硕士毕业论文——数字PCR在转基因生物及其产品检测中的应用

上海交通大学硕士学位论文 摘要上海交通大学硕士学位论文数字PCR在转基因生物及其产品检测中的应用专 业： 生物学硕 士 生： 导 师： 上海交通大学生命科学技术学院 年 月摘 要转基因生物及其产品的标识管理是转基因生物安全管理的重要内容，不同的国家和地区都规定了不同的转基因产品标识阈值，这就对转基因产品的定量检测技术提出了较高的要求。目前，荧光定量PCR技术在转基因产品的定量检测中广泛应用，但是该方法需要依赖标准曲线和标准物质，是一种相对定量技术，并且定量极限较低，不适用于转基因成分含量低的样品。近年来兴起的数字PCR能够通过极度稀释、泊松分布和终点法PCR实现绝对定量，并且具有较高的检测极限和定量极限，在转基因生物及其产品的检测中具有巨大的应用潜力。本文围绕两种数字PCR，分析了其在转基因生物及其产品检测中的应用。1. 数字PCR可用于转基因生物标准物质的定值：（1）微滴式数字PCR（ddPCR）在基体标准物质的定值中，能够排除影响反应效率的抑制因子，定值的偏差比荧光定量PCR（qPCR）小；（2）ddPCR的动态范围可以达到100000拷贝，高于微流体芯片数字PCR（cdPCR）；（3）微滴式数字PCR由于分液数多，在定值的重复性上由于cdPCR；（4）ddPCR具有非常低的检测极限(0.25拷贝/反应)，能够用于单拷贝分子的检测，而两种数字PCR都比qPCR具有更低的定量极限；（5）酶切后的质粒标准物质更加适合在数字PCR平台上进行定值。2. 数字PCR可用于转基因产品的精确定量分析：（1）ddPCR和cdPCR能够不依赖于标准曲线对转基因产品进行精确的绝对定量，同时还可以判断转基因生物的基因型；（2）ddPCR比qPCR更加适合用于双重定量分析，单重和双重的结果更为接近。3. 数字PCR可用于转基因生物外源基因的拷贝数分析。对于不同的基因，数字PCR和定量PCR测定的结果有所差异，并且基因组的酶切对数字PCR也产生了一定影响。这说明数字PCR和qPCR的反应原理、统计原理有所不同，可以作为转基因生物外源基因拷贝数的分析的新方法。 关键词: 转基因生物，检测，定量，荧光定量PCR，数字PCR93上海交通大学硕士学位论文 AbstractTHE APPLICATIONS OF DIGITAL PCR IN DETECTION FOR GMOS AND THEIR DERIVED PRODUCTSAbstractLabeling management is an important part of regulation on genetically modified organisms (GMOs). Thresholds are set by different countries, which need excellent quantification technologies. Currently, real-time quantitative PCR (qPCR) is widely used in quantification of GMOs. However, this method relies on the standard curve and reference material, which lead it to a relative quantification method. Moreover, the limit of quantification of real-time PCR is high. Samples with low GMO content cannot quantified by qPCR. Digital PCR (dPCR) can realize absolute quantification through limit dilution, Poisson distribution and endpoint PCR. It shows potential in GMOs detection. In this research, two kind of digital PCR platforms were applied in GMO detection.1. Digital PCR can apply in determing the certified value of GMO reference material. (1)Droplet digital PCR (ddPCR) can exclude matrix effect of qPCR and obtain the certified value with a smaller bias than qPCR. (2) ddPCR had a higher dynamic range (within 100,000 copies) than chamber digital PCR (cdPCR). (3) ddPCR presented a good repeatability on certified value than cdPCR, attribute to the more partitions. (4) ddPCR had a low limit of detection (0.25 copies/reaction). Both ddPCR and cdPCR had a lower limit of quantification than qPCR. (5) Digtal PCR can work better on degisted plasmid reference material.2. Digital PCR can apply in accurate quantification of GMO products. (1) Both ddPCR and cdPCR can realize absolute quatification of GMOs products wihout standard curve and reference materials. Moreover, digital PCR can decide the genotype of GMOs. (2) ddPCR performed better than qPCR in duplex quantification. The results of simplex and duplex on ddPCR were closer than qPCR.3. Digital PCR can apply in estimating copy number of transgenes in GMOs. Digital PCR and qPCR tested different copy number on some genes. The degistion of genome had an effect on digtal PCR instead of qPCR. Thus, digital PCR was different form qPCR on principle and data statistics. Digital PCR can act as a new method in estimating copy number of transgenes in GMOs.Keywords: GMOs, detection, quantificaiton, real-time PCR，digital PCR上海交通大学硕士学位论文 第一章目 录摘 要IABSTRACTIII目 录5第一章 转基因生物及其定量方法研究进展71.1转基因生物发展现状81.1.1全球转基因生物发展现状81.1.2中国转基因生物发展现状91.2转基因生物及其产品的标识管理101.2.1强制性标识101.2.2自愿性标识111.2.3低水平混杂的管理121.3转基因生物及其产品定量检测方法概述121.3.1转基因成分含量表述方式121.3.2荧光定量PCR131.3.3数字PCR151.3.4数字PCR及其应用201.3.5展望21第二章 数字PCR在转基因生物标准物质定值中的应用22第一节 通过数字PCR对转基因生物基体标准物质定值232.1实验材料、试剂与仪器232.1.1实验材料232.1.2实验仪器232.1.3实验试剂242.2实验方法242.2.1三种方法提取植物基因组DNA242.2.2 DNA质量评价方法252.2.3引物和探针的设计272.2.4荧光定量PCR的反应体系和条件272.2.5ddPCR反应体系和条件282.2.6cdPCR反应体系和条件292.3实验结果与讨论292.3.1三种抽提方法所得DNA质量评价292.3.2荧光定量PCR定值结果312.3.3 ddPCR定值结果332.3.4cdPCR定值结果342.3.5三种平台定值结果的分析比较352.3.6数字PCR平台性能的分析362.4小结42第二节 通过数字PCR对转基因生物质粒标准物质定值432.1实验材料、试剂与仪器432.1.1实验材料432.1.2实验仪器432.1.3实验试剂432.2实验方法432.2.1提取质粒分子DNA432.2.2 DNA质量评价方法442.2.3质粒分子的酶切及回收442.2.4引物和探针的设计442.2.5荧光定量PCR的反应体系和条件452.2.6ddPCR反应体系和条件452.2.7cdPCR反应体系和条件452.3实验结果与讨论452.3.1酶切结果及DNA质量评价452.3.2荧光定量PCR定值结果462.3.3ddPCR定值结果462.3.4cdPCR定值结果472.3.5三种平台定值结果的分析比较482.4小结49第三章 数字PCR在转基因产品精确定量中的应用50第一节 数字PCR可用于转基因生物基因型的分析513.1实验材料、试剂与仪器513.1.1实验材料513.1.2实验仪器513.1.3实验试剂513.2实验方法513.2.1提取植物基因组DNA513.2.2 DNA质量评价方法513.2.3引物和探针的设计523.2.4荧光定量PCR的反应体系和条件523.2.5ddPCR反应体系和条件523.2.6cdPCR反应体系和条件523.3实验结果与讨论523.3.1DNA质量评价523.3.2荧光定量PCR定量结果533.3.3ddPCR定量结果533.3.4cdPCR定量结果543.3.5三种平台定量结果的分析比较553.4小结55第二节 微滴式数字PCR可用于双重绝对定量检测563.1实验材料、试剂与仪器563.1.1实验材料563.1.2实验仪器563.1.3实验试剂563.2实验方法563.2.1提取植物基因组DNA563.2.2DNA质量评价方法563.2.3引物和探针的设计563.2.4单重和双重荧光定量PCR的反应体系和条件573.2.5单重和双重ddPCR反应体系和条件583.3实验结果与讨论583.3.1DNA质量评价583.3.2单重和双重荧光定量PCR定量结果593.3.3单重和双重ddPCR定值结果603.3.4两种平台定量结果的分析比较603.4小结61第四章 通过数字PCR分析转基因生物外源基因拷贝数644.1实验材料、试剂与仪器644.1.1实验材料644.1.2实验仪器644.1.3实验试剂644.2 实验方法654.2.1提取动物和植物基因组DNA654.2.2DNA质量评价方法664.2.3引物和探针的设计664.2.4质粒分子的构建684.2.5基因组限制性内切酶消化694.2.6荧光定量PCR的反应体系和条件704.2.7ddPCR反应体系和条件704.2.8cdPCR反应体系和条件704.3实验结果与讨论704.3.1DNA质量评价704.3.2酶切效果评价704.3.3酶切前后定量PCR拷贝数分析结果714.3.4酶切前后ddPCR拷贝数分析结果724.3.5酶切前后cdPCR拷贝数分析结果724.3.6三种平台定值结果的分析比较724.4小结77参考文献78附录83致 谢85攻读硕士学位期间已发表或录用的论文86第一章 转基因生物及其定量方法研究进展1.1转基因生物发展现状转基因生物，是通过基因工程的手段，从其他生物体内获取目的基因，并将其转入另一生物体内，从而实现基因重组，获得具有新性状的生物体1。自1994年第一例转基因番茄被批准商业化以来，转基因技术发展迅猛，在农业、医药、能源、环保等领域都有着极为广泛的应用。1.1.1全球转基因生物发展现状根据国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）的最新统计数据，自1998年来，全球转基因作物的种植面积持续以每年两位数的速度增长。截止2012年底，全球转基因作物的种植面积已经超过1.7亿公顷2，与2011年相比增长了6%，和1996年相比则增长了100倍之多（图1-1）。全球有28个国家种植了转基因作物，且种植面积位于前九名的国家都种植了超过200万公顷的转基因作物。其中，美国、巴西和阿根廷分别排名前三，种植面积分别达69.5、36.6和23.9百万公顷，占全球种植面积的40.8%、21.5%和14.0%；其次是加拿大和巴西，为11.6和10.8百万公顷，分别占6.8%和6.3%；我国位于第六名，种植面积为4百万公顷，占2.3%。在这28个国家中，发展中国家有20个，种植转基因作物的总面积达到全球面积的52%，而发达国家则只有8个，种植面积占总面积的48%，这是发展中国家的总种植面积第一次超过了发达国家。图1-1 1996年-2012年世界转基因作物种植情况2Figure 1-1 Global Area of Biotech Crops during 1996-2012.2012年全球范围内最为广泛种植的四种转基因作物仍为大豆、油菜、棉花和玉米2。其中，转基因大豆的种植面积最多，高达80.7百万公顷，占大豆总种植面积的81% (图1-2)。在转基因性状方面，2012年全球批准商业化种植转基因品系中，最多的转基因性状为抗除草剂、抗虫以及二者的叠加抗性。其中，抗除草剂大豆、玉米、棉花和油菜的总种植面积占所有转基因作物的比例高达58%以上，叠加抗性的作物则占25%，抗虫作物约占16%。图1-2 2012年四种主要转基因作物种植比例2Figure 1-2 Planting proportion for 4 kind principal GM crops在转基因作物商业化种植的17年间，除28个国家种植商业化转基因作物外，另有31个国家，即共计59个国家和地区批准进口转基因作物的商业化用途，包括用于食物、饲料和释放至环境中。总共涉及25种转基因作物和319个转基因事件2。这表明转基因技术正在飞速发展，并将更广泛的在人类经济、社会和环境等领域产生影响。1.1.2中国转基因生物发展现状作为全世界最早研发和应用转基因作物的国家之一，我国已自主研发转基因植物40余种，其中包括棉花、油菜、玉米、小麦和水稻等，涉及不同种类的目的基因100多种3，表达的性状多以抗逆、抗病、抗虫和品质改良为主。棉花是我国商业化种植面积最广的转基因作物，早在1997年，中国就首次批准了种植转基因抗虫棉，截止2012年底，我国的转基因棉花种植面积已达400万公顷，占全部棉花种植面积的80%4。近年来，我国在转基因粮食的研发和种植上也取得了重大进展，2009年8月17日，华中农业大学张启发院士团队研发的两种转基因抗虫水稻“华恢1号”、“Bt汕优63”获得了农业部颁布的安全证书5；同日获得安全证书的还有中国农业科学院范云六院士团队研发的转基因植酸酶玉米“BVLA430101”，且研发单位此前已将专利转让至奥瑞金公司4。此外，农业部转基因品种转基因安全管理办公室已经为12种转基因玉米颁发了进口许可证。中国在转基因作物进口、研发和种植上的举措，在我国乃至全球范围内都具有着里程碑式的意义，这表明中国的转基因水稻和玉米即将迈入产业化种植和生产的阶段，对我国的农业发展将起到至关重要的作用。1.2转基因生物及其产品的标识管理转基因生物及其产品实施标识管理是转基因生物安全管理的重要内容之一。在全球范围内，超过50个国家和地区对转基因产品实施标识管理，包括两种模式：自愿性标识和强制性标识6（表1-1）。不同的国家会设定不同的标识阈值，该阈值指的是某一个产品含转基因成分所占的比例。例如，对于加工转基因产品玉米粉，转基因玉米含量指的是转基因玉米成分在该玉米粉的玉米成分中所占的比例。通常情况下，标识阈值有以下两种表述方式：一种是以质量百分比进行表述，即转基因玉米的质量/玉米的总质量；另一种是以外源基因与内标准基因拷贝数之比进行表述，即转基因玉米的外源基因拷贝数/玉米的内标准基因拷贝数。由于基因拷贝数和质量之间并不存在标准的线性关系，所以通过这两种不同的表述方式经常得到不同的转基因含量。目前，除欧盟采用拷贝数之比表述标识阈值外，其他实施强制性标识制度的国家均以质量百分比进行计算7。1.2.1强制性标识包括欧盟在内，韩国、日本、澳大利亚、新西兰和泰国等国都实施强制性标识，明确规定特定的标识阈值，即若某一转基因产品的转基因成分含量大于规定的阈值时必须进行标识8。欧盟于2003年颁布两条法规EC No. 1829/2003及No. 1830/2003，规定标识阈值为0.9%，即若食品、饲料或其他转基因产品中的转基因成分含量大于0.9%，就必须进行标识，还必须提供可追踪的制度9。对于标识阈值，欧盟早先于2000年颁布EC No. 49/2000法令，规定标识阈值为1%。2003年又颁布了新的法规，将强制标识的阈值更新为0.9%，并明确以拷贝数之计算转基因成分含量10。我国实行零阈值的强制性标签制度，规定当产品中包含农业转基因生物标识管理办法中规定的转基因成分时必须进行标识。我国农业转基因生物标识管理办法中明确规定了5大类（大豆、棉花、油菜、玉米和番茄）17种转基因产品（五种转基因作物对应的种子、果实和主要加工产品）11。因为转基因产品的不同检测方法在检测极限上存在较大差异，所以检测方法的标准化对于零阈值标识管理至关重要。我国也相应颁布了一系列转基因产品检测方法标准。近年来，转基因产品的种类越来越多，因此农业转基因生物标识管理办法也需要陆续完善，使其更好的服务于我国的转基因产品标识管理。亚洲国家中，日本和韩国等国家也相继于2000年和2001年开始实施强制标识制度。日本将强制性标识阈值规定为5%，并且实施转基因产品年标签标准。韩国政府则规定，凡是某种食品或饲料中的转基因大豆、豆芽、油菜、玉米和马铃薯的成分含量超过3%就必须进行标识12。1.2.2自愿性标识以美国为代表，加拿大、阿根廷等国均对转基因产品实行自愿标识管理政策。在美国，农业部、环保署和食品药品监管局依据各自的职能和分工，对美国转基因生物及其产品实施安全管理。美国农业部的管理目的是确保转基因生物的安全种植，美国环保署则依据联邦杀虫剂、杀菌剂、杀鼠剂法和联邦食品、药物和化妆品法对转基因生物的环境释放进行管理；食品药品监管局则根据联邦食品、药物和化妆品法，负责评估食品和食品添加剂的安全管理，其中规定，只有当转基因食品和相应的传统食品差异明显、具有特殊效果、存在过敏原或用于特殊用途时，才需要进行标识管理13。表1-1全球主要国家和地区的转基因产品标识管理情况 Table1-1 Labeling management of GMO products in major countries 标识类型阈值阈值表述方式国家和地区强制性标识未规定 中国、印度0.9%DNA拷贝数之比欧盟、俄罗斯、爱尔兰1%质量百分比澳大利亚、巴西、克罗地亚、新西兰、沙特阿拉伯、以色列2%质量百分比挪威、智利3%质量百分比马来西亚、韩国5%质量百分比日本、泰国、中国台湾、印度尼西亚自愿性标识未规定 美国、南非、阿根廷、5% 加拿大、中国香港、菲律宾1.2.3低水平混杂的管理伴随着转基因作物广泛的种植和商业化应用，转基因产品低水平混杂(Low Level Presence, LLP)现象也引起了国际上的密切关注。国际食品法典委员会于2008年在Codex植物准则附件3中对转基因生物低水平混杂做出了正式界定：对于某种特定的转基因生物，其在一个或多个国家已经得到批准，在某个进口国进口的农产品中出现了这种转基因生物的微量混杂，但该进口国并没有批准这种转基因生物，这一现象称为LLP14。国际贸易中已经发生多起LLP事件。例如2000年的美国Starlink转基因玉米事件，该事件导致美国出口玉米价格下跌了6.8%，并且持续了近一年时间15。因此，LLP会对国际贸易带来诸多影响，容易引起国际贸易摩擦，其管理尤为重要。欧盟在立法EU 619/2011中对LLP进行了严格规定，明确其阈值为0.1%。1.3转基因生物及其产品定量检测方法概述在保证标识过程中，转基因生物及其产品的检测成为必不可少的环节。由于不同国家和地区都规定了不同的标识阈值，因此如何准确测定某一转基因产品中转基因成分的含量就显得尤为重要，这直接关系到标识制度的顺利实施。然而，不同的定量检测方法具有不同的特异性、灵敏度等特点，因此选择适合的定量方法也是极为关键的。目前常规的转基因检测过程中，最常用的定量检测方法是实时荧光定量PCR。近年来，随着核酸检测技术的飞速发展，数字PCR在转基因定量检测中也表现出了巨大的潜力和优势。1.3.1转基因成分含量表述方式与第一章1.2中类似，转基因成分含量是指某一个转基因产品含有转基因成分所占的比例。也通常使用质量百分比或基因拷贝数之比两种方式进行计算和表述。对于已知成分和含量的样品，可以通过直接计算质量百分比表示转基因成分含量，但在实际样品的检测中，如果样品中转基因成分和含量未知，则两种表述方式都需要通过对内、外源基因的分别扩增来来计算其含量。因此，内、外源基因的选择也非常重要。内源基因也称作内标准基因，能够用于转基因产品定量检测的内标准基因必须具有种间特异性，种内非特异性和低拷贝数（一般是单拷贝）等特征16。而在外源基因的选择上，一般来说，特异性最高的品系特异性序列往往用作某一转基因成分定量检测的最佳选择17-19。1.3.2荧光定量PCR 荧光定量PCR是目前在转基因产品检测中最为常用的一种定量检测方法，通过建立标曲线，对样品中的未知模板进行定量检测和分析。因为在检测的过程中需要依赖标准曲线，因此被认为是一种相对定量技术。1.3.2.1 荧光定量PCR原理荧光定量PCR也称作实时荧光定量PCR，是一种建立在荧光能量传递技术基础之上的检测方法。该方法的基本原理是通过在PCR反应体系中加入荧光报告基团，对整个PCR反应进程的荧光信号累积状况进行实时监测20。在荧光定量PCR技术的发展过程中，诞生了各种各样的荧光染料和荧光探针，以满足不同的荧光监测需求。其中，常用的荧光染料包括SYBR Green I21和Eva Green 22等；常用的荧光探针有TaqMan探针23、TaqMan-MGB探针24以及AUDP探针25等(图1-3)。图1-3 TaqMan和TaqMan MGB探针的结构和工作原理Figure 1-3. The structure and principle of TaqMan and TaqMan MGB probe在转基因生物及其产品的检测中，荧光定量PCR则需要依赖标准曲线的建立实现定量检测，具体原理如下26：在荧光定量PCR反应进行过程中，荧光信号随着模板扩增不断积累，最终可以将整个反应的荧光信号绘制成一条曲线，PCR扩增期间生成的产物量可用如下公式表达： X=X0 (1+Ex) n式中， n为循环数，X为第n个循环后的产物量，X0为初始模板量，Ex为反应效率。若在扩增产物达到阈值（M）时所经历的循环数为Ct，则此时的产物量XCt为：XCt=X0 (1+Ex) Ct =M上式可转化为： log X0 = - log(1+Ex) *Ct+ log M从式中不难看出，log X0和Ct呈线性相关。标准曲线的建立是利用一系列已知起始浓度的标准品为模板进行实时荧光PCR扩增，根据每个梯度所得Ct值与初始拷贝数对数间的线性关系绘制而来的。有了标准曲线后，将待测样品在同一阈值下得到的Ct值带入标准曲线中，就能计算得出目标序列的初始拷贝数（图1-4）。通过分别建立内源基因和外源基因的标准曲线，并计算出待测样品的内源基因初始拷贝数和外源基因的初始拷贝数，就可得到该样品中转基因成分的百分含量。图1-4荧光定量PCR标准曲线建立原理Figure 1-4 Principle of standard curve for real-time PCR1.3.2.2 荧光定量PCR的应用荧光定量PCR在生命科学研究的各个领域都有着广泛的应用，如环境27、微生物28和临床诊断29等。在转基因生物及其产品的检测中，荧光定量PCR更是得到了充分的利用，其中，基于TaqMan探针的荧光定量PCR由于其简单及高度的特异性得到了最多的应用，研究人员几乎为每一种转基因作物都建立了相应的定量检测方法30。例如，Guo等建立了转基因番木瓜华农一号的品系特异性定量检测方法31，Yang等对两种转基因棉花Mon1445和 Mon531均建立了相应的品系特异性荧光定量PCR检测方法等32。此外，多重的荧光定量检测方法因为能够同时检测多个靶标，降低了反应试剂、模板的消耗和反应的个数，几年来也被较多的采用。如Bahrdt等33就建立了一种复合荧光定量PCR法，能够同时检测6个靶标，并且具有很高的灵敏度（10拷贝）。荧光定量PCR技术因为具有较高的特异性，并且没有反应后续的凝胶电泳等分析过程，能够较转基因产品的定量分析，然而好的避免污染，缩短反应时间，是转基因检测中常用的定量方式。但是，随着核算研究技术的不断进步，通过这种技术进行定量分析的缺点也逐渐暴露出来：首先，荧光定量PCR的定量计算过程需要完全依赖标准曲线和标准物质进行，只能称作一种相对定量技术，对于标准物质提出了很高的要求，并不能实现真正意义上的绝对定量技术34；其次，荧光定量PCR对标准曲线的要求非常严格，反应效率在90%以上，R2值大于0.95的标准曲线才可用于在扩增过程中，扩增反应往往会受到DNA纯度和反应体系的抑制因子等因素的影响，从而导致内源基因或外源扩增序列拷贝数的不准确估计35；此外，荧光定量PCR的灵敏度有限，根据大多数文章报道，该方法的检测极限约为每反应30-100拷贝36-38，若检测的样品中转基因含量极低，则荧光定量PCR无法检测出，会造成假阴性的检测结果。特别是对于我国实行零阈值标识方式，检测极限就更加重要。综上所述，荧光定量PCR已经逐渐不能满足于当今社会对于转基因生物的定量检测需求了。在这样的情况下，数字PCR应运而生。1.3.3数字PCR 数字PCR技术是近年来新发展起来的可应用于转基因检测及标准物质定值的方法，早在1992年，就已经有科学家提出了数字PCR(digital PCR)的构想，期望通过样品极度稀释、泊松分本和终点法PCR，来实现核酸的定量39。在这之后二十年的探索中，数字PCR最终逐步发展成为一种较为成熟的绝对定量技术，并被各个研究领域的学者广泛使用。1.3.3.1数字PCR原理数字PCR技术，是通过将微量样品进行大倍数（极度）稀释，并将其细分到多个微反应室中，这样的稀释会产生两种结果：一种是微反应室中只含有一个DNA分子，另一种是微反应室中不含DNA分子，此时，再将所有的微反应室在相同条件下进行PCR扩增反应，这样也会导致两种反应结果：含有DNA分子的微反应室能够发生PCR反应，产生阳性信号，系统会将其判读为“1”；而不含DNA的微反应室则犹豫缺少模板而无法发生反应，产生阴性信号，系统将其判读为“0”。此时，系统再通过泊松分布，对产生阳性信号的微反应室进行逐个计数，从而计算出样品中初始的DNA模板量40。因为这样的计算方法和计算机中的二进制语言非常类似，是通过数字信号来分析数据的，所以科学家将其称为数字PCR。其基本原理如图1-5所示。图1-5 数字PCR原理Figure 1-5 Principle of digital PCR然而，在数字PCR运行时，微反应室中仅仅含有一个DNA分子的随机分布是无法保证的，很有可能反应室中会进入两个甚至两个以上的DNA分子。那么，怎么保证数字PCR的这种理论分布呢？泊松分布（Poisson Distribution）是数字PCR设想成立的一个非常重要的依据，数字PCR的结果需要根据泊松分布的统计学方法来进行分析，即： 式中，为每个微反应室中DNA的平均浓度（拷贝数），p则代表在条件下，每个微反应室中包含k个拷贝DNA的概率，样品的稀释系数为m，因为m能够决定样品稀释后的浓度，故位=cm。其中c为样品的原始浓度（拷贝数），当k=0时，体系中不含DNA。上式可变为p=e，可以视为无荧光信号的微反应室个数与所有微反应室总数的比值：n-fn=e-cm上式中，n代表微反应室总数，f代表检测到荧光信号的微反应室个数。对上式两边取自然对数ln，可得：n-fn=e-cm所以，根据数字PCR微反应室总数、有荧光信号的微反应室个数以及样品DNA的稀释系数，就可计算得出样品的原始浓度（拷贝数）41。数字PCR是一种绝对测量方法，原因有二：第一，在样品被极度稀释和细分后，只有含有1个DNA分子的细分试样中才能够发生PCR反应并将产生的荧光信号放大，从而使系统通过逐个计数的的办法来计算样品中的DNA分子数，即便细分试样中含有干扰信号的杂质分子（如反应抑制因子），但由于杂质分子产生的荧光信号和靶标DNA并不在同一水平，因此其信号将不会影响最终的检测结果42；第二,通过数字PCR进行定量分析时，不需要依赖任何的外部标准，如标准物质和标准曲线等，仅仅需要样品本身的DNA来进行扩增反应，并最终通过逐个计数的方法计算初始浓度43。和荧光定量PCR相比，数字PCR具有以下优势：（1）能够有效地避免扩增反应中抑制反应因子的干扰，具有较高的反应效率；（2） 无需建立标准曲线，也不需使用标准物质等的任何外部标准；（3）具有更高精确性，这为一些高要求的计量分析提供了很大帮助；（4）灵敏度高，非常适合低拷贝样品的定量，并为转基因成分含量极低的样品检测提供了可能；（5）由于数字PCR采用终点法的检测模式，并且在反应中能够排除抑制因子的干扰，这也使其在很大程度上避免了荧光定量反应中基体效应带来的偏差44。1.3.3.2四大数字PCR平台 在数字PCR的概念提出并不断完善后，各大公司迅速瞄准了数字PCR的市场潜力，相继推出了基于不同技术的数字PCR平台。目前，全球一共有四大数字PCR平台，分别是基于亲疏水芯片技术的数字PCR、微流体芯片数字PCR、微滴式数字PCR和3D数字PCR。1.3.3.2.1微流体芯片数字PCRFluidigm公司率先在2006年底推出了首个商业化的数字PCR平台Bio-Mark 高通量基因分析系统（chamber digital PCR，cdPCR）。该系统有效地结合了微流体技术、生物技术和微电子技术，技术核心在于集成液体通路技术，即利用集成电路的制作工艺，通在硅片上刻出许多微管和微腔，并设计了各个阀门来控制液体在微管和微腔中的流动，从而完成反应体系的分液、混合和PCR扩增。该技术在很大程度上简化了样品和试剂的分液操作，每个细分试样的反应体仅为几纳升，大大减少了样品和试剂的使用量45。Bio-Mark基因分析系统由如下四部分构成：整合了高性能计算机的Bio-Mark实时PCR系统、IFC微流体芯片、IFC Controller（将反应体系导入至IFC微流体芯片中）以及反应结果分析软件。目前，Fludigm提供两种类型的IFC微流体芯片：动态芯片（Dynamic Array，有48.48和96.96两种规格）和数字芯片（Digital Array，有12.765和48.770两种规格），能够满足不同通量和目的的实验分析（图1-6）。图1-6 Fludigm 12.765 数字芯片（左）和48.48动态芯片（右）Figure 1-6 Fludigm 12.765 digital array (left) and 48.48 dyanamic array整个过程分为如下五个步骤：（1）在芯片中加入control line并使用IFC Controller准备芯片；（2）将配制好的反应体系加入芯片的上样孔中，并使用IFC Controller使反应体系进入到数百（765或770）个单独的PCR反应微室中；（3）将芯片载入BioMark系统，进行PCR扩增；（4）通过分析软件分析扩增结果，计算样品中初始DNA浓度。1.3.3.2.2基于亲疏水芯片技术的数字PCR在Fludigm推出BioMark的第四年，Life Technologies公司也推出了OpenArray系统，这是一种基于亲疏水芯片和通道技术的数字PCR平台。扩增反应需要在其生产的OpenArray 平板上运行，OpenArray平板上共有3072个通孔，每一个通孔都可作为独立的PCR反应孔，每个通孔的直径和深度都为300m。平板以48个子阵排列，每个子阵包含64通孔，共计3072个通孔。平板表面因为经过特殊处理的包被而表现出疏水的特性，但通孔内部是亲水并具有生物兼容性的。在进行PCR反应时，通过表面张力的作用，每一个通孔中都进入了33纳升反应体系46。一块OpenArray平板可以进行48个样品的数字PCR反应， 而OpenArray系统一次最多可以同时运行3块OpenArray平板。即一次可以总共分析144个样品，达到了较高的通量。OpenArray系统的数字PCR的实验流程主要包括如下五步：（1）稀释：将样品DNA稀释到最适浓度；（2）上样：将样品和反应体系加入OpenArray平板的上样孔中；（3）循环与成像：利用OpenArray AccuFill系统将体系载入OpenArray平板；（4）密封：将完成上样的平板插入OpenArray箱中，装满浸液，用封箱胶水将其密封；（5）利用OpenArray 实时定量系统运行PCR反应。图1-7 TaqMan OpenArray数字PCR平板 Figure 1-7 TaqMan OpenArray digital PCR plate1.3.3.3 微滴式数字PCR数字技术不断发展成熟，微滴式数字PCR问世了。微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）最初由QuantaLife公司开发，2011年10月，Bio-Rad公司收购QuantaLife公司并推出QX100 ddPCR系统。与上文提到的两种基于芯片技术的数字PCR不同，QX100 ddPCR系统是通过微滴实现对DNA分子的细分。因为加入了含有特殊成分的预混液，反应体系能够形成数以万计（最多可达10,000）个纳升级的微滴，并将DNA分子随机分布到这些微滴中，这样有些微滴含有一个至数个DNA分子，有些微滴则不含DNA分子。也就是说，每个微滴都成为了一个独立的PCR微反应室。PCR扩增完成后，微滴分析仪（droplet reader）会逐个读取每个微滴，区分阳性微滴和阴性微滴，并通过对它们的分别计数、比例和泊松分布的原理，计算出初始的样品浓度或拷贝数47。QX100系统主要包括微滴生成仪和微滴读取仪两个部分，具体的工作流程包括如下几个步骤：（1）配制反应体系，将其加入微滴生成卡中；（2）将微滴生成卡放入微滴生成仪，运行仪器，生成微滴；（3）将微滴从微滴生成卡转移至96孔板中；（4）把96孔板置入PCR仪，运行PCR程序；（5）扩增结束，将96孔板转移到微滴读取仪上，读取扩增结果。图1-8 BioRad微滴数字PCR工作流程Figure 1-8 The workflow of droplet digital PCR1.3.3.4 3D数字PCR3D数字PCR是Life Technologies公司于2013年最新推出的数字PCR平台，即 QuantStudio系统。这也是一种基于芯片的数字PCR，其技术核心在采用了于高密度纳米流体芯片，芯片上包含20,000个微孔可进行PCR反应，每个微孔的直径仅为60微米。3DPCR还有另外的有点，它体积非常小巧，宽度约5英寸，深度约8.5英寸，高度约8英寸，价格也较其他数字PCR低，是一种具有广阔发展空间的数字新型PCR平台48。图1-9 QuantStudio 3D数字PCR芯片Figure 1-9 QuantStudio 3D digital PCR chip1.3.4数字PCR及其应用 数字PCR自上市以来就表现出巨大的应用潜力，已经有诸多学者将其利用于生命科学研究的各个领域，目前已经报道的文献中主要有绝对定量、稀有突变检测和拷贝数变异等49。对于前三种数字PCR平台的应用报道较多，3D数字PCR由于今年刚刚上市，目前未见相关文献报道。在这些文章中，数字PCR都被证明具有较高的准确度和灵敏度。在转基因生物及其产品的检测中，主要是发挥数字PCR在绝对定量上的优势，M. J. Burns等人通过Fludigm的数字芯片和动态芯片分析了欧盟有证标准物质中转基因玉米MON810的含量，并对该平台的灵敏度进行了测定，发现能够检测到5个拷贝的外源基因；Corbisier等50也用该技术对MON810中的外源序列和内标准基因的拷贝数，并使用质粒标准物质对同一样品在荧光定量PCR平台上进行了定量，发现两者结果一致，在一定程度上证明了数字PCR的可靠性；Morisset等人则着重使用ddPCR分析了食品和饲料中的转基因成分含量，发现ddPCR比定量PCR有着更好的灵敏度（5-6拷贝的检测极限）和动态范围（约10,000拷贝以内），并且是进行双重定量检测的绝佳选择44。另外，对于数字PCR价格昂贵的问题，Morisset等人认为，在大批量样品处理时，数字PCR的价格反而低于荧光定量PCR44。1.3.5展望随着转基因植物的种类逐渐增多、种植面积不断增加，市面上转基因产品的种类也越来越琳琅满目，这都对转基因阈值标识的管理带来了极大的麻烦，如何准确、精确地对转基因产品中的转基因成分进行定量，已经成为现今转基因产品检测技术研究的一大重点。传统的荧光定量PCR依然是公认的经典方法，但数字PCR的面世更是给大家带来了希望：它不依赖任何外部标准、能够有效节省试剂和样品、具有更高的灵敏度。这些都使得数字PCR在转基因产品的定量检测中表现出巨大的潜力。然而，数字PCR的普及和推广依然面临着很多问题，最大的问题就是价格昂贵，cdPCR的芯片为400美金一张，OpenArray为150美金一张，ddPCR相对较低，平均每个样品需要3美金的检测费用49，但这些费用都是不包含仪器和耗材的价格，可见数字PCR的昂贵。另外，数字PCR的检测通量也比较低，荧光定量最多可以使用384孔板进行，然而数字PCR最多也只能同时检测144个样品（OpenArray），使得大批量的检测费时费力。可见，数字PCR还需要各界科学家们的共同努力，才可以真正实现转基因产品定量检测的快速化、准确化、高通量化和低成本化。上海交通大学硕士学位论文 第二章第二章 数字PCR在转基因生物标准物质定值中的应用转基因生物标准物质（Genetically Modified Organism Reference Material, GMO-RM）是具有一种或多种足够均匀、稳定，并能很好地确定转基因成分含量的物质，在转基因生物及其产品检测中，标准物质常用于给未知含量的材料赋值、校准测量仪器或装置以及评价测量方法51。转基因生物标准物质在转基因产品的检测中发挥着极其重要的作用，它担当着“金标准”的角色。转基因生物标准物质的特性量值，就是确定的转基因成分含量质量百分数的准确程度，该转基因百分含量是基于材料DNA中转基因拷贝数比例来计算的。可见，标准物质本身必须具有非常精确和稳定的特性量值，才能够用于盲样的准确定值。目前，在标准物质的定值过程中，多用于重量法和实验室间协同的荧光定量PCR法来进行赋值52。 本章节针对转基因生物标准物质中最为常用的两种类型基体标准物质和质粒标准物质，分别使用传统的荧