过氧化物酶的分离与测定.doc

廊 坊 师 范 学 院生物大分子的分离与纯化 题 目：过氧化物酶同工酶的分离及活性测定姓 名：赵翔宇指导教师：侯志敏系 别：生物专 业：生物技术年 级：2008级生物技术 完成日期 2010年12月22日过氧化物酶同工酶的分离及活性测定摘 要：以大豆、绿豆为原料，通过不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳将其中的过氧化物酶分离，并通过分光光度计测定其活力。 关键词：大豆、绿豆 过氧化物酶 聚丙烯酰胺凝胶 分光光度计 目录1 前言 41.1电泳41.2聚丙烯酰胺凝胶41.3过氧化物酶51.4研究目的及意义52 材料与方法 62.1 实验材料62.2 主要仪器设备62.3 试剂配方62.4 实验设计82.4.1实验实施步骤 82.4.1.1.过氧化物酶的粗提取 82.4.1.2聚丙烯酰胺凝胶的制备82.4.1.3聚丙烯酰胺凝胶电泳 92.4.2过氧化物酶活力的测定 93 结果分析104致谢 115参考文献 11 1 前言1.1电泳带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。 凡能影响溶液粘度的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变，都会对迁移率产生影响。因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。并选用一定pH的缓冲液。同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。迁移率与粒子的大小（r）有关，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。 另外，迁移率还受电渗现象的影响。所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。最后，要考虑选用离子强度适宜的溶液。一般低离子强度比较合适，因为此时导电性低，产生的热量较少。同时可使被分离的带电离子对电流贡献最大从而加快电泳速度。但也不能过低，它必须可以缓冲被分离样品中带电离子对凝胶pH的影响，且过低的离子强度易导致蛋白质凝聚。一般最适的离子强度在0.010.1mol/L之间。最常见的为0.05。 1.2聚丙烯酰胺凝胶这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。 Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。但在具有自由基团体系时，它们聚合，聚合后无毒。化学聚合的引发剂是过硫酸铵（NH4）2S2O3（Ammonium persulfate，简写为Ap），催化剂是N，N，N,N-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，简写为TEMED）。在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵（Ap）形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。冷却可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制。 聚丙烯酰胺的基本结构，为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起。链的纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性质。网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。每100ml凝胶溶液中含有的单体（Acr）和交联剂（Bis）总克数称为凝胶浓度，用T表示。凝胶溶液中，交联剂（Bis）占单体（Acr）和交联剂（Bis）总量的百分数称为交联度，用C表示。改变凝胶浓度以便适应各种样品的分离。一般常用7.5浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，而用2.4%的分离核酸。但根据蛋白质与核酸分子量不同，适用的浓度也不同。物 质 分 子 量 范 围 适用的凝胶浓度(%) 蛋 白 质 104 2030 11044104 1520 41041105 1015 11055105 510 5105 25 核 酸 104 1520 104105 510 1052106 22.6 聚丙烯酰胺凝胶结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺凝胶适合作区带电泳的支持介质。1.3过氧化物同工酶同工酶是指其催化的化学反应相同，而酶的结构、理化性质乃至免疫性质不同的一组酶。植物在发育过程中，所含同工酶的种类和比例都不相同，它们与植物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，因此作为基因表达的产物，测定同工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具，在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有重要的意义。 过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化，测定这种酶的活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带。过氧化物酶能催化过氧化氢使联苯胺氧化成蓝色或棕色产物，据此即可将该酶在凝胶中显色定位。以大豆、绿豆为材料，低速离心去除细胞碎片，得过氧化物酶同工酶粗品。以愈创木酚为过氧化物酶的底物，在过氧化物酶（peroxidade）的催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大吸收值，故可通过测定470nm处的吸光值的变化可以测定过氧化物酶的活性。1.4目的及意义1、了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 2、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程 3、学习过氧化物酶同工酶电泳过程及活性测定方法2 材料与方法21 实验材料大豆、绿豆Acr、Bis、Tris、Hcl、琼脂、蔗糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、Gly、甘油、0.5%溴酚蓝、过硫化铵、抗坏血酸、联苯胺、过氧化氢、愈创木酚、TEMED22主要仪器设备（1）垂直板电泳槽及附件（玻璃板、硅胶条、梳子、导线等）（2）稳压稳流直流电泳仪（3）离心机（5）普通分光光度计（6）微量注射器（10L）、移液枪（50L）（7）其他：玻璃棒、容量瓶、烧杯、胶头滴管、研钵、的培养皿、秒表、磁力搅拌器、（8）千分天平，普通天平23 试剂配方实验前配置：1、贮藏液1（分离胶）：30gAcr+0.8gBis 定溶至100ml容量瓶，转存至棕色瓶中4保存。2、贮藏液2（浓缩胶）：10gAcr+2.5gBis 定溶至100ml容量瓶，转存至棕色瓶中4保存。3、PH8.9 Tris-Hcl缓冲液：48ml 1mol/L Hcl+ Tris36.8g定溶至100ml容量瓶，转存至棕色瓶中4保存。4、PH6.7 Tris-Hcl缓冲液：48ml 1mol/L Hcl+ Tris5.98g定溶至100ml容量瓶，转存至棕色瓶中4保存。5、5%琼脂：1.5g琼脂+100ml PH8.9 Tris-Hcl缓冲液浸泡，使用前融化。6、40%蔗糖：40g蔗糖加水定溶到100ml。7、样品提取液：Tris 12.1g+1000ml水，用PH调至8.0，放入冰箱4保存。8、电极缓冲液：Tris 6g+Gly28.8g加水定溶1000ml，使用前稀释10倍。9、甘油溴酚蓝指示剂：0.5%溴酚蓝5ml+5ml甘油。10、试验染色液成分：抗坏血酸70.4mg，联苯胺溶液(2g联苯胺溶于18ml温热冰醋酸中，再加入蒸馏水72ml)20ml，0.6%（或1.2%）过氧化氢20ml，蒸馏水60ml。 11、20mol/LKH2PO4 100ml。12、100mmol/L pH6.0磷酸缓冲液100ml：0.2mol/L磷酸二氢钠87.7ml+0.2mol/L磷酸氢二钠12.3ml。13、反应混合液前体：100mmol/L pH6.0磷酸缓冲液50ml+愈创木酚28L，与磁力搅拌器搅拌。实验时配制1、10%Ap（过硫化铵）：Ap0.5g+水5ml2、10%TEMED：TEMED10ml加水定溶到100ml3、反应混合液：反应混合液前体，加入30%过氧化氢19L。2.4 实验设计 电泳分离测定过氧化物酶粗提取 分光光度计活性测定2.4.1实验实施步骤2.4.1.1.过氧化物酶的粗提取称取大豆、绿豆各5g。分别放入研钵内，加冷的pH 8.0提取液10 mL，于冰水浴中研成匀浆然后迅速过滤，将滤液洗进离心管在离心机上以4000r/min离心15min。2.4.1.2聚丙烯酰胺凝胶的制备1、制作分离胶（浓度10%） pH8.9 Tris-HCl溶液：1.6ml 分离胶PAG溶液：2.4ml 蒸馏水：3.2ml 10%TEMED：80l AP：80l 将上述溶液充分混匀，立即全部倒入安装好的制胶玻板中，为使分离胶界面平整，可在倒入分离胶后约5min后在其表面沿高板缓慢均匀加入0.5ml蒸馏水并将电泳槽轻轻敲击桌面。再静置40min左右，让分离胶凝聚完全。 2、制作浓缩胶（浓度2.4%） 浓缩胶配方（浓度2.4%）：pH6.7 Tris-HCl溶液：0.84 ml 浓缩胶PAG溶液：2.5ml 40%蔗糖溶液：2.5ml 10%TEMED：60l 10%AP：60l 将上述溶液充分混匀，在聚合完全的分离胶上，倒入浓缩胶，（注意在倒入浓缩胶前要去掉分离胶表层的水）同时插入梳子（9齿），直到溶液装满和梳子插平为止。再静置40min左右，浓缩胶聚合完全后为乳白色。 注意事项：A、在整个过程中要将制胶模具垂直方在桌面上，不容许倾斜。B、充分混匀的（分离胶或浓缩胶）溶液应尽快用移液枪延高板的一侧慢慢加入胶板中 C、胶制作完成后，松开卡板取下橡胶皮，然后再用卡板卡紧胶板。要注意低板在内侧。2.4.1.3聚丙烯酰胺凝胶电泳将电泳槽取出，加入稀释好的电极缓冲液，缓冲液要没过低板（约750ml）。小心取出梳子，两拇指和食指捏住梳子的柄，其余三指顶住制胶框两侧，匀速地拔出梳子。点样前,要对样品进行预处理，即把粗酶提取液与甘油溴酚蓝指示剂以4：1混合，用50l的微量点样器吸取样品20l，将点样器的针头小心插入到点样孔底部，慢慢注入样品，要注意防止漂样。接好电源线（前槽为负极）。打开电源开关，电压150伏。待指示染料下行到距胶板末端1cm处，即可停止电泳。把调节旋扭调至零，关闭电源，电泳约4h。电泳完成后，切断电源,取出缓冲液并低温保存，可重复使用2次。然后松开卡板，取出凝胶板，用解剖刀扁平部分插入玻板的一角（是分离胶的一角），轻轻撬去一块玻板，用刀切掉分离胶右下角以示点样顺序，轻轻撬起分离胶，使之滚入染色培养皿中。 用自来水溶液润洗两遍，再加入30-40ml的染色液，室温下放置520min，至显色完全。拍照。2.4.2过氧化物酶活力的测定取1cm比色杯两只，于一只加入反应混合液3ml，KH2PO41ml，作为校零对照，另一只加入反应混合液3ml，酶液1ml（可适当稀释），立即开启秒表计时，于分光光度计460nm波长测OD值，每隔30秒读数一次，以每分钟OD变化值表示酶活力大小，即以A470/minmg蛋白质（或鲜重g）表示。3 结果分析左数第一二列为绿豆，三四列为大豆（实际大豆要更清楚一些，可能是染色液的问题，染出来是白色）大豆稀释60倍0.130 0.133 0.135 0.137 0.138 0.140绿豆稀释80倍0.294 0.296 0.299 0.302 0.304 0.305A460D0.01t酶活力（U）=A460D0.01tW酶的比活力（U/g）=式中：A470为反应时间内吸光值的变化；W为所称样品重（g）；t为反应时间（min）；D为稀释倍数，即提取的总酶液与反应系统内酶液的倍数。即：大豆的酶活力为24，酶活力比为4.8 绿豆的酶活力为32，酶活力比为6.4致谢本论文是在恩师侯志敏教授的悉心指导和严格要求下完成的。在此表示崇高的敬意和诚挚的感谢。本文不仅凝结着自己本科阶段学习的辛勤汗水，更凝聚着老师的谆谆教诲与殷切期望。从论文的选题、资料收集、实验的展开、论文的精心修改和最终定稿