攻读博士学位研究计划(范文).docx

拟攻读博士学位计划书定鞭金藻（Haptophytes）在中国典型海域的群落结构及其生态学功能目录第一部分：对国内外现有研究的认识. 11、引言（Introduction）. 11.1 海洋微型生物生态学概述（Summary on Marine Microbial Ecology）. 11.2 定鞭金藻门类（Taxonomy of Haptophyta）. 22、定鞭金藻的研究现状（Research Status of Haptophytes）. 42.1 定鞭金藻的代表性物种（Typical Species of Haptophytes）. 42.2 定鞭金藻有害藻华的毒理学机制及其他环境效应（Toxicological Mechanisms onHarmful Algae Blooms for Haptophytes and Other Environmental Effects）.72.3 显 微 技 术 、 流 式 细 胞 技 术 及 分 子 生 物 学 技 术 等 在 定 鞭 金 藻 研 究 中 的 应 用（Application of Microtechnique, Flow Cytometry and Molecular Biotech- nologies Etc. for Haptophytes Research）. 92.4 生态（毒理）学在定鞭金藻研究中的应用（Application of Eco-(Toxico-)logy forHaptophytes Research）.112.5 生 物 信 息 学 在 定 鞭 金 藻 研 究 中 的 应 用 （ Application of Bioinformatics forHaptophytes Research）.123、定鞭金藻的研究意义及展望（Research Meanings and Future Research for Haptophytes）. 14 第二部分：读博工作安排与预期目标. 15 参考文献：. 17第 20 页 共 22 页第一部分：对国内外现有研究的认识1、引言（Introduction）1.1 海洋微型生物生态学概述（Summary on Marine Microbial Ecology） 海洋微型生物生态学是一门新兴学科，是科学技术高速发展的产物。它将地球上最大的“海洋”与最小的“微型生物”通过“生态学”联系起来，实现了宏 观与微观的耦合（陈宜瑜院士语）。近 20 年来，新方法、新技术在海洋领域的应 用导致了一系列有关微型生物的重大发现，推动了学科的形成和迅速发展1。自上世纪 70 年代以来，人们不断加深了对海洋微型生物的认识，新生的理 论与认识在传承经典的同时，也时常出现“打破”或“颠覆”式的超越（图 1）。 海洋微型生物是地球上的第一批“居民”，是改造地球环境的先锋。从古至今， 海洋微型生物都在为调节全球变化默默无闻地工作着。在这个过程中，海洋微型 生物是生物量和生产力的主要贡献者，是生命和非生命系统联系的关键环节，是 生源要素循环的重要驱动力1, 2。然而，人们对海洋微型生物的认识还非常有限， 已经研究过的海洋微型生物不到总量的 1%3。图 1 海洋微型生物（微型生物生态学）研究进程Fig.1 Research process for Marine Microbes (Microbial Ecology)由图 1 可知，每一重要理论的认识都是通过某些代表性的海洋微型生物（往 往是整个类群的研究）实现的，从而推动了海洋环境，乃至全球环境的研究。因 此，对典型的海洋微型生物的环境行为效应等进行深入研究有重要价值。1.2 定鞭金藻门类（Taxonomy of Haptophyta）定鞭金藻（Prymnesiophyceae），又称为土栖藻或普林藻，因其具有附着鞭毛（Haptonema），20 世纪 50 年代前后通常称其为触丝藻（Haptophyceae）。在早期 分类中，定鞭金藻是从金藻纲（Chrysophyceae）中分离出来的一个独立类群（因 其色素体带黄色）4。直到 1962 年，Christensen 才将其定为金藻门（Chrysophyta） 的一个纲，即定鞭金藻纲（Prymnesiophyceae）（如图 2-）5。但将定鞭金藻从 金藻门中独立出来，“自立”定鞭金藻门（Haptophyta），经历了一个比较复杂的 历史分类过程。以定鞭金藻门、颗石藻目（Coccolithales）藻类为例，20 世纪初 期，颗石藻只是一个属（Coccolithophoridae）；同时，具有两条规则鞭毛的海藻 都归属于等鞭金藻目（Isochrysidales），并因其会产生棕黄色的色素体而被归于 金藻纲中。这种分类忽略了其他具有两条规则鞭毛的金藻。此后，又发现了另一 种含有 3 条（类）鞭毛（两条为鞭毛-flagella，另一条为顶鞭丝-haptonema（捕食 作用） 的微藻，并将其归入为 Prymnesiaceae 科中。20 世纪中叶，一个新属微 藻（巴夫藻属-Pavlova）被发现，因其具有“第三条”鞭毛而被归入 Prymnesiaceae 中。20 年后，有更多的种被归入巴夫藻属，从而新立了一个科巴夫藻科（Pavlovaceae）；20 世纪中叶的另一个重要突破是定鞭金藻的结构得到了阐释， 且在淡水和海域都发现了它的踪迹。至此，形成了 1 目 2 纲等鞭金藻目（Isochrysidales）、定鞭金藻纲（Prymnesiaceae）和巴夫藻目（Pavlovaceae），并 组成了一个门（class）定鞭金藻门（Haptophyta）。此后的超微结构观察显示， 以上各类微藻都属于粘着性植物（haptophytes），结合亚分子研究，说明以上分 类在形态学上是合理的6。根据定鞭金藻鞭毛的规则性，此后又将含有规则鞭毛的藻类归入定鞭金藻类 群 ， 而 将 不 规 则 鞭 毛 微 藻 归 入 巴 夫 藻 类 群 ， 即 成 立 了 定 鞭 金 藻 纲（Prymnesiophyceae）和巴夫藻纲（Pavlovophyceae）（图 2）。考虑到颗石藻类 群具有超过 15 个现存属和 30 多个化石属，而等鞭金藻、定鞭金藻和棕囊藻类群 属较少（不超过 4 个），因此成立了 4 个目定鞭金藻目（Prymnesiales）、颗 石藻目（Coccolithales）、棕囊藻目（Phaeocystales）和等鞭金藻目（Isochrysidales）（如 2）。虽然自 1976 年 Hibberd 将定鞭金藻独立为一个门（Haptophyta）以 来，对其分类有了较系统的认识，但将定鞭金藻定义为一个纲（Haptophyceae） 的情况仍有出现7, 8。而我国对定鞭金藻的分类比较不统一，如胡鸿钧等9已将 定鞭金藻独立为一门，但王立等10仍将定鞭金藻纲中的三毛金藻属（Primnesium）和等鞭金藻属（Isochrysis）归于金藻门，对于巴夫藻类群的归属问题在藻类学著名专著中国淡水藻类系统、分类和生态中也未曾收录9。颗石藻目微藻 种群数量与定鞭金藻纲很接近，但 4 目分类已经应用了 30 多年，因此上述分类 仍旧是当前的分类基础6（如图 2 所示）。图 2 定鞭金藻系统分类示意图Fig.2 Schematic diagram for systematic classification of Haptophyta2、定鞭金藻的研究现状（Research Status of Haptophytes）2.1 定鞭金藻的代表性物种（Typical Species of Haptophytes） 定鞭金藻门下属两个纲，共5个目。其共有特点是：单细胞或群体，具周质膜，有2条等长的鞭毛（及一条顶鞭丝），色素体2个，带状，有的细胞壁具有碳 酸钙小片。生殖时细胞纵裂，或产生2条鞭毛的游动孢子。在淡水或海水中都有 分布种类。巴夫藻目和定鞭金藻目的主要区别是前者的鞭毛是不规则的，且含有 眼壶（eyespot）及类瘤体结构（knob-like body），同时，二者的分子生物学差异 也得到了证实6。巴夫藻目的代表性物种是绿色巴夫藻（Pavlova viridis）和路氏 巴夫藻（Pavlova lutheri），其典型特征是定鞭丝不能弯曲，而定鞭金藻目如小定 鞭金藻（Prymnesium parvum）和三毛金藻（Prymnesium parvum Cater）的定鞭丝 可以弯曲，且较发达，这对其占据优势的生态位有重要作用。定鞭丝极度退化的两个类群是颗石藻目和等鞭金藻目微藻，前者的原生质外有鳞片，如赫氏颗石藻（Emiliania huxleyi）和钙板金藻（Calcidiscus leptoporus）；而后者的细胞裸露， 原生质外无鳞片，鞭毛等长，如等鞭金藻（Isochrysis zhanjiangesis，Isochrysis Parke 等）和叉鞭金藻（Dicrateria zhanjiangesis，Dicrateria inornata，Dicrateria Parke 等）。棕囊藻属最早由Hariot于1892年在Pouchet发现，目前主要将其分为6类： Phaeocystis pouchetii、Phaeocystis globosa、Phaeocystis scrobiculata、Phaeocystis antarctica、Phaeocystis cordata、Phaeocystis Jahnii11，主要分布于南、北两极及 寒、温带12（如图3所示，图片来源于NCBI数据库13）。其中，路氏巴夫藻、等鞭金藻是主要的海洋经济微藻14。12A BCD EA.1&2 路氏巴夫藻 Pavlova lutheri；B.1&2 小定鞭金藻 Prymnesium parvum；C. Coccolithophore sp.；D.1 等鞭金藻 Isochrysis、2 叉鞭金藻 Dicrateria；E.1 Phaeocystis sp. Cells、2 Phaeocystis globosa图 3 定鞭金藻的代表性物种Fig.3 The typical species of Haptophytes2.2 定鞭金藻有害藻华的毒理学机制及其他环境效应（Toxicological Mechanismson Harmful Algae Blooms for Haptophytes and Other Environmental Effects）2.2.1 有害藻华有害藻华（Harmful Algae Blooms，HABs）事件通常发生于低海拔的上升流 区域（upwelling regions）15，是由近海藻类种群密度过高而致，且常伴随着毒 素的释放。这会造成当地生态破坏，经济受损，同时会对旅游业养殖业及水域 管理造成不可估量的损失16。自 Chrysochromulina polylepis 藻华首次（1988 年） 在欧洲爆发以来，人们开始了对 HABs 的关注17。有害藻华的发生，主要是绿藻门（Chlorophyta）蓝藻门（Cyanophyta） 硅藻门（Bacillariophyta）、金藻门（Chyosophyta）、定鞭金藻门（Haptophyta）和 甲藻门（Pyrrophyta）的代表性物种单独或混合作用的结果。其中，铜绿微囊藻（ Microcystis aeruginosa ）、 鱼 腥 藻 （ Anabaena sp. ）、 汉 氏 菱 形 藻 （ Nitzschia hantzschiana ）、 小 等 刺 硅 鞭 藻 （ Dictyocha fibula ）、 小 定 鞭 金 藻 （ Prymnesium parvum）和薄甲藻（Glenodinium pulvisculus）是六大门类的代表性物种18。对各 代表性藻类进行研究，是实现有害藻华防治的理论依据，也是海洋微型生物生态 学在海洋环境研究及全球气候变化监测等领域的重要内容之一。2.2.2 有害藻华的爆发及毒理学机制 藻华发生时的有害性主要有两种情况：释放毒性物质或因藻群繁殖而大量消耗 水 体 的 溶 解 氧 19 。 据 报 道 显 示 ， 颗 石 藻 （ Emiliania huxleyi 和 Calcidiscus leptoporus）和棕囊藻（Phaeocystis sp.：P. pouchetii-北极洲，P. globosa-热带和亚 热带海域和 P. Antarctica-南极洲）是有害藻华爆发的主要定鞭金藻类群15, 20。通 常认为，有害藻华的发生与光照和温度21-23、盐度22, 24、N/P 浓度与比例23, 25-29 有关，甚至还会受水体中病毒数量、活性等的影响30。目前，对棕囊藻有害藻华的爆发研究比较深入。该藻自身具有毒性，危害较 大。首先，该藻球形群体外围具有一层柔软的胶质被且藻体含多糖，当大量繁殖 形成赤潮时，含胶质和糖的藻体便紧紧贴在鱼鳃上。影响鱼的呼吸和摄食，致使 鱼类窒息，缺氧而死亡。其次，该藻巨大的生物量（尤其是黎明和傍晚时）可造 成水体缺氧导致灾害。再加上藻体和藻细胞死亡腐烂后会产生溶血毒素等有毒物 质，对水体环境的破坏将持续一定时间，严重时会导致鱼类大面积死亡，尤其对 网箱养殖和对虾育苗危害更大。2012 年，南极海域出现大面积海藻爆发，美国 宇航局“大地”卫星上搭载的 Modis 设备拍摄到数张图像。科学家分析造成这次事故的主要是棕囊藻31 。研究较多的另一有害藻华爆发种是小定鞭金藻（P.parvum）。研究表明，其生长和爆发与生态环境有重要关系。其中，水体盐度与 温度是两个主要因素。当盐度在 0.3-3.0%，温度在 5-30时，P. parvum 易对其 他水生动植物产生危害22, 24。有研究认为，盐度在 4.0-8.0 ppt 时 P. parvum 易达 到生长峰值32，而温度为 15-24时会发生藻华33。有 害 藻 华 的 爆 发 与 其 对 其 他 生 物 的 毒 害 作 用 往 往 是 一 个 同 步 过 程 。 以 Prymnesium parvum 为例，当环境发生改变时（主要是受食物源的影响），P. parvum 会根据不同的环境条件作出不同的响应。环境中是否存在可供光合生长利用的无 机 N/P 是决定 P. parvum 是否会大量繁殖并产生毒素的关键因素。而藻类的过度 繁殖及对其他生物的危害又会反过来破坏整个生态系统，产生负反馈调节。P. parvum 的生长繁殖及危害机理如图 4 所示。图 4 P. parvum 生长繁殖及危害机理示意图（综合自文献34-37）Fig.4 Schematic diagram about growth-reproduction and toxicological mechanisms of P. parvum（Summarized from the references 34-37）2.2.3 定鞭金藻的其他环境效应 定鞭金藻大量繁殖，消耗水体中的溶解氧并释放有毒物质是其环境效应的一方面。此外，定鞭金藻会分泌大量的二甲基丙酸噻啶（dimethylsulfoniopropionate， DMSP），该物质具有渗透调节作用（osmoregulation），以抵抗捕食者及抗氧化。 同时，定鞭金藻藻华发生时二甲基硫化物 DMS 是大气中硫的主要贡献者，DMS 具有吸潮作用，使大气中云的密度增加，易形成酸雨。此外，硫化物会以小颗粒形式存在，导致太阳光大量返回宇宙中，因此地球气温下降15, 19, 38, 39。然而，此结论有待进一步研究。定鞭金藻藻华的另一个作用是海洋的钙质沉淀（calcareous sediments）。其中， 钙质石藻（calcareous coccolithophores）是主要贡献者，其优势种是赫氏颗石藻（Emiliania huxleyi），但贡献最大的是钙板金藻（Calcidiscus leptoporus）15, 40, 41。2.3 显微技术、流式细胞技术及分子生物学技术等在定鞭金藻研究中的应用（ Application of Microtechnique, Flow Cytometry and Molecular Biotech- nologies Etc. for Haptophytes Research）微型生物个体极小，成为研究发展的首要障碍。微型生物的研究进展很大程 度上取决于技术的进步。从技术手段来说，微型生物的研究经历了三大“变革”： 以显微技术为基础的观察分析，以流式细胞技术（FCM）为基础的快速测定和 以分子生物学技术为基础的多样性分析与功能基因分析1。定鞭金藻作为微型生 物的一支，也经历了以上三个方法学的发展过程。2.3.1 种群分类及生物多样性分析 按照国际惯用的生物粒级尺度标准，海洋单细胞浮游生物大致可划分为三类：网采浮游生物（Netplankton），20200 m；纳微型浮游生物（Nanoplankton），220 m；皮微型浮游生物（Picoplankton），0.22 m1。据此，定鞭金藻基本都 属于纳微型浮游生物，如 P. parvum 是一种单细胞微藻，细胞大小为 8-15 m4-10m（长宽）42；棕囊藻细胞呈球形或近球形，直径为 2.57.0 m，但群体胶质 囊大小可达 1102600 m10。随着更多超微型海洋生物的发现，基于粒级尺度的 划分标准已不适用，但显微技术仍然是微型生物研究必不可少的手段。常用的显 微技术有透射电子显微技术（Transmission Electronic Microscopy，TEM）和表面（落式）荧光显微技术（Epifluorescence Microscopy，EFM）43-46。而流式细胞 技术可以实现对定鞭金藻的快速分类与定量1, 47。虽然分子生物学技术起步较早，但真正被大规模应用于海洋微型生物方面的 研究还是在 90 年代以后，其代表性研究是 Giovannoni 等利用 PCR 扩增 16S rRNA 片段的技术研究了大西洋马尾藻海的浮游细菌群落结构48。与传统分类方法不同 的是，分子生物学技术是基于物种遗传物质的异同而进行归类的，正是因为分子 生物学的参与（与形态观察相结合），才使得对定鞭金藻的传统分类有了新突破， 其结果如图 2 所示。根据现有报道显示，被广泛用于定鞭金藻种群分类及生物多 样性分析的分子生物学技术（手段）主要有：PCR 扩增技术49-51、DNA 测序技术52、（PCR-）DGGE 技术52-55、TGGE 技术54、HPLC 技术56、实时定量 PCR57,58、qPCR 技术54、AFLP 技术59等。近些年，环境基因组技术和环境蛋白质组 技术已成功应用于对假微型海链藻（Thalassiosira pseudonana）和三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）的种群分析15，但在定鞭金藻方面的研究未见报 道。2.3.2 毒理学（生理生态）研究 微藻的生理生态与细胞的物理化学特征和生物化学特征有关，如细胞的大小、细胞质的颗粒性、细胞色素的含量及 DNA 或 RNA 含量等1。对微藻生理生 态开展研究，能够为揭示有害藻华爆发的机制、毒理学作用及其防治提供有效措 施，这也是实现海洋微型生物生态学研究的必要途径。流式细胞技术已被广泛应用于海洋微型生物的生理生态研究，如细胞膜电位 分析、细胞活性分析、单细胞色素分析及细胞分选等1，该技术目前也实现了对 定鞭金藻的化学分析60。据现有报道显示，RT-PCR 技术也实现了对定鞭金藻碱 性磷酸酶的表达测定61，而探针技术、HPLC 技术等也是定鞭金藻生理生态学研 究的一项辅助技术56, 62, 63。有报道显示，将流式细胞技术与分子生物学技术联合 用于此方面的研究是可行的64。此外，海洋微型生物流式图像技术、细胞膜电位 测定技术（同位素标记技术、荧光分光光度法等）、时序红外显微技术（TIREM）、 活细胞测定技术（核酸染色技术、Live/Dead BaclightTM 细菌活性工具包、放射自 显影技术等）、原子力显微镜技术和酶联放大-荧光原位杂交技术（CARD-FISH）、 荧光原位杂交-微放射自显影技术（Micro-FISH）和碳源利用分析技术等1都可在 定鞭金藻的生理生态研究中得到更深入的研究与推广。然而，生理生态的研究不能只局限于微观世界，从微藻的个体水平、种群、 群落水品及其生态位等宏观方面分析藻类的生态学效应是今后研究的重要内容 之一。这对于指导有害藻华的防治，渔业的生产，经济微藻的开发及生态环境的 监测与修复等都有十分重要的指导意义（详见 2.4）。2.3.3 监测与防治定鞭金藻藻华会对鱼类及其他水生动植物产生毒害作用34, 35, 65-67。此外， 有研究表明，P. parvum 会对内陆水源产生危害42。而在湖泊富营养化研究中， 定鞭金藻可以作为水体富营养化指示物种18。因此，开发定鞭金藻监测与防治新 技术对指导渔业生产、保护水体环境及人类健康有重要价值。常用的定鞭金藻监测技术包括 RT-PCR 技术58、AFLP 技术16, 59、分子探针技术62, 68、细胞计数法69等。不同种属定鞭金藻具有不同的特性，对颗石藻属定鞭金藻而言，卫星遥感技术在近些年得到了广泛的应用6, 70；但小定鞭金藻却 无法利用该技术实现追踪监测42。随着技术的进步，近些年对定鞭金藻引发的 HABs 也实现了数学模型拟合（预测），如数学模型（CZCS、Sea-WiFS、MODIS 等）6, 70-72数据流技术42等的应用。若预测不准确或不及时，对定鞭金藻的治理则显得非常重要。因为定鞭金藻 的生长与爆发与 N/P 浓度和比例、温度、pH、盐度等有关，通过调控发生赤潮 的水域理化条件是实现藻华控制的途径之一。同时，可利用化学杀藻剂对定鞭金 藻实行快速控制，如对 P. parvum 的治理常用的杀藻剂有氟啶草酮（fluridone）五氟磺草胺（penoxsulam）苄嘧磺隆（bensulfuron）丙炔氟草胺（flumioxzin）唑草酮（carfentrazone）和 top-ramazone 等73。2.4 生态（毒理）学在定鞭金藻研究中的应用（Application of Eco-(Toxico-)logy for Haptophytes Research）生态毒理学是运用数学、物理学、化学、生态学及毒理学等多种学科的理论 和方法，研究各种有毒有害物质对动物、植物、微生物等非人类生物及生态系统 的损害作用及其防护的科学74。对于海洋生物而言，海洋生态学的研究重点为种 群生态学、群落生态学和生态系统生态学三个层次，其内容包括种群/群落的组 成与结构、物种的时空变化与分布情况、种群/群落生态位及生态功能和种群/群 落与环境之间的效应关系75。定鞭金藻物种多样性很丰富，且有多个种属会形成有害藻华，研究有害藻华 产生的外界原因及有害藻华对外界产生的影响是非常有必要的。只有了解了外界 对定鞭金藻的生态毒理学效应及定鞭金藻对外界的生态毒理学效应，才能更好地 指导定鞭金藻有害藻华的预防与控制。2.4.1 外界（其他生物与环境）对定鞭金藻的生态学作用 定鞭金藻的生活周期因种而异，有时也会受环境因素的影响而改变，主要包括营养条件、捕食者及其他环境因素。一般来说，定鞭金藻的生长、衰亡有其固 有的周期，通常不会对外界环境造成不可恢复的损害。但人类活动极大地影响了 环境的稳定性，进而破坏了生物的生存环境，这是导致生态事故如有害藻华爆发 的主要原因。营养条件如 N/P 等物质的含量及比例是影响定鞭金藻有害藻华爆发的首因25, 29, 35, 36，N/P 是否充足会直接对定鞭金藻种群和群落组成与结构造成破坏。有报道显示，P. parvum 有害藻华爆发时，往往也表明其他种群的衰亡35-37。这个过程中，起关键作用的是 N/P 浓度，但最终会影响到其他种群的数量级结构，进 而产生毒理学效应（图 4）。其他条件如温度、光照、pH 等也会影响定鞭金藻的 种群结构，时空分布等，这也是定鞭金藻受外界环境影响而改变的一个重要方面（详见 2.2.2）。此外，环境中的捕食者数量及种类也会对定鞭金藻的种群数量及 生态学功能产生冲击，如捕食者对棕囊藻的影响76-79。其中，原生动物（protozoan） 和后生动物（metazoan）是主要的捕食者，且是在定鞭金藻生活周期中的单细胞 周期起作用76, 78。这些捕食者的存在也会对其他的微藻产生影响80, 81，因此这是 一个很复杂的过程76，最终会导致定鞭金藻生态功能的减弱甚至丧失。2.4.2 定鞭金藻对外界（其他生物与环境）的生态（毒理学）作用 定鞭金藻有害藻华的发生与外界环境密切相关，同时，有害藻华又会对外界环境产生效应，因此二者在研究中是一个密不可分的统一过程。当藻类大量繁殖 时，会消耗水中的溶解氧，从而抑制其他生物的正常生活；在不同生理生态条件 下，定鞭金藻甚至还会分泌藻毒素，毒害其他生物42。颗石藻属和棕囊藻属定鞭 金藻还会产生 DMSP 和 DMS 等污染空气的物质，颗石藻形成的钙质沉淀还会导 致海洋生产力结构与功能的改变6, 82。总之，生态（毒理）学是研究定鞭金藻的可靠方法，从整个生态系统着手考 虑问题，对指导有害藻华防治有重要作用。生态（毒理）学研究的辅助手段很多， 如形态观察，色谱、质谱、色质联用、核磁共振等代谢分析，蛋白质分析和基因 分析，文库克隆，分子杂交，数学建模等。尤其是数学模型的建立，对定鞭金藻 的防治起到了很好的预警作用（2.3.3）。2.5 生 物 信 息 学 在 定 鞭 金 藻 研 究 中 的 应 用 （ Application of Bioinformatics forHaptophytes Research） 生物信息学是研究生物信息的采集，处理，存储，传播，分析和解释等各方面的一门学科。它通过综合利用生物学，计算机科学和信息技术而揭示大量而复 杂的生物数据所赋有的生物学奥秘。传统的生物分类及多样性分析以物种的形态 结构和生理特征为主要依据，但生物世界千变万化，形态学差异有时不足以完全 表明其进化地位及聚类情况。新兴分子生物学技术的发展为生物多样性的分析提 供了基础，同时也为基于基因水平、蛋白质水平的其他研究提供了条件，从而在 微观、宏观，毒理学机制等方面都实现了很大的突破。将分子生物学技术研究成 果在计算机上进行分析，是生物信息学的首要目标，这便于不同领域、不同地域的研究人员快速地进行信息交流，以促进生物学研究的快速发展。通过对定鞭金藻的数据检索（NCBI 数据库）可知，当前世界上对定鞭金藻 开展的研究比较广泛，但仍然有很多未知领域亟待突破。如图 5-A 所示，定鞭金 藻基因组的完整测序只有 4 个报道，分别是：赫氏颗石藻（Emiliania huxleyi）、 球等鞭金藻（Isochrysis galbana）和路氏巴夫藻（Pavlova lutheri）（双击见链接）。 针对表达序列标签（Expressed Sequence Tags，ESTs）开展的研究有 172949 个记 录，然而与此相对应的蛋白只有 2037 个记录，其具体分布情况如图 5-BD；以 Prymnesium parvum 为例，对其 ESTs 开展的研究有 23443 条记录（具体的研究 情况以图 6 示之），却只报道了 26 个蛋白（包括重复）。此外，当前研发成功并 提交 NCBI 数据库的定鞭金藻探针只有 4 个，且都为南极棕囊藻（Phaeocystis antarctica）探针（GenBank 登录号分别为：Pr009611603Pr009611006）。以上情况说明，生物信息学对于研究定鞭金藻非常重要，由此可以把握国内 外对此开展研究的最新动态；同时也说明，当前国际上对定鞭金藻开展的研究还 不够深入，不够系统。因此，今后对定鞭金藻开展广泛、深入的研究还有非常广阔的前景。BAC D图 5 国内外对定鞭金藻开展的研究现状Fig.5 Research status of Haptophyta at home and abroad3 、 定 鞭 金 藻 的 研 究 意 义 及 展 望 （ Research Meanings and FutureResearch for Haptophytes）目前，对定鞭金藻的研究已较全面，从研究内容来说，主要分为物种多样性 分析、种群的分布特征与丰度、生态位及生态功能研究（如光合作用）、生长/ 反之特征、毒理学研究、定鞭金藻与环境之间的互效关系及检测手段、治理方法 等（如图 6 所示）。开展以上研究，主要有以下几点意义： 通过对定鞭金藻物种多样性、分布及丰度，以及爆发机制、毒理学机制 和环境效应等方面的研究，可以对环境的变化与治理起指示和指导作用； 通过，可以进一步对人类生产、生活起引导作用（更好地调节人类与 环境间的关系）； 通过定鞭金藻种群分类，生活史，分布特征及遗传物质多样性研究，可 以促进对不同地质时代的环境特征与物种演化的深入了解； 通过研究定鞭金藻的生理生化特性，对促进经济微藻的研发有积极作用。图 6 定鞭金藻的研究内容示意图（综合自文献32, 34, 37, 42, 55, 62, 65, 66, 68, 83-86）Fig.6 Schematic diagram of research contents for Haptophytes（Summarized from the references32,34,37,42,55,62,65-66,68,83-86）然而，对定鞭金藻的以上研究是一个综合的过程，研究过程不可能面面俱到，要做到全面、深入的了解有待新技术的诞生，也有待更多的人力、物力、财力的 投入。就当前技术水平而言，对定鞭金藻的研究可以从以下几点入手： 开展国际合作、交流，将不同时空的研究成果进行比对，以期实现交叉、 综合与新的突破； 筛选新种，对新种的生理生化特性，种群特性，生态功能等展开研究； 持续地监测同一环境条件下定鞭金藻的各种变化，同时进行横、纵向比 对，寻找异同点，为环境研究提供新思路； 对定鞭金藻不同种属（甚至纲、目）的遗传物质进行深入研究，更全面 地揭示其分子水平差异性；尤其是要突出研究 ESTs 及其相关蛋白，为定鞭金藻 有害藻华的防治提供新的理论基础； 综合开发新的监测技术（如探针、示踪技术等）； 进一步研究定鞭金藻的生态（毒理）学功能，为海洋微型生物生态学研 究作出新的贡献； 开发海洋经济微藻（如路氏巴夫藻和球棕囊藻等）。第二部分：读博工作安排与预期目标由以上分析可知，目前国内外已广泛开展对定鞭金藻的各类研究。在种群分 类及物种多样性分析方面，定鞭金藻纲的颗石藻目和棕囊藻目等到了较完整的认 识；对于定鞭金藻纲的定鞭金藻目和等鞭金藻目以及巴夫藻纲中的巴夫藻目的群 落结构研究不够深入。在我国，总体上还未对定鞭金藻门形成系统的认识，这不 仅体现在门类分析方面，在物种多样性、群落结构多样性、生态系统多样性等方 面也存在“零敲碎打”的现象，诸如巴夫藻（巴夫藻目）、颗石藻（颗石藻目） 和金色藻（定鞭金藻目）（图 2）的研究几无报道，而对棕囊藻目和等鞭金藻目 的代表性物种研究较多。另外，定鞭金藻门的多数藻种都会形成有害藻华，进而 会影响海域生态系统结构的稳定性及功能的发挥。定鞭金藻藻华在我国的研究， 仍然以棕囊藻为主，而国外已对定鞭金藻目中的小定鞭金藻（P. parvum）展开了 深入研究，尤其是美国、德国等发达国家对其分布特征、光合作用、生长/繁殖 特性、毒理学作用及与环境之间的互效关系等方面作了很详细的研究与报道；此 外，国外对颗石藻目中的赫氏颗石藻和钙板颗石藻的研究也提升到了环境效应方 面。再者，对于有害藻华的防治，也因以上研究进程的迟缓也得不到很好的发展。近年来，我国正大力投资于海洋生物学与环境学的研究，在“十二五”规划中，还专门成立了一项国家重点项目近海海洋综合调查与评价，也因此形成了一个新热潮中国区域海洋学研究。国家海洋局对此如此重视，是因为 我国三面临海，地理位置事宜微藻生活，四大海区东海、黄海、渤海和南海更是广泛分布着各种微藻，种群资源丰富，也包括定鞭金藻。由此可知，在 我国典型海域开展定鞭金藻的系统研究，完整地勾画出定鞭金藻在典型海区的群 落结构和生态学功能，具有十分重要的意义。然而，从整体而言（图 5），开展对定鞭金藻藻华爆发机制、毒理学机制及 探针技术等的研究仍然存在着广阔的空间。与其他门类微藻相比，国内外对定鞭 金藻的研究还比较零散，但业已证明，定鞭金藻中有诸多种属对渔业生产（棕囊 藻、小定鞭金藻等）、人类饮水健康（小定鞭金藻等）和经济微藻培养（路氏巴 夫藻、等鞭金藻）等有重要的研究价值。以上分析表明，开展我国典型海域的定鞭金藻群落机构分析及生态学功能研 究很有必要。一方面，它可以弥补我国海区对定鞭金藻门类研究的不足；另一方 面，它还可以提升我国在国际上研究微藻的水平，为全球环境研究作出应有的贡 献。基于此，本人拟在读博期间主要完成以下几项工作： 完成对定鞭金藻在我国典型海区的生物多样性分析（比如，可以将海区 限定在台湾海峡及南海），在此基础上，争取开发（或改进）出若干种适于分析 生物多样性的新技术。 分析定鞭金藻在不同时空的群落演替关系，及其与海洋微型浮游动物的 捕食/被捕食关系。 分析定鞭金藻在海洋生产力（碳循环）中的贡献，探讨氮循环和磷循环 中定鞭金藻生长/繁殖特性及其对生态系统造成的影响（如对其他海生生物的毒 理学作用等），研发相关的探针技术，实现对生态系统的有效修复。可采取的方法学为：特征色素分析技术、PCR 技术（qPCR、PCR-DGGE、 RT-PCR 等）、流式图像技术、DGGE/TGGE 技术、AFLP 技术、SSU rRNA 建库、 FISH、高通量测序技术、环境基因组技术和环境蛋白质组技术、生物信息学分 析、毒理学分析、生态学分析、数学建模、遥感技术的应用等；简明技术路线：参考文献：1焦念志. 海洋微型生物生态学M. 北京: 科学出版社, 2006.2 焦念志, 汤凯, 张瑶, 张锐, 徐大鹏, 郑强. 海洋微型生物储碳过程与机制概论J. 微生 物学通报, 2013, 40(1):71-86.3孙松. 中国区域海洋学生物海洋学M. 北京: 海洋出版社, 2012.4Parke M, Manton I, Clarke B. 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