课件：质粒的提取和鉴定,DNA酶切.ppt

碱变性法小量提取质粒， DNA的限制性酶切,厦门大学医学院 分子生物学实验教学组,实验目的,掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 掌握质粒酶切鉴定原理, 学会根据目的基因和实验目的选择合适载体与限制性内切酶，设计构建体外重组分子。,质粒(plasmid),是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）和细菌细胞中染色体以外的DNA分子，在基因工程中质粒常被用做基因的载体。,是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）和细菌细胞中染色体以外的DNA分子，在基因工程中质粒常被用做基因的载体。,分离质粒DNA的 基本步骤,培养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离和纯化质粒DNA,质粒DNA的提取方法,碱变性法（碱裂解法）； 煮沸裂解法； 羟基磷灰石柱层析法； 质粒DNA释放法； 酸酚法等。,碱变性（裂解）法基本原理：,在碱性条件下（pH 12.6），染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH 4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。,原理示意图,质粒DNA电泳,电场中DNA分子的迁移速度取决于： DNA分子本身的大小 DNA分子的空间构型 超螺旋构型（ccDNA) 线形DNA(lDNA) 开链环状DNA(ocDNA) 复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起),溴化乙锭（EB）是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光,Attention, please!,EB是强诱变剂，配制和使用EB染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品，必须进行清洗或弃去！,质粒提取实验材料与试剂,实验材料： 过夜培养大肠杆菌DH-5a 实验试剂： LB培养基 0.1M NaCL、10mM Tris.CL（pH8.0）、1mM EDTA、Amp 50mg/ml、酚、氯仿、Rnase、琼脂糖 TE：10mM Tris.CL （pH8.0），1mM EDTA 溶菌酶 10mg/ml（用10mM Tris.CL，pH8.0，新鲜配制）,溶液溶菌液：50mM 葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM EDTA，2mg/ml 溶菌酶。 溶液 NaOH-SDS液：0.2N NaOH，1% SDS。 溶液 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液：5M KAC 10ml，冰醋酸 11.5ml，水 28.5ml。,步骤一 细菌培养与质粒扩增,1. 挑单克隆E.coli菌株接种到4ml LB培养液中（含Amp 50g/ml），37 225rpm振荡培养过夜。 （活化菌种） 2.从中取2ml种子菌液于含Amp培养基500ml中，37振荡培养3-4小时（OD6001.0） 3.取4ml培养液至Eppendorf管中，12000 rpm，4 离心30秒，弃上清，用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。,步骤二 质粒提取,取4ml培养物至Eppendorf管中，12000rpm，4，离心30sec，弃上清。 用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清取沉淀，使细胞沉淀尽可能干燥。 将细菌沉淀悬浮于100l预冷的溶液I中，加入10 l溶菌酶（10mg/ml），剧烈振荡均匀，冰上放置1分钟。 加200L溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf管，快速轻柔颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上3分钟 。,5.加入150L溶液III （冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。 6.12000rpm， 4 离心5min，将上清夜转至另一1.5ml Eppendorf管中。 7.加入等体积酚/氯仿（1：1），振荡混匀，室温放置5-10min，12000 rpm，4 下离心2分钟，倒去上清，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加入2倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，12000 rpm 4 离心5分钟。,9. 倒去上清，加入1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗DNA沉淀。12000 rpm，4 离心2分钟。 10弃上清并尽量吸除液体，打开管盖，室温放置5min。室温放置15min干燥。 1150l TE缓冲液(含无DNase的RNase 20 g/ml)，使DNA完全溶解（-20保存） 12取样品10 l加2ul 6 Loading buffer于1 %琼脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。,M pBSK pGFP,菌体老化 碱裂解不充分 菌体中无质粒 溶液使用不当,请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养 可减少菌体用量或增加溶液的用量 不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。 溶液在温度较低时可能出现浑浊，置于37保温片刻直至溶解为清亮的溶液。,问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？,原因,对 策,质粒DNA提取常见问题,混有蛋白 混有RNA 混有基因组DNA,不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 加入RNaseA室温放置一段时间 加入溶液II 和III后防止剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。,质粒DNA提取常见问题,问题二：质粒纯度不高，如何解决？,原因,对 策,提高质粒产量的注意事项,加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮； 加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5-10次) ，使蛋白质和核酸变性； 加溶液III后PH要达到中性(轻柔振荡5-10次 )，使质粒DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。 加入乙醇沉淀DNA时，要把离心管盖上盖子倒翻摇动几次，注意观察水相和乙醇之间没有分层现象之后，才可以放到冰箱中去沉淀DNA。,DNA的限制性酶切,Plasmid (质粒),Plasmid map Polylinker Sequence map Restriction enzyme map,Polylinker (多克隆位点）,Sequence Map,GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTT AAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACA ACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCG ATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTC ATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCG CCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCC ATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCC AAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTA TGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGC AGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAA TGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACG CAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCA CTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTT AAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCG GCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCA TCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAAT AAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGA CAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAG GCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGG GTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTT CCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTC CGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCAT CGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCA AACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCC TATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTT AGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCA ACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAG CAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCC CCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAG TAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCG GATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCC GGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCC,Restriction map,限制性核酸内切酶: 一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。 限制性切酶以内切的方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5端带磷酸基团，3端为-OH。,限制性核酸内切酶分类,识别切割特性 催化条件 是否具有修饰酶活性 至2005年1月，共发现限制酶3681种 型59种 型3612种 型10种 商业化的限制酶有 588 种，在 型限制酶中共有 221 种特异性。,EcoRI,型限制与修饰系统,占90%以上，即通常指的DNA限制性内切酶，它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段； 型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为4-6个碱基对的反转重复顺序； 型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口：5端突出，3端突出和平末端。,酶切反应中应注意以下几个问题：,1. 内切酶：不应混有其他杂蛋白特别是其他内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点和形成的粘性末端； 2. 内切酶的用量：根据内切酶的单位和DNA用量而定。使用中一般以1 g DNA用2-3U酶进行酶切为宜； 3. 内切酶体积：不能超过反应体系的10%，因内切酶中含50%甘油，体系中甘油超过5%会抑制内切酶的活力； 4. 操作条件：反应体系配置应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。,5. DNA：作为内切酶的底物，DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS和酒精等，这些因素的存在均在不同程度影响限制性内切酶的活性。,反应缓冲液：,1. 反应缓冲液: 主要由Tris-HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+ 为内切酶的辅基； A. Tris-HCl维持反应体系的PH值在7.27.6之间； B. NaCl浓度： 低盐(10mM NaCl) 中盐(50mM NaCl) 高盐(100mM NaCl),2. 酶解的温度：大多数限制酶的反应时间为37，如EcoR、Hind、BamH、Pst等，也有如Bcl需在50下进行反应。 3. 酶解反应时间：根据酶的单位与DNA用量之比来定，原则是酶/DNA23，12小时即可充分酶解。 4. 酶单位定义：在每种内切酶理想的反应条件下 ， 0.05mL反应混合物中, 1小时消化1g底物DNA的酶量为1单位(1U)。,双酶切实验材料,限制性内切酶：EcoR、Xba和Hind DNA：DNA和质粒pCDNA-p38 10buffer H （37, PH7.5） 90mM TrisCl 50mM NaCl 10M MgCl2 10buffer M（37, PH7.5） 6mM TrisCl 100mM NaCl 6M MgCl2 1mM DTT 10BSA： 1mg/ml 无菌水,方法和步骤,1. 反应体系配制： 质粒pCDNA3p38 10 l（1g） 10buffer M 2 l 10BSA 2 l EcoR 1 l Xba 1 l H2O 4 l 总体积 20 l,2. 将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心收集液体。 3. Eppendorf管于37水浴中反应1.5小时。 4. 反应结束后70灭活15min或者加入EDTA至终浓度10mM终止反应。 5. 取20l反应液加入6loading buffer混匀于1.2琼脂糖凝胶胶上150伏电泳，约30min。 加入5l未酶切对照。 6. 凝胶成像体系观察记录结果。 7.当DNA条带充分分开后，在紫外灯下细心切取所要的DNA条带。尽量去除多余的凝胶。紫外灯照射DNA片段不要超过30秒。注意保护眼睛免受紫外线伤害。,实验结果,双链DNA样品浓度(g/l) = OD260核酸稀释倍数50/1000。 RNA样品浓度(g/l) = OD260核酸稀释倍数40/1000。 （在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml；单链DNA为37 g/ml；RNA为40 g /ml。）,凝胶成像结果,1.2% Agarose Gel,1 2 3 4,1.1000bp DN