课件：甾体激素类药物的分析(1).ppt

第十一章,甾体激素类药物的分析,基本结构：环戊烷骈多氢菲,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,环上双键的表示方法： 用“”表示 ,双键的位置写在的右上角。双键位置,4,1,4,5,5(10),环上取代基构型表示方法： 构型： 与母核连接的取代基,指向环平面的前面时,为构型.用实线表示“” 构型： 与母核连接的取代基,指向环平面的背面时,为构型.用虚线表示“”,按药理作用分类：,甾体激素,肾上腺皮质激素,性激素,雄性激素及蛋白同化激素,孕激素,雌激素,肾上腺皮质激素,氢化可的松,醋酸地塞米松,1.均有21个碳原子 2. A环4-3-酮基, UV、与羰基试剂反应 3.C17位上有a-醇酮基,具还原性,一、结构与性质,雄性激素及蛋白同化激素,睾酮,苯丙酸诺龙,1.雄性激素母核有19个碳原子,蛋白同化激素 C10位上一般无角甲基,母核有18个碳原子 2. A环4-3-酮基 3.C17位上有-羟基,或由它们形成的酯,17位加甲基作用更强,丙酸睾酮,酯化吸收减慢，作用时间长。,雄性激素及蛋白同化激素,孕激素,黄体酮,1.母核有21个碳原子 2. A环4-3-酮基 3.C17位上有甲酮基,醋酸甲地孕酮,孕激素,雌性激素,炔雌醇,1.母核有18个碳原子,C10无角甲基 2. A环为苯环, C3位上有酚羟基 3.C17位上有-羟基,雌二醇,雌激素,小结,二、鉴别试验 （一）与强酸的呈色反应,甾体激素类药物,呈色,H2SO4 H3PO4 HClO4 HCl,与硫酸呈色操作简便，依颜色与荧光可区别，反应灵敏，为各国药典所用。 如中国药典：氢化可的松，取本品2 mg，加硫酸2 ml溶解，放置5分钟，显棕黄至红，并显绿色荧光，将此溶液倾入10ml水中，即变黄色至红色，同时有少量絮状沉淀生成。,(二) 官能团的反应 1 C17 醇酮基还原性 A. 呈色反应,肾上腺皮质激素药物,呈色,四氮唑盐 OH,例如:中国药典中醋酸泼尼松的鉴别方法：本品1 mg，加乙醇2ml溶解，10 % 氢氧化钠试液2滴。氯化三苯四氮唑试液1ml，显红色。,肾上腺皮质激素药物,Cu2O橙红色,碱性 酒石酸铜,B. 沉淀反应,Ag黑色,氨制硝酸银,多伦试剂,斐林试剂,甾酮类激素药物,呈色,羰基试剂,2. C3酮基和C20酮基,常用的羰基试剂： 2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼,异烟腙（黄色）,睾酮,黄体酮,异烟双腙（黄色）,具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物,呈色,亚硝基铁氰化纳 间二硝基酚 芳香醛,3. 甲酮基,亚硝基铁氰化钠是黄体酮专属而灵敏的反应,黄体酮,蓝紫色,有机氟,F,有机破坏,有机氯,Cl,4. 有机卤素,茜素氟蓝 硝酸亚铈,硝酸硝酸银,AgCl,蓝紫色,茜素氟蓝,蓝紫色,F-,铈,药典规定地噻米松磷酸钠用氧瓶燃烧法处理，使有机结合的氟转变成无机的氟离子，在 pH4.3条件下与茜素氟蓝试液和硝酸亚铈试液反应生成蓝紫色的水溶性配位化合物。,脂肪链上的氯可水解脱落 中国药典中氯倍他索的鉴别方法：取本品少许，加乙醇1 ml,混合，加热，加硝酸2 ml，摇匀，加硝酸银数滴，即显白色沉淀。,氯在母核上（丙酸倍氯米松） 不易脱落，要用氧瓶燃烧法处理， 再按氯化物的鉴别试验进行鉴别。,雌激素类药物,红色偶 氮染料,重氮苯磺酸,5. 酚羟基,含炔基的甾体激素,白色的银盐沉淀,硝酸银,6. 炔基的沉淀反应,炔雌醇,白,(三) 制备衍生物测定m.p.,1.缩氨基脲的生成,2.酯的水解,丙酸睾酮,醇制的氢氧化钾,游离睾酮,熔点为150156,3.肟的生成,羰基与羟胺生成肟，测熔点,如炔诺孕酮与盐酸羟胺醋酸钠反应 生成炔诺孕酮肟，生成物的熔点为 ：195,4.酯的生成,酚羟基与苯甲酰氯生成酯，测熔点 例如：炔雌醇与苯甲酰氯反应，生成物苯甲酸酯的熔点为：201,不少药物是C17或C21上羟基的酯类。药物中酯结构的鉴别，一般先行水解，产生相应的羧酸，再根据羧酸的性质来鉴别。,（四）水解产物的反应,香,特臭,特臭,-3-酮 约240nm,苯环 约280nm,（五） UV法 规定最大吸收波长 最大吸收波长处的吸收度 某两个吸收波长处吸收度的比值,33003000cm-1,30002700cm-1,19001650cm-1,16501450cm-1,1000650cm-1,（六） IR法,37503300cm-1,（七） TLC法 主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别,方法：对照品法 要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。,（八） HPLC法 主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别（如：醋酸氟轻松软膏） 方法：对照品法 要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致。,三、 特殊杂质检查 （一）其他甾体 1. 定义 与标示药物结构不同的甾体化合物都称为“其他甾体”,2. 来源 原料、中间体、异构体、降解产物 3. 特点 （1）可能存在多个甾体杂质 （2）结构类似 4. 方法（具有一定分离能力） TLC法（高低浓度对比法）,判定方法： 规定杂质斑点数目 规定杂质斑点颜色,氢化可的松 检查 其他甾体,取本品加氯仿-甲醇（9 ：1）制成3.0mg/ml的溶液作为供试液，精密量取适量，加氯仿-甲醇（9 ：1）稀释成0.06mg/ml的溶液作为对照液；照薄层色谱法，各取5l，分别点于同一硅胶G板上，以氯仿-甲醇（97 : 3）为展开剂，展开后晾干，在105干燥10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑盐试,液，立即检视，供试品溶液如显杂质斑点，不得多于2个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。,1,2,（2）HPLC法（主成分自身对照法）,判定方法： 规定杂质峰数目 规定杂质峰面积,取本品适量，精密称定，以甲醇为溶剂，配制成每1ml含1mg的溶液（1）与每1ml含0.02mg的溶液（2），用含量测定项下的方法和溶液，取5l注入液相色谱仪，调整仪器灵敏度，使主成分峰高度达记录仪的满量程。再分别取溶液（1）,黄体酮检查其他甾体,和溶液（2）各10l，进样。记录至主成分峰保留时间的1.5倍。溶液（1）显示的杂质峰数不得超过1个，其面积不得大于溶液（2）主峰面积的3/4。,供试溶液：溶液（1）1mg/ml,对照溶液：溶液（2）0.02mg/ml,(二)硒 来源 合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢,原理,剧毒,（三）有机溶剂残留量的检查,甲醇 第二类溶剂 0.3%,GC法,丙酮 第三类溶剂 0.5%,地塞米松磷酸钠,检查 甲醇和丙酮,内标法,（四）游离磷酸盐,地塞米松磷酸钠 氢化可的松磷酸钠 倍他米松磷酸钠 氢化泼尼松磷酸钠,对照品法,检查 游离磷酸,地塞米松磷酸钠,精密称取本品20mg，置25ml量瓶 中，加水15ml溶解，精密加钼酸铵硫 酸试液2.5ml与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶 液1ml，加水至刻度，摇匀，在20放 置3050分钟，照分光光度法，在740 nm处测定吸收度，与对照液4.0ml同法 处理的吸收度比较，不得更大。,（对照液 0.035mg/mlKH2PO4）,供试品中游离磷酸盐按磷酸计算的限量：,第四节 、含量测定,根据甾体激素药物的官能团和整个分子的特征，可以采用比色法、紫外分光光度法、荧光法、气相色谱法和液相色谱法测定其含量,甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰 （一）HPLC法 USP、BP、JP均采用 RPHPLC（大多内标法） 特点 ：用样量少，灵敏度高，分离效果好，测定速度快。,二 UV法,-3-酮 240nm（）,肾上腺皮质激素 雄性激素和蛋白同化激素 孕激素,苯环 280nm（）,雌激素,三 比色法 （一）异烟肼比色法 1 原理 ：C3酮基及某些其他位置上的酮基能在酸性条件下与羰基试剂异烟肼缩合，形成黄色的异烟棕，在一定波长处具有最大吸收,HCl,（缩合）,C3酮基,异烟肼,异烟棕（黄色）,异烟腙（黄色）,2. 方法 对照品法,暗45,醋酸地塞米松软膏 含量测定 对照液：精密称取醋酸地塞米松对照品 25mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇适 量使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量 取5ml，用无水乙醇稀释至50ml，摇匀。 供试液：精密称取本品适量（约相当于 醋酸地塞米松2.5mg），置烧杯中，加无 水乙醇约25ml，置水浴中加热，搅拌，使醋酸地塞米松溶解，再置冰浴中冷却，,滤过，滤液置100ml量瓶中，同法提取三次，滤液并入量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。 测定法：精密量取上述溶液各10ml，分别置具塞试管中，置水浴中蒸去乙醇，残渣中加氯仿10ml，振摇，使残渣溶解，各精密加0.1%异烟肼甲醇溶液（取异烟肼0.5g，加盐酸0.63ml，加甲醇使溶解成500ml）10ml，摇匀，置55暗处保温45分钟，取出，放冷，用氯仿稀释至25ml。摇匀，在415nm的波长处分别测定吸收度，计算即得。,3.讨论 （1）溶剂的选择,异烟肼盐酸盐甲醇、乙醇,无水甲醇 无水乙醇,酸、异烟肼的量,(2),盐酸 : 异烟肼 = 2 : 1 A最大 盐酸的浓度为0.0074mol/L 异烟肼的浓度为0.00365mol/L 也可以使用0.0037mol/L的硫酸 若使用醋酸，则将其浓度增大， 约为4.4mol/L,样品 : 异烟肼 = 1 : 8 ,（3）水分、 温度、O2与光线的影响,含水量腙水解A%,温度升高，反应速度加快 不挥发溶剂、不吸收水分时 O2与光线对反应无影响,（4）关于反应的专属性 反应速度,C3= O C17= O 、 C20= O C11= O 不反应,对C3酮基最敏感。,1 原理 肾上腺皮质激素类药物C17 -醇酮基，具强还原性，在强碱性溶液中能将四氮唑盐还原成有色的甲瓒。生成的颜色随所用的试剂和条件的不同而不同,（二）四氮唑比色法,2.四氮唑盐的种类,氯化三苯四氮唑 （TTC）也称红四氮唑 蓝四氮唑（BT）,红四氮唑,三苯甲瓒深红,蓝四氮唑（BT）,双甲瓒（暗蓝）,供试液：精密称取本品4g（约相当于醋酸泼尼松龙20mg），置烧杯中，加无水乙醇约30ml，置水浴上加热，充分搅拌，使醋酸泼尼松龙溶解，再置冰浴中冷却，滤过，滤液置100ml量瓶中，同法提取三次，滤液并入量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。,醋酸泼尼松龙软膏含量测定 对照液：精密称取醋酸泼尼松龙对照品20mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。,3. 方法 对照品法,测定法：精密量取上述溶液各1ml，分 别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙 醇9ml与氯化三苯四氮唑试液2ml，摇匀，再各精密加氢氧化四甲基铵试液1ml，摇匀，在25暗处放置4050分钟，照分光光度法，在485nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得。 操作应避光。,4. 讨论,（1） 基团对反应速度的影响,a.C11= O C11OH,如：可的松氢化可的松 b.C21OH C21-酯,C.简单酯 复杂酯 如：醋酸酯琥珀酸酯 越复杂空间位阻越大,d. C16有取代基，使反应抑制， 需加入冰醋酸，才可以进行测定,（2） 溶剂、水分的影响,含水量5%,含水10%A10% 含水30%几无反应, 无水乙醇,（具有还原性）,（3）碱的种类及加入顺序,反应应在强碱性（pH13.75） 条件下进行 以氢氧化四甲基铵的效果最佳,加入顺序：,醇酮基不稳定，碱化分解,（4）试剂质量,RT 无色 空白值低 质量好坏影响不大 BT 淡黄色 空白值高 质量好坏影响较大 要求：a.BT的乙醇溶液极淡黄色，与乙醇比较 A=0.030.06 b.用标准氢化可的松校正摩尔吸光系数为：22000 c.临用新配,（5） O2与光线的影响,反应过程 反应产物,怕光,避光、暗处、快速,O2影响颜色强度和稳定性,隔绝空气、 快速充N2,（6） 温度与时间,t甲瓒分解%,1. 原理 雌激素与硫酸乙醇反应呈色,（三）Kober反应比色法,反应条件,双变色，测定结果重现性不好 杂质干扰（赋型剂、稳定剂有干扰）,存在的问题,A环是芳环，在C2或C3有含氧取代 D环的C17有含氧取代（OH,-C=O） C13必须有角甲基,解决方法,用该法测定雌激素类药物制剂的含量时比色测定前采用分离提取 严格控制反应条件 消除背景干扰,铁酚试剂比色法,铁酚试剂替代硫酸乙醇 Fe 3+的作用： 促进黄色的呈色速度和强度 促进黄色变成红色 加强红色的稳定性 苯酚的作用： 消除反应过程中产生的荧光 加速红色的生成,参 考 习 题,甾体激素类药物的结构中能和 四氮唑盐发生显色反应的基团 A. 酚羟基 B. 活泼次甲基 C. 甲酮基 D. C17 -醇酮基 E. 酮基,用异烟肼比色法测定甾体激素药物含量时，其溶液的环境是 A强酸性 B中性 C强碱性 D弱碱性 E以上都不对,可用于氢化可的松鉴别的试剂有 A氨制硝酸银 B异烟肼 C红四氮唑 D硫酸 E重氮苯磺酸,可用于甾体激体类药物的测定方法有 A高效液相色谱法 B四氮唑盐法 C紫外分光光度法 D异烟肼比色法 EKober反应比色法,能与亚硝基铁氰化钠反应生成兰 紫色的药物是 A雌二醇 B黄体酮 C醋酸可的松 D苯丙酸诺龙 E以上都不对,各国药典对甾体激素类药物常用HPLC或GC法测定其含量，主要原因是 A. 它们没有特征紫外吸收，不能用 紫外分光光度法 B. 不能用滴定分析法进行测定 C. 由于“其它甾体”的存在，色谱法 可消除它们的干扰 D. 色谱法比较简单，精密度好 E. 色谱法准确度优于滴定分析法,异烟肼比色法测定甾体激素类药物时，药物的呈色基团是 A. 酮基 B. 酚羟基 C. 活泼次甲基 D. 炔基 E. 甾体母核,四氮唑比色法可用于下列哪个药物的含量测定 A. 可的松 B. 睾丸素 C. 雌二醇 D. 炔雌醇 E. 黄体酮,可适用的药物： A. 可的松 B. 雌二醇 C. 两者均可 D. 两者均不可 亚硝酸钠滴定法 高效液相色谱法 能与羰基试剂缩合 可用铁酚试剂比色法测定 可用四氮唑比色法测定,D,C,A,B,A,Kober反应是 A. 雌性激素与硫酸乙醇共热呈色