系线粒体MDA含量的影响 Fig. 1 Effects of silicon on root activity and MDA content in mitochondria of tomato roots under drought stress 2422 园 艺 学 报 41卷 处理下降了18.71%，至胁迫12 d时，二者分别比对照下降了85.65%和65.62%。根系膜脂过氧化产物MDA含量的变化与根系活力相反，亦即随干旱胁迫天数的增加MDA含量显著升高，胁迫至12 d时，PEG处理和PEG + Si处理分别比对照增加了5.37和3.77倍，但PEG + Si处理较PEG处理降低了25.14%，表明培养液加硅降低了番茄根系膜质过氧化程度，有效缓解了干旱胁迫引起的伤害。 2.2 干旱胁迫下硅对番茄根系线粒体超氧阴离子产生速率、过氧化氢（H2O2）含量的影响 图2显示，干旱胁迫导致番茄根系超氧阴离子产生速率及H2O2含量显著增加，且随干旱胁迫天数的增加，增幅显著提高，但PEG + Si处理的增幅显著低于PEG处理。表明培养液加硅可有效降低番茄幼苗根系超氧阴离子和H2O2的生成。 图2 硅对干旱胁迫下番茄根系线粒体超氧阴离子产生速率和H2O2含量的影响 Fig. 2 Effects of silicon on production rate and H2O2 content in mitochondria of tomato root under drought stress 2.3 干旱胁迫下硅对番茄根系线粒体SOD、POD和CAT活性的影响 由图3可知，试验处理过程中，对照根系线粒体SOD、POD和CAT活性较为稳定，而PEG处理、PEG + Si处理的相关酶活性在干旱胁迫前期均迅速升高，至3 d时达峰值时，PEG处理的SOD、POD和CAT活性较对照分别增加308.18%、154.68%和174.75%，但较PEG + Si处理分别降低了22.48%、16.99%和14.31%；之后，尽管PEG处理、PEG + Si处理的相关酶活性均呈降低趋势，但PEG处理下降速率显著高于PEG + Si处理，尤其在胁迫5 d后表现为甚，至12 d时，PEG处理的SOD、POD和CAT活性均低于对照，而PEG + Si处理则分别比对照高181.08%、43.86%和76.59%，表明干旱胁迫下，施硅处理的番茄根系线粒体维持了较高的保护酶活性，可有效保护线粒体膜质的稳定，增强番茄根系抵御干旱胁迫的能力。 图3 硅对干旱胁迫下番茄根系线粒体SOD、POD 和CAT活性的影响 Fig. 3 Effects of silicon on activities of SOD，POD and CAT in mitochondria of tomato root under drought stress 12期 曹逼力等：硅对干旱胁迫下番茄根系细胞超微结构及线粒体活性氧代谢的影响 2423 2.4 干旱胁迫下硅对番茄根系细胞超微结构的影响 从图4可以看出，干旱胁迫12 d时，对照和PEG + Si处理番茄植株根系细胞的液泡体积较小且数量较多（图4，A、C），而PEG处理根系细胞中的液泡体积较大且数量较少，并有明显的质壁分离现象（图4，B）。对照的根系细胞线粒体完好，呈圆形或椭圆形（图4，D），PEG处理的根系细胞线粒体损伤严重，嵴突膨胀变形且线粒体膜部分破溃（图4，E），PEG + Si处理的根系细胞线粒体损伤较轻，虽嵴突有轻微膨胀，但线粒体膜较为完好（图4，F、I）。对照的根系细胞质体完好，呈圆形或椭圆形（图4，D、G），PEG + Si处理的根系细胞质体大多完好，仅少数质体外膜部分自溶（图4，F、I），而PEG处理的根系细胞质体严重扭曲变形（图4，H）。对照的根系细胞细胞核清晰（图4，A、G），PEG + Si处理的根系细胞细胞核轻微肿胀变形（图4，C）但PEG处理的根系细胞细胞核核膜松散、解体，表明损伤已较为严重（图4，E、H）。 图4 硅对干旱胁迫下番茄根系细胞超微结构的影响 CW：细胞壁；E：嗜锇颗粒；M：线粒体；N：细胞核；P：质体；V：液泡。 Fig. 4 Effects of silicon on ultrastructure of tomato roots under drought stress CW：Cell wall；E：Eosinophilia osmium particle；M：Mitochondria；N：Nucleus；P：Plastid；V：Vacuole. 3 讨论 植物在遭受逆境胁迫时，线粒体中的电子传递受阻，电子漏出呼吸链与氧反应生成活性氧，大量积累的活性氧破坏线粒体内膜的完整性甚至是线粒体的活性氧防御系统（马怀宇和杨洪强，2006），但在生成活性氧的同时，其自身也存在较为完善的活性氧清除系统，如SOD、POD和CAT等活性氧酶促清除系统（白团辉 等，2008），以及还原型抗坏血酸（AsA）、还原型谷胱甘肽（GSH）、类胡萝卜素、生育酚等小分子活性物质的非酶促清除系统（杜秀敏 等，2001），以维持活性氧代谢平衡，但严重逆境胁迫可导致SOD、POD和CAT活性的下降（葛体达 等，2005）。本试验结果2424 园 艺 学 报 41卷 表明，随着干旱胁迫时间的延长，番茄根系线粒体超氧阴离子产生速率、H2O2含量逐渐升高，SOD、POD和CAT活性在胁迫初期亦迅速升高，但在胁迫中后期则迅速降低，表明较长的胁迫时间破坏了SOD、POD和CAT等保护酶的动态平衡，因此，尽管线粒体膜脂过氧化产物MDA含量在干旱胁迫过程中持续增加，但前期增加缓慢，后期增加较快。本研究中发现，干旱胁迫下施硅处理显著增强了番茄根系线粒体SOD、POD、CAT活性，降低了超氧阴离子产生速率以及H2O2和MDA含量，表明外源硅较好地维持了干旱胁迫下番茄根系线粒体活性氧的代谢平衡，有效保护了生物膜，缓解了干旱胁迫对番茄根系线粒体的损伤。与之相似，Schmidt等（1999）研究表明，叶面喷施硅酸盐提高了干旱胁迫下剪股颖叶片的SOD活性。李清芳等（2007）研究也证实，外源硅通过提高玉米叶片SOD、POD和CAT活性，降低MDA含量，缓解干旱胁迫造成的伤害。杜建雄和刘金荣（2010）发现，硅可提高草坪草叶片抗氧化酶的活性，减轻活性氧的积累，降低MDA含量，缓解了干旱胁迫诱导的氧化损伤。外源硅还可促进黄瓜植株SOD、POD、CAT的活性升高（Ma et al.，2004）。此外，Romero-Aranda等（2006）发现，番茄加硅培养后，硅在细胞壁的沉积和输导组织中Si nH2O较强的亲水性，减轻了组织的生理干旱程度，可避免细胞过度脱水，从而减轻了活性氧的产生。干旱条件下施硅也有利于保持水稻（Agarie et al.，1998）和小麦（Gong et al.，2003）叶片较高的水势。本试验也证实，干旱胁迫下加硅处理的番茄根系细胞质壁分离程度显著低于不加硅处理。 植物遭受逆境胁迫，其细胞相关生理功能可能因细胞器结构损伤而降低甚至丧失（Shao et al.，2008）。Liang（1998）研究发现，加入外源硅可减轻盐胁迫下大麦叶绿体的结构损伤，利于保护叶绿体膜的完整性，徐呈祥等（2007）在芦荟上也得出了相同的结论。本试验结果表明，加硅不仅减轻了根系细胞的质壁分离，还有利于防止细胞结构的损伤以及线粒外膜、核膜的自溶和细胞核的解体。可见，干旱胁迫下施用外源硅，不仅可提高番茄根系线粒体活性氧清除酶的活性，减轻活性氧积累和膜脂过氧化程度，还有利于维持根系细胞及重要细胞器结构的完整性，进而提高了植株的抗旱性。 References Agarie S，Hanaoka N，Ueno O，Miyazaki A，Kubota F，Agata A W，Kaufman P B. 1998. 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