分子生物学实验报告.docx

分子生物学实验报告实验二 从cDNA文库中靶片断扩增（4h）一、实验目的 1.掌握聚合酶链式反应的原理。 2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。二、实验原理：PCR技术，即聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)。经典的PCR过程包括：变性（denaturing step）、退火（annealing step）和延伸（extension step）三个步骤。变性过程，即在高温9498下，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之形成两条单链ssDNA。随后，模板DNA与引物的退火(复性)过程中，温度降至55左右，特异序列的引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；之后，引物的延伸过程，DNA模板-引物结合物在耐热的DNA聚合酶（如：Taq酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR反应的成分和作用：总体积：一般为25l100l （一）无Mg2+buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。（二）Mg2+:终浓度为1.52.0mmol/L，其对应dNTP为200mol/L，注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1mmol/L时会抑制Taq酶的活性。Mg2+能影响反应的特异性和产率。 （三）BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。（四）底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.07.5，一般存储浓度为10mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20200mol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。（五）Taq酶：能耐95高温而不失活，其最适pH值为8.38.5，最适温度为7580，一般用72。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按53方向逐个将dNTP分子连接到引物的3端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无35的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2+浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.55个单位/100l。（六）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。（七）引物：引物浓度一般为0.10.5mol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般1530个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发 链的延伸）。 引物G+C约占4555%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。PCR反应条件的选择（影响因素）：1、温度参数：（1）变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94（或95）变性310min，接着94变性3060s。（2）退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5。引物长度在1525bp可通过公Tm=(G+C)4+(A+T)2计算退火温度，一般退火温度在4060之间，时间为3045s。如果(G+C)低于50%，退火温度应低于55。较高的退火温度可提高反应的特异性。3、延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在7075。延伸时间要根据 DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min是够用的。循环数：PCR的循环数主要由模板DNA的量决定，一般2030次循环数较合适，过多的循环数会增加非特异扩增产物，具体要多少循环数可通过预试验确定。PCR产物积累规律：反应初期产物以2n呈指数形式增加，至一定的循环数后，引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡，产物进入一个缓慢增长时期（“停滞效应”），即“平台期”。到达平台期所需PCR循环数与模板量、PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关。PCR常见问题一.没有扩增产物1.循环温度：变性温度、退火温度2.引物设计3.DNA聚合酶活性4.抑制性成份(蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合酶活性的成份)5、DNA样品二.非特异产物及电泳呈涂布状1.Mg2+浓度2.调整引物、模板、聚合酶的用量3.适当减少循环数4.适当提高退火温度，缩短退火或延伸时间三.引物二聚体的形成1.检查引物的序列2.提高退火温度3.调整引物与模板浓度4.增加引物长度四.假阳性结果的预防实验原理聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术是美国Cetus公司人类遗传研究所的科学家K.B.Mullis于1983年发明的一种体外扩增特定基因或DNA序列的方法。PCR具有很高的特异性、灵敏度，在分子生物学、基因工程研究、某些疾病的诊断以及临床标本中病原体检测等方面具有极为重要的应用价值。双链DNA分子在接近沸点的温度下解链，形成两条单链DNA分子（变性），与待扩增片段两端互补的寡核苷酸（引物）分别与两条单链DNA分子两侧的序列特异性结合（退火、复性），在适宜的条件下，DNA聚合聚利用反应混合物中的4种脱氧核苷酸（dNTP），在引物的引导下，按5-3的方向合成互补链，即引物的延伸。这种热变性、复性、延伸的过程就是一个PCR循环。随着循环的进行，前一个循环的产物又可以作为下一个循环的模板，使产物的数量按2n方式增长。从理论上讲，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。除上述典型的PCR反应外，人们还根据各种用途设计了各种不同类型的特殊PCR。如利用反转录PCR（RT-PCR），即利用组织mRNA进行反转录后合成第一链cDNA，以此为模板经PCR合成特定目的基因；反向PCR，常规PCR允许扩增两条引物之间的DNA片段，而反向PCR则可以对靶DNA区域之外的两侧未知的DNA序列进行扩增；不对称PCR使用的引物浓度不同，两种引物浓度相差100倍，在最初的20个循环中主要产物是双链DNA，当低浓度引物被消耗后，高浓度引物引导的PCR反应产生大量单链DNA分子，可用于DNA的序列测定；在PCR-ELISA中，将引物用地高辛、生物素或放射性同位素标记，再进行PCR扩增，用ELISA方法检测反应产物的灵敏度可提高百倍以上；采用定量PCR，即用荧光物质标记引物，根据反应进程中荧光变化情况，可以确定组织中mRNA含量，从而了解不同生长发育时期组织特定基因的表达水平等。影响PCR反应结果的因素较多，主要包括（1）模板的质量：在制备模板DNA时通常需要使用蛋白变性剂及乙醇等有机溶剂，这些物质可直接影响PCR反应；另外当模板DNA分子量很高时，解链不易，可用限制酶消化以改善扩增效果；从理论上说，一个模板DNA分子即可获得扩增产物，模板浓度过高，PCR反应的特异性下降，实际操作中可按1ng、0.1ng、0.01ng递减的方式设置模板浓度对照。（2）引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55Tm=4(G+C)+2(A+T)。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。引物的3端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pmoL/L较好。（3）Mg2+浓度：PCR反应体系中Mg2+浓度对扩增结果影响较大，通常是1.5-4mmoL/L，必要时可调整Mg2+浓度。（4）dNTP浓度：1.25mmol/L，dNTP浓度过高，反应的特异性下降。（5）反应条件：PCR反应条件中最重要的是退火温度，退火温度低，引物容易结合到模板的靶DNA序列，但反应的特异性下降；反之，特异性增加，但扩增效果不佳。一些生物技术公司在合成引物时注明了Tm值，以此为依据，退火温度比Tm值低3-5比较适宜。当然，在实际操作时可设置梯度以确定最佳退火温度。实验目的了解聚合酶链反应（PCR）的基本原理及其影响因素，掌握PCR的基本操作过程。仪器PCR仪、台式离心机、电泳仪、电泳槽、紫外检测仪试剂1、引物：用去离子水配成10 mol /L。2、Taq聚合酶3、10PCR反应缓冲液（加镁离子）4、dNTPs：四种核苷酸混合物，浓度为10mM5、模板：含有R基因片段的重组cDNA的质粒6、1%琼脂糖凝胶7、50 TAE电泳缓冲液(1000 mL)Tris 242 g，Na2EDTA.2H2O 37.2 g， 溶于600 ml 去离子水中；加冰乙酸57.1 ml, 最后用去离子水定容至1000 mL。8、6 上样缓冲液0.25% 溴酚蓝；0.25%二甲苯睛蓝，30%甘油，溶于水中，4保存。【实验内容】1、引物设计 2、PCR 3、琼脂糖凝胶电泳4、PCR片断的验证实验步骤1、反应混合液的配制：在一个0.5mlPCR管中加入下列成分：正反两种引物F/R各 2l10PCR 缓冲液10ldNTPs2lDNA模板1lTaq酶0.5lddH2O补至20l补至50l充分混匀，离心片刻，使液体沉至管底。实际操作时，先根据所需进行的反应数，配制反应混合物（按上述配方，不含模板）。每组进行3 个反应，需配制76微升反应混合物，则按上述配方的4倍进行配制。然后分装于4个PCR管中，每管19微升。其中3管每管加入1微升模板，另一管加入1微升水，作为对照。2、PCR反应条件循环1：94，3分钟；循环2-31：94变性45s、52退火45s、72延伸1min；共30个循环；最后72延伸10分钟。3、反应结束后，取5微升反应产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析，其余置4保存备用。（1）用1 x TAE缓冲液配制琼脂糖凝胶：在电子天平上准确称取琼脂糖0.2g，倒入100 ml三角瓶，加入20 mL缓冲液。（2）微波炉上加热40S。（3）待冷却至60左右时，加入1L溴化乙啶，摇匀。（4）将凝胶倒入预先准备好的制胶板上，插入梳子，待冷却。（5）取5微升PCR产物在琼脂糖胶上电泳：80V，20min。（6）取出凝胶，在紫外灯下观察，记录观察结果。3、PCR产物的纯化（1）向PCR产物中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1，v/v），混匀；（2）14 000 r/m 离心5min；（3）取上清液，再加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1，v/v），混匀；（4）14 000 r/m离心15 min；（5）取上清液，加入1/10体积的3M NaAc (pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20放置2 h或过夜。（6）4，14 000 r/m离心15 min，弃上清液；（7）沉淀用70%乙醇洗涤1次；（8）14