临床生物化学检验技术笔记.doc

【一】【常用仪器简介】常用实验仪器的名称和功能介绍刻度吸管 量筒 取液器 普通试管 分光光度计 紫外分光光度计 平衡天平 离心机 电热恒温水温箱 电热恒温水浴锅 电泳仪 电热恒温振荡箱 PH仪 酶联免疫检测仪 漩涡混合器综合性仪器设备的名称和功能介绍生化半自动分析仪 尿液分析仪 PCR仪 凝胶成像分析系统 蛋白质测定仪荧光倒置显微镜T6紫外可见分光光度计【示教：刻度吸管的正确使用方法】拿法：右、左手的拇指和中指拿住刻度吸管离平口端约5.0cm处，食指轻轻放于吸管口。取量：将刻度吸管管尖插入液体面以下约1cm，利用洗耳球负压吸取液体至最高刻度以上，然后迅速用食指按紧吸量管管口，使液体不致从管内流出。调刻度：将已经充满液体的吸量管提出液面，用滤纸小片擦干吸量管外面的液体。然后持吸量管与地面保持垂直，放松食指控制液体缓慢地下降，刚好至最上一刻度，立即按紧吸量管管口。放液：使吸管尖端轻轻接触受器内壁，然后放松食指，让液体缓慢流入受器内（让液体缓慢地下降至所需刻度处）。【取液器的使用】取液器多为可调式，又可以分为分档调节和连续调节两类。原理：是利用排代原理，由活塞在活塞套内作定程运动，产生负压，吸入定量液体。特点：具有使用方便，性能可靠之优点。分型：可分为1ul、2ul、5ul、10ul、25ul、50ul、200ul、250ul、500ul、1000ul、5000ul等多型。使用方法： A、将吸液管套在取液器头上，轻轻转动，以保证密封。 B、使用前应先将取液器吸液和排液数次，以保证内外气压相一致。 C、垂直地握住取液器，将按钮按到第一停止点，并把吸液管尖浸入到液面下2-3mm，再均匀 缓慢地放松按钮，使之复位，等待1-2秒钟后从液体中取出，并避免碰撞任何物体。 D、将吸液管移至加样容器壁上，缓慢地把按钮按到第一停止处，等待1-2秒钟，再把按钮完全按下，排尽全部液体后，吸液管尖应沿容器壁向上滑动取出，再放松按钮，使之复位，即完成取液操作过程。 E、取液器的存放：取液器使用后如果将在较长一段时间不再使用，在放置前应将取液器的取量数调至最大，以防复进弹簧长期压缩而变形，使其功能尽失。【试管内液体的常用混匀法】旋转法：液体较多时常用次法。右手拿试管上端，利用手腕力量使试管作圆周运动。顺时针或逆时针方向转动都可以，但必须是一个方向。指弹法：左手持试管上端，使试管大致垂直于地面，再用右手食指轻轻弹动试管（即右手食指与试管壁成切线运动）使试管内液体呈漩涡状转动。液体较少时可采用此法。甩动法：右手握住试管上端，将试管倾斜来回甩动，使试管内液体呈漩涡状转动。此法只适用于少量液体的混匀。倒转法是一次性塑料试管的常用方法、将试管在离管口约2cm处进行180折叠，然后将试管倒转数次即可。漩涡混匀法 是使用一系列3ml容量以下的或EP管之类小试管，难于用以上4种方法进行液体混匀的情况。【二】【静脉采血】1、 采血部位 一般采用肘前静脉，肘前静脉不明显时，可采用手背静脉或踝部静脉。小儿可用颈部静脉采血。必要时可从股静脉、大隐静脉、锁骨下静脉、脐旁静脉、肘前动脉等处采血。但这些部位采血，必须在有经验者指导下进行，或由临床医生采集，以免发生意外。2、 采血及血清制备器材一般用2、5ml或10ml注射器，针头口径的大小可视具体情况而定，选用6或7号针头，用前必须严格高压灭菌；橡胶管压脉带、垫枕、75%乙醇、25g/L碘酊和无菌棉球（棉扦）等。试管、平衡天平、离心机、取液器。3、采血方法（肘静脉采血） 首先选择适宜静脉，在上臂扎上压脉带（离穿刺部位约5cm）。用25g/L碘酊，对穿刺部位皮肤进行由内向外的环形消毒。待碘酊干后，再用75%乙醇棉扦以同样方法擦去碘迹。嘱患者紧握拳头，使静脉显露。取无菌注射器，检查针头是否安牢，有无阻塞和漏气，将注射器活塞来回抽动数次，保持内外压力一致，将针头斜面和针筒刻度旋至同一向上面上。 左手拇指固定静脉穿刺部位的下端，右手持注射器，使针头斜面和针筒刻度向上，沿静脉正面将针头斜行（行针与体表成1530度夹角），快速穿过皮肤，刺入静脉腔中央。见回血后，将注射器成10度前行0.5cm后立即固定注射器，以免针头滑出血管。用左手缓缓抽动注射器针栓，至所需血量后解除止血带，放松拳头，用无菌棉签压住穿刺孔，拔出针头。 嘱咐献血者弯曲手臂压住棉签25分钟，直至穿刺孔血液凝固，防止皮下出血形成渗血包块。盖上针帽，取下针头，将血液沿试管壁缓慢注入试管内，置室温任其凝固(或置37孵箱或电热恒温水温箱)。【血清的制备】待血液凝固收缩后（或置37孵箱或电热恒温水温箱）析出淡黄色透明液体，即可分离血清（可用离心机3000n/分钟离心5分钟）。如果需要全血或血浆，则将血注入事先准备的抗凝管中，轻轻混匀，防止凝固，即为抗凝血。经适当离心沉淀后，淡黄色上清液即为血浆。 血清和血浆的主要区别是，血清中失去了纤维蛋白原及凝血因子。【5. 安全防护】 给已使用过的注射器针头盖上针帽时应特别小心，防止针头扎破手指。 针头刺破伤的处理：自来水直接冲洗；皂液清洗；注射抗破伤风液。 防血液污染：工作服、手套、眼护罩。若有沾染应及时清洗。【血清总胆固醇的测定Total-Cholesterol Assay of serum Kit 】【实验原理】 血清中的脂化胆固醇经胆固醇酯酶水解产生脂肪酸和游离胆固醇，与原有的游离胆固醇一同被胆固醇氧化酶氧化生成4-胆甾烯酮和过氧化氢，过氧化物酶使过氧化氢分解出氧的游离基，它将4-氨基安替比林和酚氧化为红色醌型化合物，在510nm波长测定吸光度值，计算其含量。【计算】胆固醇校准液浓度C = 5.0mmol/L C测 =参考值： 3.15.7 mmol/L临床意义：1、胆固醇升高：（1） 胆固醇（高胆固醇血症）和动脉粥样硬化的发生有密切关系，胆固醇升高容易引起动脉粥样硬化性心、脑血管疾病，如冠心病、心肌梗死，脑卒中等。作为评价动脉粥样硬化的危险因素，而最常用做动脉粥样硬化的预防、发病估计、治疗观察等的参考指标。 （2） 胆固醇升高见于各种（摄入）高脂蛋白血症、梗阻性黄疸（胆汁排出受阻）（肝内胆固醇合成亢进-游离胆固醇增加）、肾病综合征、甲状腺功能低下、慢性肾功能衰竭、糖尿病等时。此外，吸烟、饮酒、紧张、血液浓缩等也都可使血液胆固醇升高。妊娠末三个月时，可能明显升高，产后恢复原有水平。2、胆固醇降低：可见于各种脂蛋白缺陷状态、肝硬化（肝细胞受损）、重症肝炎、恶性肿瘤、营养吸收不良、巨细胞性贫血等。此外，女性月经期也可降低。方法学评价1、空白吸光度 A510nm0.12、线性范围 010.4mmol/L（R大于0.99）3、重复性 测量精密度4.0%；批间差5.0%4、准确性 在质控品的 。5、氧化酶法测定血清总胆固醇，特异性好、灵敏度高。注意事项：1、标准液防止污染，28密封保存2、工作试剂防止葡萄糖和甘油三酯的污染。3、比色应在30min内完成。【血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳】电泳技术 电泳技术主要用于物质性质的研究、种类的鉴定、分离纯化、纯度的分析等实验研究工作中，已成为生物化学、分子生物学、医学、药学、农业、食品、卫生、环保等学科不可缺少的重要的分离分析手段。一、电泳技术的原理 电泳是指在外加电场的作用下，带电的物质向其所带电荷相反的电极方向移动的现象。各种物质由于所带净电荷的种类和数目不同，因而在电场中的迁移方向和速度不同，从而可以对物质进行分离、分析和鉴定。 1带电粒子在电场中移动时，受到两种力的作用。第一种是电场产生的作用力F1，它能使带电粒子移动。F1的大小与粒子所带静电荷q及电场强度E成正比。第二种是移动的带电粒子与溶液介质之间产生的摩擦力F2，它可以阻止带电粒子的移动。F2的大小与带电粒子的摩擦系数f及运动速度v成正比。 F1 = qE F2 = fv 2根据Stokes定律，摩擦系数f与介质的粘度、粒子的形状和大小（球形粒子半径为r）有关，即f = 6 r 。 3 在电场中运动的粒子，其所受到的电场力和摩擦力平衡，即 qE = 6 rv 。变换该式得： qE v = 6 r 因此，带电粒子在电场中运动的速度与它所带的静电荷及电场强度成正比，和溶液的粘度与粒子的大小成反比，即在相同的电泳条件下，只要粒子所带的净电荷不同，或粒子的大小不同，就有可能借助电泳而被分离。 4我们通常使用电泳迁移率M来表示在单位电场中颗粒的迁移速度，即 因此，对于给定的颗粒和电泳条件，电泳迁移率是描述物质在电泳中行为的特征性常数，它表示带电粒子在单位电场强度E和单位时间t内泳动的距离L。二、影响电泳迁移率的因素 1缓冲溶液 缓冲溶液应选用使分离的物质稳定，而且不与其发生反应的体系。缓冲液的pH直接影响分子的解离和带电性质、状态，因而会影响迁移率和分离效果。缓冲液的离子强度应在0.050.10mol/L间为宜，过低，产热少，电泳快，区带明显扩散；过高，区带尖锐，泳动距离短，产热多。离子强度可用表示。（配动图） 2电场 带电粒子在电场中的移动速度，与电势梯度成正比。 因电场中施加的端电压不同，而分为常压和高压电泳。一般在500V以下为常压电泳，电势梯度1020V/cm；500V以上为高压电泳，电势梯度20200V/cm。高压电泳会产生大量的热，所以高压电泳仪有配套的冷却装置和安全防护装置。3支持介质 支持介质解决了样品扩散问题。一般选用惰性材料，不影响粒子在电场中的迁移率。但有的支持介质仍对样品有吸附和滞留作用，将造成分离物的拖尾现象，影响分辨力。有的支持介质具有电渗作用。所谓电渗是指一种液体相对于带电的支持物的移动现象。是由于支持介质内存在某些可解离的基团所致，将影响带电粒子在电场中的泳动速度或泳动方向。此外，有的支持介质具有分子筛作用，可根据待分离物的分子大小，采用不同的交联度以形成孔径不同的凝胶。粒子在这种介质中电泳时，迁移率不仅与其带电性质有关，而且与它们的分子大小有关。三、醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素薄膜电泳采用醋酸纤维素薄膜为电泳的支持介质，具有操作快捷简便、染色和脱色较易、背景清晰、区带分明、样品需要量少、介质可以透明后定量扫描等优点，主要用于生物大分子物质的分离分析。血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 一、原理 以醋酸纤维薄膜为支持物，浸入ph8.6的缓冲液后吸去多余液体。将微量血清点于膜上，经电泳后，将薄膜置染色液中使蛋白质固定并染色，洗去多于染料。将膜条烘干，再将其用透明液进行透明处理。用光密度计或凝胶成像系统进行成分分析比较。 二、操作 1、准备与点样 将薄膜切成28cm的膜条。在薄膜无光泽面距一端1.5cm处用铅笔划一线，表示点样的位置。 将薄膜无光泽面向下，浸泡于巴比妥缓冲液中。 将充分浸透（指膜上没有白色瘢痕）的膜条取出，用滤纸洗去多余的缓冲液。 用X光软片在盛有血清的表面皿中蘸一下，使软片下端粘上薄层血清，在表面皿边缘轻轻刮除多余的血清，然后紧按在薄膜点样线上，待血清全部渗入膜内，移开软片。 2、电泳 将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面（即点样面）向下，点样端置阴极。槽架上四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，待平衡5分钟通电，电压为10V/cm长（指膜条与滤纸桥总长度），电流为0.40.6mA/cm宽，通电一小时左右关闭电源。 3、染色 通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染23分钟取出，自来水冲去多余染料，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂洗白净为止。用滤纸吸干薄膜。 4、定量 将吸干的膜条放入干燥箱中，烤干后，放入盛有透明液的培养皿中让其充分浸透，用镊子将其取出，迅速平整的将膜条贴敷于载玻片上，让其自然透明，再将透明的膜条连带载玻片一同放入光密度计或凝胶成像系统中进行定量分析，从而求得各部分蛋白质的百分数。三、临床意义 1、正常值：白蛋白 5772% 1球蛋白 2 5% 2球蛋白 4 9% 球蛋白 6.512% 球蛋白 1220% 2、异常时： 慢性肝炎和肝硬化：白蛋白显著降低，2和球蛋 白无显著变化，球蛋白升高23倍。 肾病综合症、慢性肾小球肾炎：白蛋白降低，2和 球蛋白升高。 多发性骨髓瘤：白蛋白降低，球蛋白显著升高。四、方法学评价1、电泳受干扰的影响因素较多，电流强度、电压大小、电泳缓冲液PH值、电泳缓冲液离子强度等。2、可进行百分比定量即CCD图像采集分析法、扫描分析法、膜条透明光密度扫描法、浸出比色法。3、只能进行半定量（%）。五、注意事项 1、拿取薄膜条一定要用镊子，严禁用手指 直接碰触膜条，以防手指皮肤上的氨基 酸污染。 2、电泳电压不能过高，防止蛋白区带发生 拖尾现象 3、电泳完毕取膜条时防止高压电击。 【血清总蛋白（TP）的测定】分光光度测定技术 光线的本质是电磁波的一种，有与电磁波和X线类同的性质。光线有不同的波长，肉眼可见彩色光称为可见光，波长范围在400750nm，小于400nm的光线称为紫外线，大于750nm的光线称为红外线， 当光线通过透明溶液介质时，其辐射能量有部分被吸收，一部分被透过，所以光线射出溶液介质之后光能被减少。例如，可见光透过有色溶液介质之后，或红外线通过多种气体后，均被吸收部分光能，这种光能的吸收的和透过可用于某些物质的定性定量分析。一般应用范围可在测定浓度的千万分之一至百分之一 。分光分析所依据的定律是Lambert氏和Beer氏定律。Lambert氏定律 一束单色光通过透明同业介质时，光能被吸收一部分，被吸收光能的量与溶液介质厚度有一定比例关系（见图1-1） 式中K为吸光系数，I0为入射光强度，I为通过溶液介质后的光强度，L为溶液介质的厚度。Beer氏定律的溶液介质浓度变化代替溶液介质厚度的改变，光能的吸收与厚度改变有类同的关系。即一束单色光通过溶液介质时光能被溶液介质吸收一部分，吸收多少与溶液介质浓度有一定比例关系。依据Lambert氏 定律中同样的推导，可得出下式： 式中C为溶液介质的浓度Lambert氏定律和Beer氏定律合并，即和式合并为： 令 则A=KCL A=LgT式中A为光密度（又称吸光度），T为透光度。 式为LambertBeer氏定律的物理表示式，其含义为：一束单色光通过溶液介质后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。此式为分光分析法的基本计算式。当a、b为两种不同浓度同种溶液时即：Aa=KaCaLa Ab=KbCbLb且 Ka=Kb La=Lb故； 分光光度法的计算式。 T6新世纪紫外可见分光光度计 吸光度测定操作规程1.将空白液、测定液、标准液分别倒入比色皿中（2/3液量）2.在主菜单中（光度测量 功能扩展 系统应用），选择“光度测量”按（ENTER）进入“光度测量”（光度测量： Abs nm）界面。3.在“光度测量”界面按GOTO 进入光度测量波长界面，按数字输入波长，按（ENTER）确认。4.在“光度测量”（光度测量： Abs nm）界面。按SET键进入光度方式界面： 选择“光度方式”按（ENTER）至Abs。 按下键选试样池菜单，按（ENTER）进入试样室界面，选择试样室后按（ENTER）确认“五连池”；按下键选择样池数:以（ENTER）至数码“3或2”；按下键选“空白溶液校正”按（ENTER）选“是”。5.按（RETURN）返回至光度测量Abs设定的波长nm界面。按ZERO键消除bs为0.000后，按START/STOP键（两次）测定并读取各管吸光度。【血清总蛋白（TP）的测定】一、原理 血清中蛋白质分子的肽键与双缩脲试剂中的Cu+ 结合形成紫色化合物；其色度与总蛋白的浓度成正比，在546波长下进行比色测定。实际上凡是分子内含有两个氨基甲酰基（-CONH2）的化合物，不论直接相连或是通过一个氮或碳原子间接连接，均能与双缩脲试剂发生反应。蛋白质分子内含有许多肽键（-CONH2 ），因此可用双缩脲法作比色测定。但应注意的是不仅仅是（-CONH2），凡含-CSNH2、-C（NH）NH2 或-CH2NH2 等基团而具有累似结构的化合物对双缩脲试验亦呈阳性，所以本反应并非为蛋白质所特有。但在体液中，除蛋白质外实际上不存在可与双缩脲试剂显色的物质。各种血浆蛋白质，包括病理的和正常的，呈色的程度基本相同，因此在血浆蛋白的比色测定中，双缩脲反应是比较理想的方法计算公式： （70g/L）三、参考值： 总蛋白：6085 g/L 白蛋白：3848 g/L 球蛋白：2232 g/L 白蛋白/球蛋白=1.52.5/1四、临床意义： 1、白蛋白/球蛋白=1.52.5/1，通过计算其比值可以判定肝脏的功能情况； 2、总蛋白升高：脱水，皮肤大面积烧伤、发烧、腹泻、呕吐。 3、总蛋白降低：大量输液将机体血浆稀释，某些水肿性疾病，长期营养不良和消耗性疾病。 4、球蛋白大量降低：机体免疫功能降低。 五、方法学评价1.线性范围：0.0100.0g/L，2.精密度：批内CV2.8%、批间相对极差3.3%3.准确度：准确度95%4.波长546nm六、实验注意事项1.样品中总蛋白含量超过100.0g/L，则用生理盐水稀释后测定，结果乘以稀释倍数。2.试剂浑浊变色不能用。3.试剂使用后立即盖紧瓶盖。【血糖的测定 - 回收预实验】一、回收原理 回收试验是用来发现分析方法比例系统误差的有效评价方法。即通过测定分析方法的回收率，能够较确切地判断该分析方法比例系统误差的有或大小，可以对方法的准确性和可靠性做出正确评价。 比例系统误差常因样品、基质液中的其它物质与分析物竞争分析试剂并与之发生反应引起。其特征是随着分析物浓度的增加此种误差成比例的增大。二、预实验：1.样品制备基础 血清 ： 血清0.09ml+0.01 ml生理盐水回收样品：血清0.09ml+0.001 ml 80 mmol/L G标准液+0.009 ml生 理盐水回收样品：血清0.09ml+0.006 ml 80 mmol/L G标准液+0.004 ml生理 盐水回收样品：血清0.09ml+0.009 ml 80 mmol/L G标准液+0.001 ml生理盐 水【血糖的测定 - 回收实验】一、原理1.实验原理 -D-葡萄糖+O2+H2O D-葡萄糖酸+H2O2 （GOD：葡萄糖氧化酶） H2O2+4-AAP+酚 2H2+红色醌类化合物 （4-AAP： 4氨基氨替比林） （POD：过氧化物酶） 红色醌类化合物生成量与样品中葡萄糖含量成正比，与经过同样处理的葡萄糖校准液进行比较，即可计算出样品中葡萄糖的含量。2.回收原理 回收试验是用来发现分析方法比例系统误差的有效评价方法。即通过测定分析方法的回收率，能够较确切地判断该分析方法比例系统误差的有或大小，可以对方法的准确性和可靠性做出正确评价。 比例系统误差常因样品、基质液中的其它物质与分析物竞争分析试剂并与之发生反应引起。其特征是随着分析物浓度的增加此种误差成比例的增大。四、计算3.计算回收量 回收量=回收样品测得值基础样品测得值4.计算回收率 回收率（%）=回收量/加入浓度 1005、 回收实验的数据处理 样品 测得浓度（mmol/L）加入浓度（mmol/L）回收量（mmol/L）回收率（%） 基础样品 _ _ _回收样品回收样品回收样品平均回收率 六、回收实验结果的判断 回收率在95105%之间；100%是最为理想的回收率测定结果。【血清-淀粉酶（AMS或AMY）活性的测定Reagent for - Amylase Test】实验原理： 样品中-淀粉酶（1，4-D-葡萄糖水解酶，又称淀粉内切酶，对1，4-糖苷键连接的葡萄糖有特异性。）催化淀粉分子及糖原中的-1，4葡萄糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖及含有-1，6糖苷键支链的糊精，在淀粉（已知浓度）充分的条件下，反应后加入碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其颜色的深浅与未经酶促反应的空白管比较，从而推算出淀粉酶的活力。注： 1、生物界存在和两种淀粉酶。 2、淀粉酶分子量40000 50000,很易由肾排出。 3.-淀粉酶;-amylase 能将直链淀粉分解成麦芽糖的淀粉酶。广布于植物界如未发芽的大麦、小麦、燕麦、大豆、甘薯等中。可耐酸。将麦芽汁调节pH值为3.6，在0下可使-淀粉酶失去活力，而余下-淀粉酶。-淀粉酶的唯一产物是麦芽糖，不是葡萄糖。测定步骤 各管混匀， 660nm波长，以蒸馏水调零，测定各管吸光度值。2、计算：注：淀粉浓度 0.4g/L 样品AMY活力（苏氏单位)=系数关系注解0.4淀粉浓度5.0 1单位定义消耗淀粉mg数15 1单位定义反应时间7.5 酶的实际作用时间100 1单位定义用血清0.02 样品取量3、AMY活性单位定义： 100ml血清中的淀粉酶在37，15分钟水解5mg淀粉为1个单位。半自动生化分析仪的使用参数设置 方 法：终点法 样品试剂：1/10 波 长：660nm 反 应温 度：37 光 径：10mm 反 应时 间：10min仪 器使 用：分成四个半自动生化分析仪实验组进行操作。参考值： 血清：60180U苏氏单位 尿液：100 1200U苏氏单位临床意义： 淀粉酶主要由胰腺和唾液腺分泌，肺、肝、甲状腺、脂肪等组织亦含有此酶。 1.血清淀粉酶测定主要用于急性胰腺炎的诊断。一般于发病后612h开始升高，1224h达峰值，25d恢复正常，因此血清淀粉酶活性显著升高对急性胰腺炎的早期诊断价值较大。淀粉酶可通过肾小球滤过。 2.尿淀粉酶于发病后1224h开始升高，持续时间长，下降比血清淀粉酶慢，故胰腺炎后期测尿淀粉酶更有价值。 3.慢性胰腺炎、胰腺癌、急性阑尾炎、溃疡性穿孔、肠梗阻、流行性腮腺炎、唾液腺化脓等血清淀粉酶均可升高。 4.肾功能障碍时，血清淀粉酶升高，尿淀粉酶降低。 5.各种肝病疾患，血、尿淀粉酶同时降低。方法学评价1.淀粉遇碘呈蓝色反应属有机化学的经典型反应，方法可靠，反应特异性高。2.线性范围：0400苏式单位（U/L）3.精密度：批内CN10%4.准确度：不准确度20%5.空白吸光度：空白管在660nm波长处，10mm光径，吸光度0.45注意事项： 1、样品为不溶血的血清、血浆或尿液（pH值应调至7.0）样品应在低温条件下运输保存，血清或血浆中淀粉酶28可稳定30天，室温可稳定7天。 2、如果样品中AMY活力大于400苏氏单位或测定管吸光度小于空白管吸光度一半时，应将样品稀释后再进行测定，测定结果乘以稀释倍数。 3、加入显色剂及蒸馏水后，应立即比色，否则可致结果偏高。使用血浆时应选用肝素抗凝。 4、如遇黄疸、溶血或乳糜标本时应作样品空白。 【丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性的测定和标准曲线】一、原理 样品中ALT在一定条件下，作用于丙氨酸和-酮戊二酸，生成一定量的丙酮酸及L-谷氨酸，2，4-二硝基苯肼与反应产生的丙酮酸及剩余基质-酮戊二酸生成各自相应的2，4-二硝基苯腙。在505nm波长及碱性条件下，以相同摩尔浓度计算，丙酮酸所形成苯腙的吸光度值为-酮戊二酸苯腙的三倍，根据此特点，可推算出ALT的活力。ALT转氨基反应式转氨基作用二、测定方法1、工作曲线制作： 各管混匀，室温恒定10分钟，505nm波长，以“0”号管调零，测定各管吸光度值制作工作曲线。2、样品测定： 混匀，室温恒定10分钟，505nm波长，以空白管调零，测定各管吸光度值。3、计算： 以各标准管活力单位为横坐标，吸光度变化值为纵坐标，手工绘制工作曲线图，查阅该图即可得样品ALT活性。4、KarU单位定义： KarU单位为分光光度单位，1ml血清在25、反应液总体积3ml，波长340nm、光径1.0cm时，每分钟吸光度下降0.001A为1个单位。 三、参考值：正常值： 5 25KarU或5 50U/L (37)四、临床意义：1、急性肝炎显著升高，尤其对无黄疸、无症状肝炎的早期诊断更有帮助，其阳性率高，阳性出现时间较其他试验早，其活性的高低随肝病的进展和恢复而升降，据此可观察病情及预后。ALT持续处于高水平或反复波动，表示病变仍在进行或转为慢性肝炎。若黄疸加重，ALT反而降低，即所谓的“胆酶分离”现象，常是肝坏死的先兆。2、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等ALT活性轻度升高。3、胆道疾病、心肌和骨骼肌损伤也可引起ALT升高。4、应用某些药物如氯丙嗪、异烟肼、利福平等及非肝胆疾病也可暂时性轻度至中度升高。五、注意事项：1、 样品为空腹血清、血浆。2、 样品应在低温条件下运输保存，样品中ALT在28可稳定7天。3、 反应时间和温度必须严格按照操作规程控制。4、 如遇黄疸、溶血或乳糜标本时应作样品空白。 【全自动生化分析仪的使用】QAQ【血清肌酐（Cr或Cre）的测定】一、原理 肌酐是肌酸代谢的最终产物，由肾脏排出。人体内的肌酸，一部分来自食物、一部分来自体内合成。体内合成肌酐的原料为甘氨酸、精氨酸和蛋氨酸。样品中肌酐与碱性苦味酸作用，生成橙红色的苦味酸肌酐复合物，其颜色强度与样品中肌酐含量正比，与经过同样处理的肌酐校准液进行比较，即可计算出样品中肌酐的含量。根据肌酐与苦味酸反应生成橙红色苦味酸肌酐复合物的速度与假肌酐不同，而设置适宜的检测时间。在20 80s之间，肌酐反应占绝对优势，80s后其他多数干扰物才有较快的反应，故而选择25 60s的反应速率来反映真肌酐的含量。而对假肌酐显色的干扰，可以通过选择真肌酐的最大吸收峰（波长）的确定来进行有效的规避。二、测定步骤：1、加样： 各管分别加蒸馏水2ml后混匀， 置37恒温10分钟，510nm波长，以空白管调零，在10分钟内完成各管吸光度的测定。 2、计算 计算公式：样品Cr含量（mmol/L）= Cs注：肌酐校准液浓度 133mol/L 三、参考值 男性：44.2 132.6mol/L 女性：71.1 106.1mol/L四、临床意义 血液肌酐经肾小球过滤，肾小管既不重吸收，也不分泌，即肾对肌酐的排泄能力强，因而肾疾病早期血浆肌酐通常不高，在反映肾小球滤过率下降方面，血肌酐比血尿素的灵敏度低。但血肌酐受饮食、运动、激素、蛋白质代谢等因素的影响较少，所以诊断特异性比血尿素好。 1、增高 血肌酐增高： 由于肾脏储备和代偿能力很强，故早期或轻度肾小球滤过功能受损时，血肌酐正常。只有当肾小球滤过功能降至正常人1/3时，血肌酐才明显增高，故不能反映早期肾功能受损，对晚期肾病临床意义较大。与BUN同时测定意义更大，二者同时升高，说明肾功能严重受损，当Cr200mol/L，提示病情继续恶化，有发展为尿毒症的趋势；当Cr400mol/L则预后较差。如仅BUN升高，而Cr正常，则可能为肾外因素引起，如消化道出血或尿路梗阻。2、降低 血肌酐减少，主要见于进行性肌肉萎缩、贫血、白血病等。 五、注意事项 1、必须严格控制反应时间，以尽量避 免快速或慢反应假肌酐物质的干 扰。 2、本方法不宜用血浆标本。 3、溶血产生的红细胞内非特异性物质 将干扰反应，应作血清空白 （0.1ml血清+生理盐水1.00ml）。 六、方法学评价1、线 性范 围：0.6 500mol/L2、精 密 度：批内CV8.3%、批间极 差10.2%3、准 确 度：90%4、空白吸光度：空白管在510nm波长 处，10mm光径下，以蒸馏水调零， 吸光度值0.150。 【总胆红素（TBIL）测定 】一、原理 总胆红素（即非结合胆红素与结合红素）在二甲基亚砜、咖啡因-苯甲酸钠-醋酸钠等加速基作用下在酸性溶液中与重氮苯磺酸作用生成紫色的偶氮胆红素，与经过同样处理的校准液比较，即可计算出样品中总胆红素的含量。三、计算因数法：样品TBil含量（mol/L）= (AuAub)216 四、半自动生化分析仪的使用2参数设置 方 法：终点法 样品试剂：1/15 波 长：560nm 反 应温 度：37 光 径：10mm 反 应时 间：10min仪器使用 分成四个半自动生化分析仪使用实验组进行操作。五、参考值 5.117.1mol/L六、临床意义 血清总胆红素测定的意义 胆红素(Bil)仍是目前肝功能检查中不可缺少的项目。它是肝脏疾病、肝内或肝外胆管阻塞性疾病和溶血性疾病早期诊断的最重要指标，而且对这些疾病病情的发展和预后判断也有很重要的临床意义。胆红素，分为非结合胆红素与结合红素，分别从大、小便中排出。正常时血液中只含有微量的胆红素。 1、有无黄疸及黄疸程度的鉴别。 2、肝细胞损害程度和预后的判断：胆红素浓度明显升高反映有严重的肝细胞损害。但某些疾病如胆汁淤积型肝炎时，尽管肝细胞受累较轻，血清胆红素却可升高。 3、新生儿溶血症：血清胆红素有助于了解疾病严重程度。 4、再生障碍性贫血及数种继发性贫血（主要见于癌或慢性肾炎引起），血清总胆红素减少。胆红素升高的意义 1.可以判断黄疸程度，黄疸程度与血总胆红素及血清胆红浓度(微摩尔/升)的关系： 隐性黄疸 1734轻度黄疸 34170中度黄疸 170340重度黄疸 340 2.依此判断黄疸类型黄疸类型 血清胆红浓度(微摩尔/升)完全阻塞性黄疸 340510不完全阻塞性黄疸 170265肝细胞性黄疸 170200溶血性黄疸 85 3.按照胆红素分类，判断黄疸性质 阻塞性黄疸。当患有阻塞性胆道疾病如胆道肿瘤、胆结石、胆道蛔虫症、肝毛细胆管炎时，由于胆汁进入肠腔的通道被阻断，胆红素无法正常排泄而逆流入血引起血清总胆红素增高，结合胆红素增高，尿胆红素阳性。肝细胞性黄疸。如病毒性肝炎、中毒性肝炎、肝硬化、钩端螺旋体病患者，因肝脏不能将全部结合胆红素排至胆汁，故有一部分进入血液，也可使血清总胆红素增高，结合胆红素增高，尿胆红素阳性。 溶血性疾病。如误输异型血、疟疾、蚕豆病(一种溶血性疾病)等疾病，因红细胞破坏过多，所产生的非结合胆红素超过了肝脏处理的能力，最终引起血清总胆红素增高，非结合胆红素增高，尿胆红素阴性。七、方法学评价1、线性范围：0.0 342微摩尔/L2、精密度：批内CV3.8%、批间相对极差5.8%3、准确度:不准确度1.0%4、空白吸光度：空白管在560nm波长处，10mm光径下，以蒸馏水调零，吸光度值0.150。七、注意事项1、如果样品中TBil含量超过342.0微摩尔/L，则用蒸馏水稀释后测定，2、肝素抗凝血浆不适用于本法。3、校准液和标本均应注意避光4、避免试剂污染。 【血糖（Glu）测定的干扰试验】一、实验原理 -D-葡萄糖+O2+H2O D-葡萄糖酸+H2O2 （GOD：葡萄糖氧化酶） H2O2+4-AAP+酚 2H2+红色醌类化合物 （4-AAP： 4氨基氨替比林） （POD：过氧化物酶） 红色醌类化合物生成量与样品中葡萄糖含量成正比，与经过同样处理的葡萄糖校准液进行比较，即可计算出样品中葡萄糖的含量。干扰物尿酸可以和GOD反应生成的H2O2发生反应，使H2O2不能参加POD的偶联反应，从而降低显色强度，产生负的测定误差。干扰原理 干扰试验用于测定某物质加到样品中产生的系统误差。干扰物浓度一定时，产生的误差是恒定系统误差，误差的实际大小随干扰物的浓度而变化。干扰试验即用于检验某方法的特异性，也用于检测干扰物质对方法的干扰作用，以评价分析方法的准确性。 当干扰物的浓度达到一定量时，将对相应的实验产生干扰，由于vitC、尿酸等物质对血糖测定GOD-POD法具有干扰作用，本实验选用尿酸做GOD-POD法测血糖的干扰试验，尿酸与GOD反应生成的H2O2发生反应，使部分H2O2不能参与第二步POD的偶联反应，从而降低显色强度，产生负的测定误差。二、干扰原理 干扰试验用于测定某物质加到样品中产生的系统误差。干扰物浓度一定时，产生的误差是恒定系统误差，误差的实际大小随干扰物的浓度而变化。干扰试验即用于检验某方法的特异性，也用于检测干扰物质对方法的干扰作用，以评价分析方法的准确性。 当干扰物的浓度达到一定量时，将对相应的实验产生干扰，由于vitC、尿酸等物质对血糖测定GOD-POD法具有干扰作用，本实验选用尿酸做GOD-POD法测血糖的干扰试验，尿酸与GOD反应生成的H2O2发生反应，使部分H2O2不能参与第二步POD的偶联反应，从而降低显色强度，产生负的测定误差。二、预实验：样品制备三、数据处理 1、干扰物加入量计算 干扰物加入量 = 干扰物浓度：9.0 mmol/L2、干扰试验的数据处理 干扰物浓度：9.0 mmol/L 干扰值（mmol/L）= 干扰样品测定值-基础样品测定值 干扰率（%）= 干扰值/基础值100 样品 GLU测得值（mmol/L） 加入US值（mmol/L）干扰值（mmol/L）干扰率（%）基础样品 （ml） 干扰样品1（ml） 干扰样品2（ml）干扰样品3（ml） 【血清白蛋白（ALB）的测定(Assays for Serum Albumin)（溴甲酚绿染色法）】一、原理 在pH4.2缓冲液中，溴甲酚绿（BCG）与白蛋白结合形成蓝色复合物（血清白蛋白在pH4.2的缓冲液中带正电荷，在非离子型表面活性剂存在时，可与带负电荷的染料溴甲酚绿结合形成蓝绿色复合物），在波长620nm处有最大吸收峰，其颜色深浅与白蛋白浓度成正比。与经过同样处理的白蛋白校准液进行比较，即可计算出样品中白蛋白含量。 溴甲酚绿（BCG）与血清蛋白呈非特异性反应，但是在反应的30秒钟内溴甲酚绿（BCG）与白蛋白结合形成蓝色复合物呈特异性反应。因此反应结束后应立刻比色测取吸光度。 二、测定方法。2、分光光度计测定方法：波长620nm，空白管调零，测定标准管和测定管吸光度值，按公式计算测定结果。 计算公式： （40g/L）三、参考值 总蛋白：6282 g/L 白蛋白：3555g/L 球蛋白：2030 g/L 白蛋白/球蛋白=1.52.5/1四、临床意义 1、白蛋白/球蛋白=1.52.5/1，通过计算其比值可以判定肝脏的功能情况； 2、白蛋白降低，其比值降低或倒置：慢性肝炎（肝细胞功能降低）、肝硬化（肝细胞坏死、肝腹水）； 3、球蛋白大量降低：机体免疫功能降低。 五、方法学评价 1、操作简单、快速，受干扰因素小 2、线性范围：1060g/L, 3、RCV4%（批内重复测定变异系数） 4、白蛋白的测定方法：有色氨酸含量法、燃料结合法、电泳法、免疫化学法和电化学测定法。六、注意事项 1、应保持PH为3.8 2、BCG与多种蛋白呈颜色反应，及与a-球蛋白、运铁蛋白、结合珠蛋白结合显色，但血清中BCG在30秒内与白蛋白的反应最快，且呈主导地位 3、实验小组分批间隔保温。【血糖（Glu）的测定（葡萄糖氧化酶法）】2、分光光度计测定方法：波长505nm，以空白管调零，测定标准管和样品管吸光度值，按公式计算测定结果。计算公式：Glu含量（mmol/L）= Cs其中：Cs=5.55 mmol/L3、全自动生化分析仪的使用 工作原理 参数设置 样品检测 质量控制 上机注意事项三、参考值： 3.61 6.11mmol/L四、临床意义 1、生理性或暂时性高血糖：餐后12h 摄入高糖饮食、情绪