柿EST—SSR标记在柿属植物中的通用性研究.docx

柿ESTSSR标记在柿属植物中的通用性研究 柿ESTSSR标记在柿属植物中的通用性研究 简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR）分子标记技术通常又称为微卫星标记（Microsatellites），它是指以16个核苷酸为单位多次串联重复的DNA序列。与其他分子标记技术相比，SSR标记具有多态性高、共显特性、易用聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）检测、重复性强、数量丰富和对基因组有很好的覆盖性等特点。根据SSR的来源可将其分为基因组SSR和表达序列标签（Expressed sequence tag，EST）-SSR。EST是来自随机选取的特定处理的cDNA克隆末端序列，能反映mRNA的信息，在功能基因组研究中具有重要意义。EST-SSR与基因组SSR标记相比，具有不同物种间通用性较好、开发方法简单及成本低廉等优点。而且EST-SSR标记来自于基因的编码序列，更容易获得基因表达的信息，所以现在已成为重要的农作物农艺性状定位、遗传作图、遗传多样性、比较基因组学研究的新型工具。目前，大麦（Hordeum vulgare L.）、小麦（Triticum aestivum L.）、油菜（Brassica campestris L.）、柑橘（Citrus reticulata Blanco）等许多农作物已从公共数据库中成功地开发出了大量的EST-SSR标记。 柿（Diospyros kaki Thunb.）是柿科（Ebenaceae）柿属（Diospyros L.）植物中作为果树栽培的代表种，其栽培历史已有二千余年。中国是柿属植物的分布中心和原产中心之一，拥有丰富的种质资源。目前，已利用多本文由收集整理种分子标记技术对柿属植物进行了遗传分析，如Du等在柿上开发了反转座子标记，Guo等利用简单序列重复区间扩增多态性（Inter-simple sequence repeat，ISSR）技术开发了SSR标记。我们也开发了EST-SSR和靶位区域扩增多态性（Target region amplified polymorphism，TRAP）标记8，9，并在柿品种间进行了遗传分析，但是这些标记对于柿属其他种植物是否能通用尚需进一步试验。本研究利用前期开发的11个EST-SSR标记对柿属15个种20份试材进行了标记通用性评价，旨在为柿及其近缘种种质鉴定及遗传多样性分析提供实用、高效的研究工具。 1 材料与方法 1.1 材料和模板DNA的提取 利用柿属15个种的20份材料（表1）进行标记通用性评价。采用CTAB法提取材料基因组DNA，参照程运江等的方法并作适当改动。试验所用引物序列基本信息见表2。 1.2 扩增反应体系 PCR反应体系20 μL，其中包括：1Buffer，20 ng DNA 模板，1.5 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L dNTPs，0.8 μmol/L 引物，1 U Taq酶。扩增反应是在德国Biometra TProfessional PCR仪上进行，扩增程序如下：94 预变性2 min；94 变性45 s，55 （不同引物退火温度不同）复性1 min，72 延伸75 s，35个循环；72 延伸5 min。试验所用引物序列的基本信息及各引物退火温度见表2。 1.3 凝胶电泳及银染 SSR扩增产物通过6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后进行银染11，12，用数码相机拍照保存电泳图谱。根据图谱分析各EST-SSR位点的扩增情况，包括是否扩增、各位点在不同种中所得到的等位基因数量，根据DNA分子量标准估算等位基因片段的大小。 1.4 遗传多样性分析 对11个柿EST-SSR位点在20份柿近缘种中的扩增结果DNA谱带进行数字化统计，有带的位置记为1，无带的位置记为0。将所有试验数据在Microsft Office Excel 2003软件里进行标准化处理，利用NTSYSpc 2.10e分析软件构建数据矩阵；在Simint程序下选择Dice系数计算20份柿近缘种间的遗传相似系数，采用非加权组平均法（UnwEighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）建立相应的系统树状树，通过聚类划分类群来完成聚类分析。 2 结果与分析 2.1 柿EST-SSR引物在柿近缘种中的扩增结果 11对柿EST-SSR引物在20份柿近缘种中的扩增结果分别见表3、图1。由表3可以看出，在所有的11对EST-SSR引物中，以引物1430、5845与5553的通用性最高，可在所有20份柿近缘种材料中得到扩增片段；而其他8对引物都在某些材料中没有扩增产物出现，如引物460在丽江君迁子1以外的其他近缘种中都得到了扩增产物；引物6665也有较高的通用性，除了在丽江君迁子1和丽江君迁子4中没有得到扩增产物外，在其他的近缘种中都得到了清晰的扩增条带。引物8125、4379和9004在3个近缘种中无扩增产物。引物1554、6615、8917在4个近缘种中无扩增产物，通用性稍低。 2.2 EST-SSR扩增图谱分析 对11个EST-SSR位点在20份柿属植物中的扩增图谱（图1）进行分析。结果表明，在扩增与否和各位点扩增的等位基因数量方面，不同种间存在着差异。从EST-SSR位点的扩增情况来看，丽江君迁子1除了引物1430、5845、8125和5553可得到目的扩增产物外，在其他7个位点中均无扩增产物，可扩增位点较少；乌材、丽江君迁子4和丽江君迁子6分别得到7、6、7个可扩增位点；青茶柿、象牙树、丽江君迁子3和苗山柿各自除一个位点外，其他10个位点均能有效扩增；其他12份近缘种材料在所供试的EST-SSR位点均有目的产物扩增出来。 从表3各EST-SSR位点所得到的等位基因数目来看，各近缘种所得到的等位基因数目差异较小。各个近缘种材料在8917、1430位点上扩增得到的等位基因数较多，其中，岭南柿在8917位点上得到等位基因数目最多，为8个。位点1554所表现的多态性较低，除黑皮柿和青茶柿分别扩增出2个和3个等位基因外，所检测的其他材料在该位点上表现为单态或无扩增。 2.3 UPGMA聚类分析 20份柿近缘种EST-SSR分析的UPGMA聚类分析结果见图2。从图2可见，由于试验材料是柿属中不同的种，除各类君迁子外，其他种间的相似系数都比较低。所有材料中，最大的Dice相似系数为0.909（丽江君迁子3和丽江君迁子5之间），最小的为0.059（乌材和岭南柿之间）。乌材与供试其他材料之间的相似系数均很小，说明乌材与之的亲缘关系都非常远，是否是个更古老的野生种，有待进一步确认。而各类君迁子之间的亲缘关系较近，聚在一起后与浙江柿相聚，说明浙江柿是与君迁子亲缘关系最近的一个近缘种。 3 小结与讨论 为检测在柿栽培种中开发的EST-SSR引物对其近缘种的通用性高低，我们利用11对EST-SSR引物，以20份柿近缘种为试材进行了测试。结果这11对引物均能扩增出产物，且多态性引物比例为100%，表明柿EST-SSR引物对其近缘种是可通用的，而且显示的多态性频率很高。EST-SSR标记引物是根据其侧翼序列设计的，因此侧翼序列的保守程度决定着EST-SSR引物在不同种间的通用性。试验中，不同EST-SSR引物的通用性不同，引物1430、5845与5553在所有20份柿近缘种材料中都能成功扩增，而引物1554、6615、8917在4个近缘种中无目的扩增产物，这很可能就是它们各自对应EST-SSR的侧翼序列的保守程度不同所造成的。 20份柿近缘种的UPGMA聚类分析结果表明，供试的EST-SSR标记在种间进行遗传分析是比较可靠的。比如各类君迁子属于同一个种，它们能够很好地聚在一起，并且与浙江柿亲缘关系较近，此结果与前人研究的一致。 与基因组SSR标记相比，由于EST-SSR来源于基因组编码序列，其保守程度更高，因此比基因组SSR具有更高的种间通用性2，14，15。目前，高通量测序技术可以