开口箭皂苷对人神经胶质瘤细胞作用及相关机制研究

精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 1 / 11 开口箭皂苷对人神经胶质瘤细胞作用及相关机制研究 作者：蔡晶，雷林生，朱正光，迟德彪 【摘要】 目的 探讨开口箭皂苷体外对人神经胶质瘤法开口箭皂苷作用于 。溶血实验观察开口箭皂苷对细胞膜的影响。提取 胞的 析条带。 术检测开口箭皂苷对 胞的 因表达的影响。利用激光共聚焦显微技术研究开口箭皂苷对 胞内游离钙浓度和 的影响。结果开口箭皂苷对 胞的为 g/不 能引起肉眼可见的溶血现象。开口箭皂苷诱发了肿瘤细胞的凋亡，并引起了 因表达量的下降，并可引起 胞内游离钙浓度和 结论 开口箭皂苷体外可以诱导 机制可能与上述实验结果有关。 【关键词】 开口箭皂苷； 胞； 凋亡； 机制 on of 251 of of 品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 2 / 11 to on of 251 50%g/251 of of of of 251 on 251 be 口箭 (百合科植物，其根茎具有清热利咽、活血止痛等功效 1 3。在前期研究中发现提取其中的皂苷部位对小鼠 瘤细胞具有生长抑制及诱导凋亡作用 1。现进一步探讨开口箭皂苷（ 外对人神经胶质瘤 报道如下。 1 材料与方法 药品与试剂 精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 3 / 11 本实验室自行提取。 养基， 生牛血清，杭州市四季青生物工程材料有限公司；学品供应公司；四苯基氮唑蓝 (二甲基亚砜 ( ， 光探针 装； 应体系，杰特伟公司； )18， 脂糖（ ,上海 物器材企业有限公司；溴化乙锭 (上海 *生物工程公司；引物为英骏公司合成。其余试剂均为分析纯。 动物、瘤株与培养器材 豚鼠 5 只，由南方医科大学实验动物中心提供。人神经胶质瘤 胞为本所保存。 体外抗肿瘤细 胞增殖实验采用 4检测细胞增殖程度。在 96孔板中分别加入不同浓度 8 h 后，每孔加入 mg/0 l ，继续培养 4h 后弃去培养液，每孔加入 150 l 荡 10 70 长检测，测定各孔的光密度值(抑制率 (%)=(1D 值 /对照孔平均 100% 。 细胞的 溶血指数测定根据文献记载 5，取豚鼠全血配制成精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 4 / 11 2%的血细胞悬液，以不同浓度的 理盐水 溶液和生理盐水等体积混合，混合均匀后置于室温下 24 h 后，肉眼和低倍镜下观察细胞溶血情况。 251 细胞 以 50 g/处理指数生长期 6 h，提取 琼脂糖凝胶电泳进行琼脂糖电泳片断化分析，在紫外灯下观察结果并拍照。 251 细胞 i 的影响 养皿内细胞培养 48 h， 洗后加入7 避光孵育 30 理组加入浓度为 50 g/ 液 察其动态变化。 251 细胞内 8 h，漂洗后加入 避光孵育 30 洗后加入 机检测，处理组加入浓度为 50 g/ 液 察其动态变化。 因表达的影响 以 50 g/分别处理指数生长期 胞12， 24， 36 h 后，提取总 行 应。分别取被检测基因 增产物上样于琼脂糖凝胶中电泳后，将凝胶转移至凝胶分析系统暗箱中，精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 5 / 11 在紫外线照射下测定 结果表示为：（被检测基因扩增产物荧光强度值 /相应 100% 。 统计学处理方法数据以 s 表示，采用软件，经方差齐性检验后对细胞内钙离子浓度变化和 变化行重复测量数据的方差分析， 因表达量变化和 因表达量变化行配对 t 检验，以 P定为差异有统计学意义。 2 结果 251细胞增殖的影响 实验结果提示 外对 胞的增殖有抑制作用，且随浓度的增加 明抑制作用相应提高。经计算，半效抑制浓度 g/其可信区间为 g/ 血细胞悬液与药物混合静置 24h 后，出现明显分层现象，上层透明无色，下层红色，肉眼观察下各浓度 药组均未见明显溶血现象。 251 细胞 胞经 理 48 h 后，诱导其 现片断化，在 琼脂糖凝胶电泳上呈现明显的 “条带。 精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 6 / 11 251 细胞 i 的影响以 进入细胞后， 胞浆水内脂酶水解，探针与 i 结合后产生绿色荧光，其强度随胞浆 描 60 s 后加入 50 g/可见荧光强度迅速减弱（图 1）。 251 细胞膜内 的影响 以 溶性的 60s 以 50g/激 胞，呈现荧光强度缓慢下降的趋势（图 2）。 因表达的影响 果如图 3 所示， 因表达量升高， 因表达量下降，可见 促进因的表达。 3 讨论 现知细胞死亡有两种形式：一种是人们所熟悉的坏 死（ 另一种是细胞凋亡（ 程序性细胞死亡（ 细胞凋亡的机制极为复杂，迄今尚未完全阐明。细胞死亡是指细胞生命活动的结束，它和细胞生长一样，是机体生长发育和进行各种生理活动所必需的重要因素，在机体内通过一定的调节机制使细胞增生与死亡达到动态平衡。当调节机制紊乱时，两者之一的异常，精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 7 / 11 均可引起机体疾病。凋亡细胞在核酸酶的作用下，其 解成寡核苷酸片段，在琼脂糖凝胶电泳中呈现阶梯状条带图谱，这些条带由不同倍数的 180 200 个碱基对 的核普酸片段组成。在多数情况下，细胞凋亡为自然发生，但也可由一些生理性或毒性因子诱发。由于细胞凋亡是通过细胞内特殊的基因程序而发生，故又称程序性细胞死亡。细胞凋亡是机体的一种基本生理机制，并贯穿于机体的整个生命活动过程，包括胚胎的发育、新旧细胞的交替、某些组织的正常退化细胞凋亡时经历了许多重要的生理生化事件，如影响相关基因的表达量变化、细胞内线粒体功能紊乱、 i、 2 ,基因是从滤泡性淋巴瘤相关的 t (14 ;18) 染色体易位的断裂点部位克隆出的一种原癌基因 6。随着对 2 基因的深入研究 ,人们发现 2 并没有促进细胞增殖的能力 ,但它却能阻止细胞的凋亡 ,同时还发现 2 不仅与淋巴瘤有关 ,而且在许多恶性肿瘤中亦有明显的异常表达。 一种凋亡抑制基因 ,可通过抑制诱导凋亡的信号而在肿瘤发生中起作用 ,它的过度表达可以防止由于去除生长因子而诱导的造血和神经细胞的凋亡 ,并且还防止或延长由辐射、糖皮质激素、精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 8 / 11 热休克和多种化疗药物所诱导的凋亡。 以通过改变胞内细胞器的钙流而抑制 凋亡 ,钙离子可以激活与细胞凋亡密切相关的内源性核酸内酶。 与 合形成杂二聚体 ,以此来抑制 促凋亡作用。 属于家族的成员 ,是细胞凋亡途径中一组重要的调节基因。 抑制细胞凋亡 ,为凋亡抑制相关基因 ;促进凋亡的作用 ,为凋亡促进相关基因。促凋亡蛋白x)，其分子大小为 21 192个氨基酸组成 ,与 氨基酸序列有 21 %同源性 ,同 存于线粒体。两者及其家 族其他成员共同构成了一个复杂的相互作用的网络 ,精细地调控着细胞凋亡。 激光扫描共聚焦显微镜（ 有优良的空间和时间分辨率，结合荧光探针的应用使我们能对活细胞的各种功能进行精确的动态分析，本实验利用 亚细胞水平、从细胞生物学角度观察了 P i 等的影响，以探讨 导细胞凋亡可能的细胞生物学机制。 胞内的钙稳态对保持细胞的正常功能有很重要的作用 ,胞内钙离子浓度 i 的升高或降低都能诱导细胞 凋亡 7， 8。本实验结果显示：加入 胞的 品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 9 / 11 正常细胞内与胞外 i 浓度相差达 104倍。加入 膜内向膜外逆浓度转移，说明激活了 ，至于是由于何原因引起，尚须进一步探讨。 胞内外 H+的流动参与细胞的各种生物学过程。关于细胞凋亡与化的研究很多，但结论尚存在分歧。罗健东等 9认为细胞内酸化是细胞凋亡的重要环节，单纯碱处理通过减少细胞内酸化程度而呈现抗细胞凋亡作用；而黄 行许等 10在地塞米松诱导巨噬细胞凋亡的实验过程中发现，加药后细胞中胞浆首先出现碱化，随后又出现胞浆酸化；但也有人报道，在钙离子载体诱导 而升高 11。本实验结果表明，加入 示 能引起 胞胞内环境的酸化。综合实验结果， 要是通过致凋亡作用来实现的。251 细胞的 i 和细胞内的 示 何者为 导细胞凋亡的启动因素或主要因素，何者为继发事件，各事件之间的联系如何，尚待进一步实验研究证实。 精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 10 / 11 【参考文献】 1朱正光，余传林，蔡晶，等 . 开口箭提取物的抗肿瘤作用研究 J 2006， 29（ 3）： 277. 2庞晓军，符春晖，阳 明，等 . 祛痰止咳合剂的抗炎与体外抗菌实验 J 2003,19(5):599. 3杨春艳，杨兴海，刘英，等 . 开口箭祛痰、抗炎及抑菌实验研究 J 2005， 73：103. 4庞建新，马仁强，刘兰梅，等 . 博落回总碱对肝癌细胞的毒性作用和体内抗肿瘤作用 J 2005， 25（ 3）： 325. 5郭承华，张恒云，刘丽娟 J 2000,3： 12. 6 ,C ,D ,et of 2 1984 ,236 :1295. 7 ,