栉孔扇贝(CfPGRP-S1)介导的肽聚糖识别蛋白.doc

栉孔扇贝（CfPGRP- S1）介导的肽聚糖识别蛋白 针对细菌感染的免疫防御系统Jialong Yanga,b, Wan Wanga,b, Xiumei Weic, Limei Qiua, Lingling Wanga,Huan Zhanga,b, Linsheng Songa,中国，山东青岛266071,南海路7号，中国科学院，中国科学院海洋研究所，实验海洋生物学重点实验室中国，北京100049，中国科学院研究生院，研究所，中国，青岛266003，中国海洋大学，水产动物病理学和免疫学重点实验室，文章信息文章历史：2010年6月25日接收2010年8月9日修订2010年9月8日接受2010年8月21日在网上提供关键词：栉孔扇贝 PGRP 先天免疫 模式识别受体 酰胺酶摘要：肽聚糖识别蛋白（PGRP）在无脊椎动物和脊椎动物先天免疫中，由于其在检测和消除入侵的细菌的突出能力至关重要。几个PGRPs已从软体动物中确定，但其功能和下划线的机制目前仍不清楚。在本研究中，信使核糖核酸的表达谱、位置和可能的功能，从直孔栉孔扇贝（CfPGRP- S1）的PGRP- S1进行了分析。地幔CfPGRP- S1位于蛋白，鳃，肾和扇贝的生殖腺。血细胞中的信使核糖核酸符号在PGN刺激后被急剧上调，而LPS的刺激后（P 0.01）和-葡聚糖（P 0.05）的上调是中度的。CfPGRP- S1的重组蛋白（指定为rCfPGRP- S1）具有较高的PGN和对LPS的中度亲和力，但它没有约束力-葡聚糖。同时，rCfPGRP- S1也表现出对革兰氏阳性菌藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌的强烈凝集活性，而对革兰氏阴性菌大肠杆菌表现出弱的凝聚活性。更重要的是，rCfPGRP- S1充当了降解PGN的杀菌酰化酶，并在有Zn2 +存在的情况下强烈抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。这些结果表明，CfPGRP- S1不仅可以作为一种识别细菌的PGN和LPS的模式识别受体，还是一个参与了消除对入侵者反应的清道夫。 2010爱思唯尔有限公司保留所有权利1、 简介无脊椎动物缺乏适应性免疫，他们完全依赖自己的先天免疫反应来有效抵御各种病原体（Beutler，2004年; Loker等，2004）。在众多的先天免疫力，有害的非自治领土的模式识别受体介导的歧视自我反应（PRRS）是首要和关键的一步（2002年，詹韦和Medzhitov; Medzhitov和詹韦，2002年）。PRRS是生殖系编码分子，旨在识别一些存在于病原体的高度保守的结构，称为与分子模式相关的病原体（PAMPS），例如来自细菌的脂多糖（LPS）和肽聚糖（PGN）来自真菌的-1,3-葡聚糖、来自病毒的双链RNA（詹韦和Medzhitov，2002; Medzhitov和詹韦，2002年）等。PRRS至少有六组，包括肽聚糖识别蛋白（PGRP），含有硫酯蛋白（TEP），脂多糖和-1，3 - 葡聚糖结合蛋白（LGBP），清道夫受体（SRCR），C型凝集素（CTL）半乳糖凝集素（烈风），这些都确定出自无脊椎动物（Christophides等，2002）。其中，PGRP是唯一一个专门识别细菌PGN的，包括革兰氏阳性菌李斯特 GN和革兰氏阴性菌DAP型二胺庚二酸（Schleife等人，1972年；施泰纳，2004年）。 PGRPs是无脊椎动物和脊椎动物中的保守分子（Dziarski2004年）。第一PGRP被确定为出自家蚕的血淋巴和角质层的19 kDa蛋白质（Yoshida等，1996）。随后，PGRP基因已被确定在许多生物，尤其是在昆虫和哺乳动物（Christophides等，2002;康等，1998; Tydell等，2002年。沃纳等，2000）。已有十三种不同的PGRP基因从果蝇中确定，和四种从人类中确定（Christophides等，2002;康等，1998;沃纳等人，2000年）。在预测结构的基础上，PGRPs分为三大类：20-25 kDa的小外PGRPs（PGRP- S）的，中间PGRPs（PGRP- I）40-45 kDa的两个预测跨膜结构域，和长期PGRPs高达90 kDa的细胞内或跨膜蛋白的（PGRP- L）（Ni等人，2007年）。PGRPs的类别和结构的多样性表明PGRPs的先天免疫系统的多种功能。虽然PGRPs最初是作为无脊椎动物和脊椎动物一个关键的PRRS（古普塔，2008年Girardin和菲尔波特，2006年仓田，2004年）确定的，也有越来越多的证据证明PGRPs执行多功能。一般来说，它们的功能分类至少有三个类别，包括：（1）作为PRR承认并结合细菌PGN（Gelius等，2003; Kang等人，1998年。Yoshida等，1996），然后激活或抑制下游的免疫反应，如前酚氧化酶（proPO）系统（竹鼻等人，2002年，吉田等人，1996年，TOLL和IMD通路（Choe等，2002），霍夫曼和Reichhart，2002年，米歇尔等人，2001），或JNK通路（比绍夫等人，2006年。 Maillet等，2008; Zaidman - 雷米等人，2006年）。（2）作为N - 乙酰胞壁酸 L -丙氨酸酰胺酶（NAMLAA）（Coteur等，2007; Gelius等，2003;李等，2007; Mellroth和Steiner，2006年，Zaidman-人头马等。2006年），切割细菌PGN中胞壁酸和肽链之间的酰胺粘合剂，并展示其像T7溶菌酶的杀菌活性（Gelius等，2003; Kim等人，2003年;。Mellroth等，2003）。（3）作为噬菌素诱导凝集或细胞的吞噬功能（Coteur等，2007年；分株等，2002）。 在节肢动物和哺乳动物相比，对软体动物PGRPs的研究仍处于开端。虽然几个PGRP基因已被克隆太平洋牡蛎（伊藤和高桥，2008，2009），但其确切的功能仍然没有得到很好的澄清。在我们以前的研究中，出自直孔栉孔扇贝和信使核糖核酸表达谱，鳗弧菌和微球菌挑战之后的短PGRP，栉孔扇贝及其mRNA表达谱直孔后，鳗弧菌和微球菌lysodeikticus挑战，表明这是一个基本的和可诱导的急性期蛋白对细菌感染的免疫反应（Su等人涉及一个短PGRP（CfPGRP- S1），2007）。在本研究中，编码CfPGRP- S1的成熟肽的cDNA片段被重组重组，并在大肠杆菌中被表达，对在先天免疫系统的包括PAMPS识别和结合能力、凝集活性、酰化酶活性和杀菌活性的CfPGRP S1活动的功能重组进行了检查，达到了更好地了解扇贝免疫防御机制的目的。2、 材料和方法2.1、扇贝的免疫刺激从中国山东省青岛市的一个农场收集了三栉孔扇贝平均壳长为55mm的成年人，在加工前的一个星期保存在15的充气海水里。两百扇贝被用于PAMPS刺激实验。扇贝被随机分为五组，每组40个。一组接受了50 L磷酸盐缓冲液的注入（PBS，0.14M氯化钠，氯化钾3MM，8MM二钠磷酸氢十二水合，1.5MM磷酸二氢钾，pH值7.4），来自大肠杆菌0111：B的脂多糖4（西格玛鈥揂ldrich0.5mgml鈭 PBS），来自葡萄球菌的PGN。未经处理的那组被定为空白组。处理后，扇贝被送回水箱，五个在注射3、6、12、24和48 小时后被随机抽样。血淋巴被收集起来，用离心机分为500 G，每10分钟4C来收获RNA制备的血细胞。2.2、CfPGRP- S1- PAMPS刺激表达模式 用Trizol试剂根据制造商的协议（Invitrogen公司）来提取总RNA。第一链合成进行了基于Promega公司的M - MLV RT用法信息使用我的DNA酶（Promega公司）处理的总RNA为模板和寡（DT）适配器为引物（表1）。合成反应均在1小时后为42C，5分钟后达到95C，加热终止。基因混合稀释至1:100，并存储在80C的后续SYBR绿色荧光实时定量RT - PCR技术中。 一对CfPGRP- S1 CfPGRP- S1 RTF和CfPGRP- S1 RTR（见表1）的基因特异性引物，是用来放大从cDNA270 bp的产品，而PCR产物被按照顺序来验证RT- PCR技术的特异性。双肌动蛋白引物，AF和AR（见表1），用于扩增94 bp的片段，作为内部控制以验证成功的转录和校准相应的扇贝样本的cDNA模板。 在ABI7300实时热循环仪里根据手册（Applied Biosystems公司）进行实时RT - PCR扩增。扩增产物的分离曲线分析在每个PCR的末端执行来确认只有一个PCR产物扩增和检测。PCR程序后，使用ABI7300 SDS软件V2.0（Applied Biosystems公司）进行了数据分析。为了保持一致性，基线通过软件自动设置。2鈭CT方法用于分析CfPGRP- S1“（Livak和Schmittgen，2001）的表达水平。所有数据均在平均值 SE（n=4）表示的相对表达。数据双尾t检验未成之后遭到单向方差分析（onewayANOVA）。差异为P 0.05被认为是显著和为P 2.1的呗认为是阳性。2.7、细菌凝集法如Yu等人以前的报告细菌凝集法已经被执行。（1999年）。异硫氰酸荧光素（FITC） -标记为革兰氏阴性菌大肠杆菌TOP10F，L-鳗弧菌，革兰氏阳性菌藤黄微球菌，枯草芽孢杆菌和酵母酵母GS115悬浮在TBS缓冲液（50mmoll- 1的Tris - HCl，50mmoll-1氯化钠，pH值7.5）2.5 109细胞ml - 1的。10mm氯化锌存在或缺乏的情况下一个10升的菌悬液加入到25升rCfPGRP- S1（40 GML1）。二十五个rTrx微升(40gml1)鈭溶解在同一缓冲区设置为阴性对照。在室温下孵育45分钟左右，然后在荧光显微镜下观察细胞的混合物。2.8、酰化酶的活性分析 通过修改（Mellroth等，2003）的早期方法来测定从金黄色葡萄球菌到PGN 的rCfPGRP- S1的相对酶活性。简单地说，不能溶解的PGN（1mgml1）用rCfPGRP- S1（50mgml1）在HEPES缓冲rCfPGRP- S1（50mgml1）（20MM，pH值7.2，150MM氯化钠），HEPES -氯化锌缓冲区（20MM，10MM氯化锌氯化钠，pH值7.2，150MM），HEPES -氯化锌 - EDTA缓冲液（20MM，pH值7.2，氯化钠150MM，10MM氯化锌，EDTA的10MM）中孵育。作为对照，PGN（1mgml1）在HEPES缓冲液中培养rTrx（50mgml1）。在540nm处的光密度（OD值）在120分钟内每五分钟被记录一次。2.9、抗菌活性检测对革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抗菌活动在培养皿中进行。30毫升的温营养琼脂（1.0）与微生物的混合倒入一个90毫米板。毛孔被打孔器穿了0.5厘米直径的孔。接着，50克在存在或缺乏10mMZnCl2的TBS缓冲液中的2 rCfPGRP- S1被添加到孔内。TBS缓冲液内50微克rTrx或氨苄青霉素分别添加到另外两个对照的阴性孔或阳性孔。该板块在37C下孵育了24小时。毛孔周围的透明环表示抗菌活性。 按照以前方法的修改（Yu等，2007）对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养与rCfPGRPS1的生长曲线进行了测试。挑取两个单菌落，并转移到1毫升LB培养基。50 L的细胞悬液体积加入等体积带或不带10MM的TBS氯化锌（顶尖浓度为100克/毫升）的rCfPGRP- S1，并将TBS内的rTrx作为对照。在每分钟200转和外直径为600纳米的通风环境里孵育每个样品每1小时测定一次。图1：CfPGRP- S1到肌动蛋白mRNA的相对时空表达分析 实时RT- PCR技术在扇贝血细胞注射LPS后，PGN、葡聚糖和PBS分别挑战3，6，12，24和48 h。值显示为平均值 SE（n=4）。（* P 0.05，* P 0.01）。3、结论3.1、CfPGRP S1后PAMPS刺激mRNA的表达模式 实时RT - PCR技术用于监测扇贝三个典型PAMPS刺激后CfPGRP- S1的转录表达。在PGN刺激组，CfPGRP- S1的数据急剧上升，它的最高点达到12 hpost注射液（与空白组比较133.4倍，P0.01）。随着时间的推移，它逐渐降低，48 小时后mRNA的表达是空白组的20.2倍（图1）。与PGN的刺激相比，LPS和葡聚糖刺激可导致温和上升，CfPGRP- S1 mRNA表达水平分别在6小时（7.9倍，P0.05）和12小时 （10.7倍，P 2.1的样品为阳性。显然，rCfPGRP- S1甚至可以将PGN绑定在低浓度上（1.56gml1，P / N= 2.48）（图4）。虽然仅在较高浓度时（6.25, 12.5 和 25gml1, P/N 2.1 ）rCfPGRP- S1能限制脂多糖（图4），在低浓度时不能检测到结合活性（1.56 and 3.12gml1, P/N 2.1的样品为阳性。结果是代表平均三个这样的实验。3.5、细菌凝集法 革兰氏阴性菌大肠杆菌TOP10F和L.鳗，革兰氏阳性藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌，以及酵母P.酵母GS115被用来测试rCfPGRP- S1的凝集活动。当浓度为40gml1的革兰氏阳性藤黄微球菌和枯草杆菌用rCfPGRP- S1孵育时，值得注意的凝聚被观察到（图5，B和C）。当革兰氏阴性菌大肠杆菌TOP10F与rCfPGRP- S1培养在相同浓度里时，检测到弱凝集（图5A）。在锌添加组观察到同等程度的凝集（数据未显示），表明rCfPGRP- S1的凝集能力不依赖锌。然而，在L.鳗和酵母GS115这组没有观察到明显的凝集（数据未显示）。作为对照，rTrx不能凝集测试的任何细菌（图5D，E和F）。图5：rCfPGRP- S1诱导的对大肠杆菌，藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌凝集。 用25升l (40gml1) 的rCfPGRP-S1 (ac) 或者rTrx (df),培育FITC标记的细菌，然后在室温下孵育约45分钟，然后在荧光显微镜下观察细胞。3.6、酰化酶的活性分析 通过记录在540 纳米处的外直径减少来测定rCfPGRP- S1向PGN的相对酰化酶的活性。在有10mm氯化锌的情况下rCfPGRP- S1与PGN孵育时，外径值（从0.202到0.147120分钟内）显著下降（图6），说明Zn2 +存在时它对PGN高速下降的活性 。非Zn2 +的组和Zn2+- EDTA组检测到的对PGN低得多的下降的活性，表明rCfPGRP- S1酰化酶的活性是依赖于锌的（图6）。在对照的rTrx中没有观察到活性（图6）。图6：肽聚糖酶降解。肽聚糖孵育rCfPGRP- S1或rTrx，并在120分钟内在540nm处的光密度（OD值）记录每一个第5分钟。随着光密度下降记录酶的活性。3.7、rCfPGRP- S1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抗菌活性 检查rCfPGRP- S1上微生物的生长抑制效果的以确定其抗菌活性。在含有存在10MM锌的rCfPGRP-S1的毛孔周围发现了明显的透明抑制区，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌（图7A，B，C），以及氨苄青霉素（图7A和B，A）的毛孔板。在无锌+的rTrx（图7A和B，B）和rPGRP- S1毛孔内没有观察到明显的抑制作用区（图7A和B，D）。rCfPGRP- S1的大肠杆菌（图7C）和金黄色葡萄球菌（图7D）的生长曲线的电阻进行了测试。rCfPGRP- S1在目前指数期（3-6小时）可以强烈抑制含10MM氯化锌的两种微生物的生长，并在停滞阶段（6-8小时）表现出更加激烈的裂解细菌的能力。在没有Zn2+时，rCfPGRP- S1较弱地抑制两种微生物的生长（图7C和D）。图7：rCfPGRP- S1有力的抗菌活性。在培养皿中执行对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性。50微克氨苄青霉素、rTrx、含Zn2 +的rCfPGRP- S1和不含Zn2 +的rCfPGRP被添加到毛孔，并在37C下孵育24小时。一个毛孔周围的透明环表示抗菌活性。rCfPGRP- S1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或者混有针对性的蛋白质（顶尖浓度为100克/毫升）和OD值为600 的金黄色葡萄球菌的生长抑制试验在其开始后每隔一小时测定一次。这些数据是三个独立参数的平均 SD值。4、 讨论PGRPs在无脊椎动物和脊椎动物先天免疫中发挥显著作用，他们参与对病原体感染各的种反应，如作为杀菌的酰胺酶的PGN的降解（Coteur等，2007; Gelius等，2003;李等，2007; Mellroth和Steiner，2006年; Zaidman - 雷米等人，2006年），吞噬作用的诱导（Coteur等人，2007年;分株等人，2002年），前酚氧化酶系统的激活（Takehana 等，2002;。Yoshida等，1996），TOLL和IMD通路（Choe等人，2002年，霍夫曼和Reichhart，2002年，米歇尔等人，2001年）病原体识别（Gelius等，2003; Kang等人，1998年。Yoshida等，1996）。然而，有关PGRP软体动物功能的知识仍然有限。在本研究中，检查CfPGRP- S1先天免疫功能，目的是更好地了解扇贝免疫防御机制。PGRPs虽然最初被描述为PGN的约束力和识别蛋白，其中一些可以绑定到除了PGN外更多的PAMPS（Dziarski2004年）。例如，牛PGRP- S的同源可以识别并结合除了PGN的脂多糖（Tydell等，2002; Tydell和Selsted，2002年）。在本研究中，CfPGRP- S1的 mRNA表达所有PGN，LPS和葡聚糖的刺激后上调，表明它是诱导和急性针对不同的入侵微生物表达蛋白参与免疫防御。以往的研究证明革兰氏阴性塔氏弧菌和鳗弧菌可分别为上调CgPGRP- L和CfPGRP- S1的表达（Itoh和高桥，2009年苏等，2007）。考虑到我们的研究结果，对革兰氏阴性菌PGRPs的高的mRNA表达可能是LPS和PGN刺激的综合效应。以下PAMPS结合实验证实rCfPGRP- S1不仅结合PGN，也在体外与LPS结合。这种特性类似牛的PGRP- S（Tydell等，2002; Tydell和Selsted，2002年），但有别于其他生物体的PGRP- S（Gelius等，2003年PGRPs最鲜明的康等人，1998年;吉田等，1996）。值得注意的是，CfPGRP- S1 的mRNA表达在葡聚糖刺激后适度上调，但rCfPGRP- S1不能在体外结合葡聚糖，提醒我们葡聚糖识别可能需要其他分子的援助，CfPGRP- S1可能参与，但不能独立约束这样的PAMP。 除了病原体识别，PRRS通常进一步介导受益的病原体调理素效果，如C型凝集素介导的凝集（敖等人，2007年），由PGRP介导的抗菌活性（Mellroth和Steiner，2006）和由SR增强的细胞吞噬功能（Jang等，2009）。在这项研究中，rCfPGRP- S1表现出对革兰氏阳性细菌藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌明显的凝集以及对在体外革兰氏阴性菌大肠杆菌的轻微凝集，表明CfPGRP- S1在反对入侵的免疫防御中担任一个主要的调理素。PGRPs可以通过PGN在他们的细胞壁上识别并结合细菌（Li等，2007）。来自大多数革兰氏阳性菌的赖氨酸型PGN是通过PGRP- SA和PGRP- SD识别的（Gobert等，2003;。米歇尔等人，2001年），而来自革兰氏阴性菌的磷酸二铵型PGN是通过PGRP- LC和PGRP- LE检测的（Leulier等，2003; Stenbak等，2004;竹鼻等，2002）。在本研究中，rCfPGRPS1展现出对来自金黄色葡萄球菌的赖氨酸型PGN高亲和力，因此有人认为，对藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌的凝集得益于rCfPGRP- S1的赖氨酸型PGN的结合活性。由于有报道称PGRP没有同步地识别赖氨酸型和磷酸二铵型PGN，在这项研究中，rCfPGRP- S1对革兰氏阴性菌E.大肠杆菌的弱凝集被怀疑是LPS结合活性的结果。值得注意的是，当rCfPGRP- S1鳗与L孵育时没有明显的凝集，CfPGRP- S1甚至能够识别和绑定来自革兰氏阴性菌的LPS。这一结果表明，CfPGRP- S1并没有直接参与凝集或弧菌的清除。在C的栉孔扇贝等PRRS上已观察到类似的现象。例如，CfLec- 1和CfLec- 3的 mRNA表达通过弧菌L.得到强烈上调，但重组蛋白、rCfLec- 1和rCfLec- 3并没有表现出对L.弧菌的凝集活性（Zhang等，2009。Wang等，2007年）。有人怀疑CfPGRP- S1在防止扇贝致病细菌上可以发挥作用，结果也提供了有益的的证据来解释三栉孔扇贝L.弧菌的高毒力。PGRPs酰化酶的功能是通过细菌防止免疫系统的过度激活（比绍夫等人，2006年; Mellroth等，2003; Zaidman - 雷米等，2006）。PGRP总科的一些成员有丙氨酸酰胺酶(NAMLAA) 活性来通过水解酰胺键连接聚糖链来降解PGN（ Gelius等，2003胞壁酸残基的肽单位PGN; Kim等。，Mellroth等，2003），如哺乳动物PGLYRP- 2和果蝇PGRP- SC1，PGRP- LB和PGRP- SB1（Gelius等，2003;。Kim等，2003;。Mellroth等，2003;2003年Mellroth和Steiner，2006）。在其他PGRPs，如果蝇PGRP- SA-、SD-、LE或- LC，在PGRP域内缺乏一个关键的半胱氨酸残基废除酶活性（Maillet等，2008）。PGRP-酰胺酶是依赖锌有三个氨基酸残基的酶作为锌配体与T7溶菌酶有共同的功能。在我们以前的研究中，三个锌+约束力的站点（H112，H221，和C229）需要酰化酶活性在CfPGRP- S1中被确定（苏等人，2007年