姜黄素-菲啰啉-金属配合物.doc

毕 业 论 文姜黄素-菲啰啉-铜（锌）三元配合物的生物活性研究朱子澄 200730790229指导教师 熊亚红 讲师学院名称理学院 专业名称应用化学论文提交日期2011年5月 论文答辩日期2011年5月答辩委员会主席 _评 阅 人 _摘 要姜黄素（Curcumin，Cur）具有抗氧化、抗HIV病毒、清除自由基、抗菌等生理活性，1,10-菲啰啉（1,10-Phenanthroline Monohydrate，Phen）具有良好的水溶性和抗菌等生物活性，对生物体系的某些机能有干扰作用。将这两种具有生物活性的物质通过配位键与过渡金属结合，以期得到新型的目标化合物。本实验合成了过渡金属（Cu2+、Zn2+、）与姜黄素和1,10-菲啰啉的金属三元配合物（M-Cur-Phen）。本文通过元素分析、电导率测定、热差-热重分析、紫外-可见光谱、红外光谱对配合物的化学组成和结构进行了初步表征，结果表明所得姜黄素金属配合物均为1:1型电解质，组成为M-Cur-Phen。采用平板抗菌性试验法，测定了配体和配合物对大肠杆菌和金色葡萄球菌的抑菌圈直径，实验表明所合的这2种新型M-Cur-Phen三元配合物都表现出较好的抑制作用，且抑菌效果均强于配体姜黄素的，其中Zn-Cur-Phen对大肠杆菌和金葡萄糖球菌的抑菌能力较高。SOD活性的测定表明所合成的配合物均具有一定的SOD活性，其中Cu-Cur-Phen具有较大的SOD活性。同时用荧光法初步研究了配体及其金属配合物与牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）的相互作用以及温度对这一作用的影响，结果表明配合物对BSA的荧光淬灭是一个静态淬灭过程，且配合物的结合常数都大于配体Cur的，且淬灭常数随温度升高而减少，结合位点数n均约为1。配合物与DNA相互作用的电子光谱实验表明配合物与DNA之间存在弱的相互作用，其中Zn-Cur-Phen与DNA的结合常数Kb值最大，为9.22103 Lmol-1。此外，还进行了配合物与DNA作用的荧光光谱以及其粘度测定，推断出配合物与DNA的作用方式为插入结合。关键词：姜黄素 菲啰啉 三元配合物 抗菌活性 SOD活性 BSA 目 录1 前言11.1 姜黄素的性质及生物活性概况11.2 姜黄素配合物合成及研究方法21.2.1 具有抗氧化作用的姜黄素金属配合物21.2.2 具有抗肿瘤抗癌活性的姜黄素金属配合物31.2.3 具有抗病毒抑菌作用的姜黄素金属配合物41.2.4 具有杀虫活性的姜黄素衍生物61.3 姜黄素配合物的合成方法61.4 选题意义和工作思路62 材料与合成方法72.1 仪器72.2 药品82.3 姜黄素配合物Cur-Phen-M的合成82.4 配合物的表征92.4.1 摩尔电导率的测定92.4.2 红外光谱92.4.3 紫外-可见吸收光谱92.4.4 荧光光谱92.4.5 热重-热差分析92.5 配合物的抑菌活性的测定92.5.1 容器灭菌92.5.2 配合物溶液的制备102.5.3 琼脂培养基制备102.5.4 牛肉汤培养基制备102.5.5 菌种培养与接种102.5.6 琼脂平板抗菌性试验102.5.7 牛肉汤试管二倍稀释抗菌性实验112.6 配合物的SOD活性的测定112.6.1 空白反应液的配制112.6.2 SOD活性的测定方法112.7 配合物与BSA的相互作用112.8 配合物与DNA的相互作用142.8.1 配合物与DNA作用的电子光谱142.8.2 配合物与DNA作用的荧光光谱152.8.3 配合物与DNA作用的粘度测定153 结果与讨论153.1 M-Cur-Phen三元配合物的合成153. 2 配体与配合物的表征163.2.1 配合物的元素分析163.2.2 摩尔电导率测定163.2.3 红外光谱分析173.2.4 紫外-可见光谱183.2.5 荧光光谱193.2.6 差热（DTA）-热重（TGA）分析203.3 配合物抗菌活性213.4 配合物的SOD活性233.5 配合物与BSA的相互作用263.5.1 25下配合物与BSA的相互作用263.5.2 32下配合物与BSA的相互作用293.6 配合物与DNA的相互作用313.6.1 配合物与DNA作用的电子光谱313.6.2 配合物与DNA作用的荧光光谱323.6.3 配合物与DNA作用的粘度测定344 结论35致谢36参考文献37Abstract39附录401 前言1.1 姜黄素的性质及生物活性概况姜黄素（Curcumin，1,7-二（4-羟基-5-甲氧基）苯基-1,6庚二烯-3,5二酮），又称二阿魏酰基甲烷（Diferuloyl Methane），是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术等的根茎中提取的一种多酚类物质，其分子式为C21H20O6，分子量是368.39，1910年Lampe等首次阐明其化学结构1，如图1所示。图1 姜黄素的结构式姜黄素为橙黄色结晶粉末，味稍苦，水溶性差，在酸性和中性pH环境中几乎不溶，能溶于乙醇、冰醋酸、乙酸乙酯等有机溶剂中。其在碱性环境中呈深红色，容易分解；在酸性或中性条件下呈黄色。此外，姜黄素对还原剂的稳定性较强，对蛋白质的着色性强，但其耐光、耐热性较差。近年来，姜黄素除了被广泛用于食品加工外，在医药方面的应用更是日益显著，其结构与药理作用之间的构效关系成了许多学者的研究热点。姜黄素苯环上的酚羟基可以捕获或清除自由基，这使姜黄素成了一种天然的抗氧化剂。Kowluru2等研究显示姜黄素能明显阻止糖尿病导致的抗氧化能力减弱，延缓糖尿病视网膜病变的发展，其机制是姜黄素一直氧化DNA在视网膜的积聚和提高GSH（Reduced Glutathione Hormone，还原性谷胱甘肽）。姜黄素具有较高的抗炎活性，姜黄素分子能与炎症相关的分子靶标相互作用，通过协调COX-2、脂肪氧化酶、诱导型一氧化氮合酶的活性，抑制炎症细胞因子的产生，协调丝裂原活化蛋白激酶和Janus激酶的表达3。姜黄素可以作为一种抗肿瘤的活性药物，研究表明其主要作用基团是羟基和不饱和双键，能抑制多种肿瘤细胞的生长，抑制作用的机理主要与肿瘤细胞的凋亡有关，可能的途径主要有通过调控抑癌基因、癌基因及其蛋白的表达、诱导细胞周期停滞以及调控细胞凋亡信号等4。现已证明姜黄素还具有抗纤维化、抗动脉粥样硬化、抗HIV活性、抗真菌、抗微生物、利胆、保护皮肤、抗溃疡、抗风湿、抗低血压、低胆固醇以及抗老年痴呆症等广泛的药理作用。1.2 姜黄素配合物合成及研究方法姜黄素作为从天然植物中提取的中药成分，具有广泛的药用效果。此外，姜黄素的成本低廉、毒性低、副作用小等特性使其在医药方面存在更大优势，这使得姜黄素具有良好的开发前景和广阔医疗应用价值。但姜黄素在体内的活性偏低、体内吸收差、代谢过快、生物利用率降低，极大地限制了其应用领域。姜黄素确切的生物活性以及相对简单的分子结构使其成为一种优秀的结构修饰先导化合物5。因此，在保持姜黄素原有药效的基础上合成新的姜黄素衍生物来，以增加其活性和提高其溶解度为目的的研究吸引了许多药物研究机构和公司的关注。由于姜黄素作用基团较多，采用的配体和被修饰的基团、结构不同，所以今年来姜黄素的衍生物可谓层出不穷。目前对姜黄素的修饰主要集中在以下几个活性基团上：1，7-位芳香环的改变、环上取代基位置和种类变化；-二酮结构的改变、4-位亚甲基上的取代。这种结构修饰方法对有机合成的要求高，而且产率较低，产生的废液较多，而通过配位合成来获得具有良好生物活性的配合物的方法不仅简单、高产率，而且能够有效地保持配体生物活性，甚至性能更加优良和丰富。目前，已有少量文献报道了一些姜黄素金属配合物的合成与性质研究。1.2.1 具有抗氧化作用的姜黄素金属配合物Barik6等分别以11，12的比例合成了两种铜（）-姜黄素络合物，对产物进行一系列测试，结果发现比例为11的铜（）-姜黄素配合物具有较强的自由基中和能力和抗氧化能力，且具有更好的SOD模拟物活性，5 g该配合物的氧化活性与1单位的SOD相当。结构如图2所示。图2 两种铜（）-姜黄素络合物Sumanont7等合成了二乙酰基姜黄素（Diacetylcurcumin）、姜黄素-锰络合物（CpCpx）以及二乙酰基姜黄素-锰络合物（AcylCpCpx），结果表明络合物均以剂量依赖方式发挥清除NO自由基作用，后两者抗氧化活性均高于母体姜黄素。此外，Vajragupta8等发现锰络合物对大脑油脂过氧化显示出极好保护作用（IC50为6.326.3 mmol/L），二乙酰基姜黄素和姜黄素-锰络合物比姜黄素表现出更高的抑制H2O2引起细胞损害的活性，对细胞表现出明显的保护作用。结构如图3所示。 图3 姜黄素-锰和二乙酰基姜黄素-锰络合物1.2.2 具有抗肿瘤抗癌活性的姜黄素金属配合物陈莉敏9等以姜黄素为配体合成其乙酰丙酮氧钒、锌、铜、锡的配合物，通过红外、紫外光谱及元素分析对配合物进行表征，并对其体外抗肿瘤活性进行测试，结果显示多个配合物对肿瘤K562，HL-60细胞有效，部分配合物表现出较强的抗癌活性。结构如图4所示。 图4 姜黄素-钒配合物刘剑敏10等为提高姜黄素的抗癌活性和选择性，从几种氨基酸出发，经过马来酸活化后与姜黄素结合，得到单取代的四个酯化产物，用MTT染色法对合成的衍生物进行体外抗肿瘤评价，结果显示化合物对胰腺癌细胞株SW-1990和膀胱癌细胞株T24有较强的抑制作用，结构如图5所示。图5 姜黄素氨基酸酯化产物John11等发现铜与姜黄素螯合形成衍生物可增强其抗肿瘤活性，实验资料表明姜黄素IC50为10 g/mL,而铜螯合物IC50 1 g/mL,显著高于其母体化合物抑制活性。体内试验亦证明姜黄素铜螯合物能显著延长荷瘤动物生命存活率，缩小鼠实体瘤体积。1.2.3 具有抗病毒抑菌作用的姜黄素金属配合物朱早龙12等以稀土硝酸盐作为模板，用1,6-己二胺、乙二胺和姜黄素为原料，在乙醇溶液中合成了8种稀土姜黄素大环配合物REL1L2（NO3）34H2O（RE=Eu、Dy、Sm、Ce），通过各种表征实验推测其结构式，如图6所示，后进行抑菌实验，结果表明8 种配合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌均有微弱的抑菌性能, 且强于单体姜黄素，这说明稀土离子对姜黄素的生物活性有一定的促进作用。图6 稀土姜黄素大环配合物Kumar13等将姜黄素和菌壁成分尿嘧啶、核苷等生物分子共价结合，合成了生物偶合剂双氨基乙酰姜黄素（）、双氨基乙酰-C4-甘氨酰姜黄素（）、姜黄素钠盐（）、5-脱氧-5-胸苷姜黄素（）以及2-脱氧-2-尿苷姜黄素（），结构表明、能有效的抑制多重耐药菌，部分结构如图7所示。图7 部分姜黄素生物偶合剂Mishra14等为提高姜黄素的利用率，将姜黄素和甘氨酸、胡椒基、葡糖等生物小分子结合形成共轭分子，对产物进行对多种细菌和真菌的抑制作用检测，结构显示所合成共轭分子能有效抑制多种微生物。许军鹏15等合成了稀土与Cur和Phen的稀土三元配合物与稀土-姜黄素二元配合物，抗菌活性实验结果表明，稀土三元配合物对所选菌种的抑菌性明显强于二元配合物和姜黄素，结构如图8所示。图8 稀土与Cur和Phen的稀土三元配合物与稀土-姜黄素二元配合物1.2.4 具有杀虫活性的姜黄素衍生物邹怀波16等利用姜黄素分子结构中固有的两个羰基，结合肼类化合物易于与其进行亲核加成的特点，通过控制条件，得到姜黄素与2,4-二硝基苯肼的缩合产物，结果表明产物对朱砂叶螨的生物活性远大于母体姜黄素。1.3 姜黄素配合物的合成方法文献15中合成三元配合物的方法是：先制备稀土硝酸盐RE（NO3）36H2O，用无水乙醇溶解待用；称取姜黄素0.3 mmol装入50 mL烧杯中，加入10 mL无水乙醇，在40水浴加热、搅拌20 min后完全溶解，缓慢滴加浓度为0.1 molL-1的稀土硝酸盐溶液1.0 mL（0.1 mmol）,再加入0.1 mmol 1,10-菲啰啉，再加入0.3 mmol三乙胺调节溶液（pH=6.5-7.0）,继续搅拌、回流2 h，然后自然冷却至室温。将反应液真空抽滤，所得沉淀用无水乙醇洗涤3遍，再次真空抽滤，将所得配合物真空干燥。1.4 选题意义和工作思路研究表明姜黄素具有许多生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗炎症、抗毒抑菌等，此外还有较强的光学性质，且毒性小价格便宜，对其结构进行修饰以提高其生物活性已成为相关学科的研究热点。而国内外关于过渡金属的姜黄素二元配合物已有所报道，报道指出此类配合物有很好的抗氧化和抑菌活性。菲啰啉的水溶性好，在药物合成中经常使用，其与蛋白质和DNA有较强的结合作用，具有较强的杀菌效果，可增溶曾敏，与金属形成的配合物具有电活性和吸附性。目前关于姜黄素的三元配合物鲜见报道，如稀土与Cur和Phen的稀土三元配合物的抗菌活性明显强于稀土-姜黄素二元配合物15，但尚未见过以渡金属离子作为中心原子的姜黄素三元配合物的文献报道。我们认为若在在姜黄素的二元过渡金属配合物的基础上引入一种水溶性好，具有良好生物相容性的第二配体，如Phen，不仅会有效改善姜黄素金属配合物的药用性能，提高药物的安全性，而且会对配合物的生物活性具有一定的促进作用。基于所选用的配体的生物活性和生物相容性及过渡金属的化学和生物性能，预期得到具有良好理论价值和应用价值的研究结果，为姜黄素类金属配合物在抗菌药物、SOD模拟酶、及医疗用药等方面的应用提供一定的参考，促进新型的高效低毒的姜黄素类药物的开发和应用。本文合成了姜黄素-菲啰啉-金属三元配合物（Cu-Cur-Phen、Zn-Cur-Phen），并由元素分析、电导率、红外光谱、紫外-可见吸收光谱、差热-热重分析等对其进行结构表征、采用琼脂基滤纸片法和二倍稀释法研究配合物的抗菌活性、采用改进的氮蓝四唑光照法17测定SOD活性、采用荧光淬灭法研究配合物与BSA的相互作用，采用紫外-可见光光谱（UV-vis）、荧光光谱以及粘度法研究配合物与DNA的相互作用，为配合物作为抗菌药物、SOD模拟酶、及医疗用药等方面的应用提供有价值的实验依据，有利于促进新型的高效低毒的姜黄素类药物的开发和应用。2 材料与合成方法2.1 仪器表1 主要实验仪器仪器名称生产厂家FT-IR型红外光谱仪（KBr压片）美国Nnicolet公司Vario EL元素分析仪ELEMENTAR公司UV-2550紫外可见分光光度计日本岛津Shimadzu公司RF-5301PC荧光分光光度计日本岛津Shimadzu公司TA-60WS型差热热重分析仪日本Shimadzu公司721型分光光度计上海精密科学仪器有限公司YXQ-SG46-280S不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器上海博弈实业有限公司医疗设备厂恒温恒湿培养箱广东省医疗器材厂SW-CJ-TA洁净工作台上海博弈实业有限公司医疗设备厂HK-ID型恒温水槽南京南大万和科技有限公司乌氏粘度计上海申谊玻璃制品有限公司2.2 药品表2 主要实验试剂名称纯度生产厂家姜黄素分析纯国药集团化学试剂有限公司1,10-菲啰啉分析纯广州牌化学试剂一水合乙酸铜分析纯广东光华化学厂有限公司乙酸锌分析纯广州化学试剂厂二甲基亚砜分析纯广东光华化工厂有限公司无水乙醇分析纯国药集团化学试剂有限公司磷酸二氢钠分析纯天津市津沽工商实业公司氢氧化钠分析纯天津市津沽工商实业公司四甲基乙二胺分析纯广州威佳科技有限公司氯化硝基四氮唑蓝生化试剂国药集团化学试剂有限公司核黄素生化试剂上海伯奥生物科技有限公司MH琼脂生化试剂广东环凯微生物科技有限公司MH肉汤生化试剂广东环凯生物科技有限公司牛血清白蛋白生化试剂上海伯奥生物科技有限公司氯化钠分析纯广东台山粤桥试剂塑料有限公司三羟甲基氨基甲烷生化试剂上海伯奥生物科技有限公司盐酸分析纯广州市东红化工厂鱼精DNA生化试剂Sigma公司溴化乙锭生化试剂Aldrich公司2.3 姜黄素配合物Cur-Phen-M的合成称取0.50 mmol姜黄素和0.50 mmol 1,10-菲啰啉于50 mL锥形瓶1中，加入20 mL 95%乙醇，控制温度在66左右搅拌，完全溶解后待用；称取0.50 mmol金属盐（一水乙酸铜、乙酸锌）于锥形瓶2中，加入5mL 95%乙醇搅拌溶解；把完全溶解的金属盐醇液缓慢滴加入锥形瓶1中，搅拌反应2h，静置，瓶底出现较多固体，抽滤，用95%乙醇进行多次洗涤，真空干燥，得产品。2.4 配合物的表征2.4.1 摩尔电导率的测定每个样品用电子天平分别称5 mg，加入25 ml二甲亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）溶解，待测。铂黑电导电极在使用前用去离子水泡浸过夜，使用时先用10%的HNO3泡浸2分钟，使其活化，再用去离子水冲洗。用双蒸水配制0.02 molL-1的KCl标准溶液100 mL，将电极接好后插入上述KCl标准溶液，调整温度旋钮至室温，然后将旋钮调至“测量”，在20 mS档调常数旋钮，使读数显示为电极的标准电导率（2.765 mScm-1），则常数调校完毕。然后逐个测定样品的电导率，计算其摩尔电导率。2.4.2 红外光谱粉末样品采用KBr压片法制备，用360 FT-IR型红外光谱仪测定配合物在4004000 cm-1范围内的IR谱。2.4.3 紫外-可见吸收光谱用DMSO溶解样品，浓度为10-5 molL-1数量级，DMSO做参比，于UV-Vis 4000型紫外-可见分光光度计上扫描200 nm800 nm紫外-可见吸收光谱。2.4.4 荧光光谱用DMSO溶解样品，浓度为10-5 molL-1数量级。所有操作均在室温下，于RF-5301PC型荧光光谱仪上进行，扫描速度为快速、狭缝宽度为5 nm。在220 nm530 nm范围作激发扫描，得到各物质的最大激发波长ex；然后在各物质的ex下，于480 nm600 nm范围作荧光发射扫描，得到各物质的最大发射波长em，并记录各样品的荧光发射谱图。2.4.5 热重-热差分析差热热重分析在氮气气氛中进行，以Al2O3为参比，以10/min的加热速度从室温加热至800。2.5 配合物的抑菌活性的测定2.5.1 容器灭菌将实验所需的500 mL锥形瓶，培养皿，硅胶塞，100 mL量筒，10 mL量筒，50 mL锥形瓶，大试管，小试管，涂布器，接种环，镊子，胶塞，直径为6 mm的滤纸，1000 L和200 L移液枪枪头，分别用报纸包好、橡皮筋绑好，置于灭菌釜中，在0.10.15 MPa的压力下，灭菌30 min。灭菌后取出，置于无菌操作台上备用。2.5.2 配合物溶液的制备称取5 mg所用药品以及参照样品溶于10 mL DMSO溶液中，贴上标签，并用保鲜膜密封好，置于超净操作台上，并于紫外灯下照射30 min。2.5.3 琼脂培养基制备称取水解酪蛋白胨（MH）琼脂3.80 g，溶于100 mL蒸馏水中，塞好硅胶塞，用报纸包好，扎紧置于灭菌釜中，于0.10.15 MPa的压力下，灭菌30 min。用已灭菌的10 mL移液管趁热分别移取10 mL上述已灭菌的液态琼脂培养基于培养皿中，使液体琼脂平铺培养皿底部，冷却成冻状后，盖好。倒置于培养箱中，于37.5 培养24 h，检视无菌后，用保鲜袋包好，置于冰箱中待用。用已灭菌的10 mL移液管趁热分别移取5 mL上述已灭菌的液态琼脂培养基于试管中，倾斜放置试管，冷却后得到斜面培养基，在酒精灯火焰上微烧管口，塞上硅胶塞置于培养箱中，于37.5 培养24 h，检视无菌后备用。2.5.4 牛肉汤培养基制备取2.70 g牛肉汤粉，加热溶于100 mL蒸馏水中，然后塞好硅胶塞，用报纸包好，扎紧置于灭菌釜中，于0.10.15 MPa的压力下，灭菌30 min。2.5.5 菌种培养与接种分别将大肠杆菌和金色葡萄球菌，接种前将斜面培养试管贴上标签，注明菌种名称、接种日期，接种人等等。将接种环在火焰上灼烧灭菌，使菌种试管口靠近火焰旁，拔出试管硅胶塞，将试管口在火焰上微烧，烧死外部污染的杂菌。将刚灼烧过的接种环伸入菌种管内，轻轻刮取一环菌体，慢慢将接种环移出试管，迅速在火焰旁伸进新鲜斜面培养基中，轻轻地在斜面上来回涂抹均匀。微烧管口，塞上硅胶塞，并再次灼烧接种环灭菌。按上述方法接种好大肠杆菌和金色葡萄球菌，斜面培养试管贴上标签，注明菌种名称、接种日期，接种人。将接种好的菌种在37.5 的培养箱中培养24 h，取出后观察菌落均匀，无杂菌等异常现象。在2只大试管中分别移入10 mL的肉汤，用灭菌环取一环培养好的大肠杆菌和金色葡萄球菌分别摇入肉汤中，培养试管贴上标签，注明菌种名称。把已接种的肉汤放入恒温培养箱中于37.5 培养24 h，肉汤呈现浑浊。2.5.6 琼脂平板抗菌性试验取出制备好的琼脂平面皿在无菌操作台上开紫外灯杀菌30 min后关掉。在无菌操作台上，用移液枪移取0.20 mL肉汤菌种（108 CFU）在上述待用的琼脂平板上，用已灭菌的涂布器转圈涂匀。分别将大肠杆菌和金色葡萄球菌两种菌种接种5个平板。用灭过菌的镊子取直径为6 mm的小滤纸片10片，分别投入装有10 L药液（2种配合物）和参照样品（DMSO溶液、姜黄素单体、1,10-菲罗琳）的小瓶中。当滤纸被完全浸润后，用镊子在溶液中取出，放在菌落均匀的培养基上。将四种配合物和其余参照样品（DMSO溶液、姜黄素单体、菲罗琳）的滤纸片分别（两种配合物用1个平面皿、其余参照样品用1个平面皿）放入同一个培养皿中（每种物质两片），标好标签。把贴有小滤纸片的培养皿倒转置于恒温恒湿培养箱中培养24 h，然后观察抗菌效果，并记录抑菌直径（mm）。2.5.7 牛肉汤试管二倍稀释抗菌性实验 往试管（每种配体与配合物为一组，每组8支试管）中加入1.0 mL的牛肉汤（第一支加入1.5 mL），于每组的第一支试管中加入0.5 mL浓度为5 mg/10 mL的配体及配合物溶液，混合均匀，接着依次取1.0 mL该试管中的溶液加入至下一支试管中，如此便得到浓度依次为的一组试管，往每支试管中加入50 L稀释至106 CFU的菌液，塞上胶塞，摇匀，置于恒温恒湿培养箱中培养24 h，然后观察抗菌效果。2.6 配合物的SOD活性的测定2.6.1 空白反应液的配制用磷酸缓冲溶液分别配制以下溶液各50 mL，氯化硝基四氮唑蓝（Nitrotetrazolium Blue Chloride，NBT）浓度为27.9610-5 molL-1，核黄素(Vitamin B2，VB2)浓度为20.410-6 molL-1，四甲基乙二胺浓度为3.010-4 molL-1，称取时避免强光。使用时取上述三种液体各1 mL混合均匀配成空白反应液。2.6.2 SOD活性的测定方法本文采用改进的VB2光还原NBT法检测模型化合物的SOD活性。先将盛有3.0 mL空白反应液且光径为1 cm的比色皿置于温度恒定在25的水浴中。并控制光强为55000500 lux，待光强稳定后对比色皿进行照射，第一次照射60 s，以后每次照射30 s，测定560 nm下吸光度值A560。然后测定配合物溶液的A560值。2.7 配合物与BSA的相互作用血清白蛋白在紫外光照射下能发出荧光，是因为在它的结构中含有三种芳香族氨基酸：色氨酸（Tryptophan，Trp）、酪氨酸（Tyrosine，Tyr）及苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe）。Phe的疏水作用很强，而Tyr及Trp则由于侧链中带有极性基团，疏水作用较差，在高pH值环境中，Tyr的酚基甚至还能解离出H+。虽然Tyr有一定的亲水作用，但酚基可参与形成氢键且较强，故也常出现在分子内部。由于它们具有不同的发光团，在一定条件下，它们发射出的荧光强度是不同的。Phe的荧光往往不易观察到。而Trp与Tyr常常作为蛋白的内源荧光探针。天然蛋白质的内源荧光主要表现为分子内Trp残基的发射，Tyr残基发射的荧光强度相对较弱主要归因于Tyr残基与Trp残基之间的能量转移。在BSA溶液中，随着小分子配合物浓度的增加，BSA荧光发射峰强度有规律的降低，说明小分子配合物对BSA的内源荧光有淬灭作用。荧光淬灭机制通常可分为动态淬灭灭、静态淬灭等15。动态淬灭是指淬灭剂在荧光寿命期间扩散至荧光物且相互作用而导致荧光物由激发态返回到基态，不发射光子，其淬灭常数随温度升高而增大；静态淬灭是由于淬灭剂和荧光物质发生了配合反应，形成了不发荧光的配合物引起的，其淬灭常数随温度升高而减小。配合物Q对BSA荧光淬灭过程若为动态淬灭，则其作用过程应遵循Stern-Volmer方程：F0 /F = 1 + KSV Q = 1 + kq0 Q （式1）式中， F0、F为加入配合物前后BSA溶液的荧光发射强度，Q为配合物的浓度（molL-1）。KSV为Stern-Volmer淬灭常数（Lmol-1），kq为由扩散控制的双分子动态淬灭速率常数（Lmol- 1s- 1），0是内源生物大分子的荧光寿命，通常取0=10- 8 s。因而可以求得kq（而各类淬灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞淬灭常数为2.01010 L mol-1s-1）。根据实验数据，如果所研究的配合物对BSA的荧光淬灭过程是动态淬灭，按照Stern-Volmer方程，以F0 /F对Q作图，根据此直线斜率即可得到Ksv，而Ksv = kq0，就可以得到淬灭速率常数kq。但这里用Q的总浓度Qt，代替游离浓度Q，显然这是一种近似。对于静态淬灭过程，假设蛋白分子具有n个独立且相同的结合位点，也就是说，每一个结合位点与药物结合的能力是相同的。配合物分子Q与蛋白分子P的反应是 P + n QQnP （式2）QnP是形成的新的复合物分子，它的结合常数是KA。该可以看作是一个总反应，则其每一步反应可以表示为 Q+PQP （式3） QP+QQ2P （式4） Q2P+QQ3P （式5） Qn-1P+DQnP （式6）对于上述分步反应的结合常数分别为KA1，KA2，KA3，KAn-1与KAn，那么 （式7）因为假定在蛋白中有相同且独立的结合位点n，所以KA1= KA2= KA3= = KAn-1=KA （式8）则 （式9）假设只有当配合物同时与所有的结合位点（n个结合位点）都结合时，蛋白的荧光才会发生淬灭，而如果蛋白的荧光未被淬灭，即使生成了QP、Q2P、Q3P、Qn-1P复合物，则仍然认为蛋白P或药物Q都是自由的。所以，Qt = Qf + nQnP，Pt = Pf + QnP，又根据F0/F=P t/ P f，可得到下列方程： （式10） （式11） （式12）将式（11）-（12）代入到式（10）中，得到 （式13）两边取对数后得到 （式14）为了运算方便，假设上式括号中的n值为1，可以得到如下形式的公式： （式15） 根据不同浓度的药物得到的不同的荧光强度值，绘制lg（F0F）/F）关于lg（Qt - P t（F0F）/F0）的曲线，通过直线的斜率和截距求得n和KA值，若求得的n值近似为1，则认为我们的假设是合理的。当在280 nm激发BSA时，在约340 nm处的最大荧光发射峰为Trp的贡献，而在315 nm附近的较低强度的荧光发射峰为Tyr的贡献。因此，Trp是BSA的最灵敏的内源荧光探针。实验中，我们主要考察340 nm附近的荧光性质的变化。实验方法：采用缓冲体系为50 mmolL-1 NaCl，5 mmolL-1 Tris-HCl的溶液，pH为7.2。BSA（CBSA =1.010-5 molL-1）与不同浓度配合物（C配合物/CBSA =0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2）混合，25下反应30 min。然后测定不同摩尔比的配合物与BSA作用后，在激发波长为280 nm, 缝宽为3.0 nm，高灵敏度、快速扫描的条件下，于RF-5301荧光分光光度计上记录290450 nm 波长范围内的发射光谱。32配合物与BSA的相互作用实验操作同上。2.8 配合物与DNA的相互作用2.8.1 配合物与DNA作用的电子光谱采用缓冲体系为50 mmolL-1 NaCl，5 mmolL-1 Tris-HCl的溶液，pH为7.2。配合物（C配合物=510-5 molL-1）与不同浓度DNA（CDNA/C配合物=0,1 ,2 ,4 ,6 ,8 ,10 ,12）混合，室温下反应30 min。然后以不同浓度DNA溶液做参比，测定不同摩尔比的配合物与DNA作用后在200500 nm区间内的紫外吸收光谱。也可采用如下实验方法：往空白池和样品池中分别加入3 mL Tris-HCl/NaCl缓冲溶液和0.03 mmolL-1配合物溶液，在210400 nm范围内扫描。每次往空白池和样品池中加相同体积的DNA溶液，使DNA与配合物的浓度比值不断增加。本论文采用前一种试验方法。通过DNA对配合物的电子光谱滴定实验，能够根据以下方程式（式16）求得配合物与DNA的结合常数18：CDNA/（a-f）=CDNA/（b-f）+1/Kb（b-f） （式16）其中，CDNA表示DNA的浓度，a、f和b分别表示Aobsd/Ccomplex、自由配合物的摩尔吸光系数和完全结合后的配合物的摩尔吸光系数（选取配合物最大吸收波长处的吸光值，270 nm），以CDNA/（f-a）对CDNA作图，斜率与截距的比值即为配合物与DNA的结合常数Kb。2.8.2 配合物与DNA作用的荧光光谱溴化乙锭（EB）其自身荧光较弱，但当其插入双螺旋DNA内的碱基之间时，荧光强度显著增强，当EB从DNA中脱离出来时，荧光又会显著减低，所以EB可作为DNA结构的荧光探针。我们通过Stern-Volumer方程（式17）可求得配合物取代EB与DNA作用的淬灭常数Ksq19: I0/I=1+Ksqr (式17)其中，I0和I分别表示不存在和存在配合物时，EB-DNA体系的荧光强度，r表示配合物与DNA的浓度比。Ksq值与相互结合的EB和DNA的浓度有关，成线性关系。我们以I0/I对r作图得到一条直线，直线的斜率即为Ksq。 实验方法：采用缓冲体系为50 mmolL-1 NaCl，5 mmol/L Tris-HCl的溶液，pH为7.2。体系中EB和DNA的浓度皆为510-6 molL-1.，EB、DNA与不同浓度的配合物（C配合物/CDNA=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6）混合物，室温下反应30 min，然后以525 nm为激发波长，测定不同浓度配合物/DNA/EB体系在500700 nm区间内的荧光光谱。2.8.3 配合物与DNA作用的粘度测定粘度的测定被认为是在缺乏晶体数据的情况下确定键合模式的一个有力证据。温度恒定在25，增大配合物与DNA的比例，通过相对粘度公式（式18）计算粘度： =（t-t0）/t0 (式18)其中，t0为缓冲液流经毛细管所需时间，t为DNA溶液（含浓度不等的配合物）流经毛细管所需时间。以(/0)1/3对CCu/CDNA(0为未加配合物时DNA溶液的相对粘度)作图即为DNA相对粘度随配合物加入量的变化趋势。实验方法：采用缓冲体系为50 mmolL-1 NaCl，5 mmolL-1 Tris-HCl的溶液，pH为7.2。DNA溶液（CDNA=110-4 molL-1）与不同浓度的配合物（C配合物/CDNA=0.025, 0.005, 0.075, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25）混合，温度恒定在（250.1）反应过夜，利用乌氏粘度计测定其粘度。3 结果与讨论3.1 M-Cur-Phen三元配合物的合成本实验为小规模合成，实验过程中的过滤、洗涤、干燥等操作对产品造成了一定的损失，从而降低产率。配合物的产量和产率列于表3中，从表3中的产率来看，配合物的产率皆高于60%。所得到的最终产物均为粉末状，滤液蒸去部分溶剂静置后亦无晶体析出，可见配合物的合成方法还有待改善。配合物均难溶于水、乙醇、及DMF，能溶于DMSO。表3 M- Cur-Phen系列配合物配合物颜色质量（g）产率（%）Cu-Cur-Phen深紫红色粉末0.276071.86Zn-Cur-Phen橙红色粉末0.248763.263. 2 配体与配合物的表征3.2.1 配合物的元素分析配合物的元素分析结果列于表4，C、H、N百分含量的实验结果与理论计算值相符，说明本文合成的配合物的纯度符合要求。根据元素分析结果推测配合物中Cur:Phen:M组成比例为1:1:1。表4 配合物的CHN的元素分析结果化合物组成理论分子量元素分析（计算值）CHNCu-Cur-PhenCuC35H32N2O9688.261.44 （61.08）4.778 （4.687）4.032 （4.071）Zn-Cur-PhenZnC35H34N2O10708.159.19 （59.37）4.624 （4.840）3.843 （3.956）3.2.2 摩尔电导率测定室温下，测定配合物在DMSO溶液中的电导率，结果见表5。从表5中看出，配合物电导率均在90105 Scm2mol-1 范围内，较所有配体的电导率都高，表明配合物在DMSO溶液中都属于电解质。结合元素分析结果可初步认为乙酸根离子是在外界结合形成1:1型电解质。表5 配合物在DMSO溶液中的电导率化合物摩尔电导率/（Scm2mol-1）电解质类型Phen3.85非电解质Cur6.30非电解质Cu-Cur-Phen1021:1型电解质Zn-Cur-Phen95.21:1型电解质3.2.3 红外光谱分析 通过测定配体和配合物的红外谱图，比较特征峰的位移以及新峰的生成情况，可以判断出配体是否与金属配位以及确定配位位点，表6给出了配体及金属配合物的主要吸收峰频率。自由配体Cur在1628 cm-1出现的是烯醇式异构体中C=O振动吸收峰，这说明Cur中的两个羰基通过分子内氢键形成六元环。金属配合物的红外光谱图中，此振动吸收峰皆向低波数位移，在16201622 cm-1处出现较强的C=O振动吸收峰，这是因为羰基与金属离子螯合成环后，使环上电子云向金属离子转移、电子云平均化，致使C=O键振动减弱，发生红移；在656688 cm-1范围内出现了M-O伸缩振动峰，说明Cur分子中的C=O基团与金属成功配位；且Cur分子C=C振动吸收峰也向低波数位移了约10 cm-1，在15861589 cm-1范围内出现C=C吸收峰，说明金属离子与去掉烯醇式H的羰基氧和烯醇氧同时配位，形成螯环。另一配体Phen在1587 cm-1处出现C=N伸缩振动峰，在739 cm-1为C-H面外弯曲振动峰，1559 cm-1为苯环上的C=C伸缩振动峰。在配合物红外谱图中，C-H变化明显，向低波数位移了约1420 cm-1，C=N向低波数位移了80 cm-1左右，这是由于配位后，氮原子上的电子云向金属离子转移，电子云密度降低，C=N键减弱，致使C=N发生红移；同时由于整个Phen芳环上的电子云密度降低，使得C-H也向低波数位移；另外在542562 cm-1处出现M-N伸缩振动。这些说明配体Phen的两个氮原子与金属离子呈双齿配位，形成螯环。表6 配体及配合物的主要IR特征吸收频率（cm-1）化合物PhenCurvC=NvC=C苯环C-CC-HvO-H苯环vC=CvC=OvC-O酚vC-OCH3OC-H苯环）vM-OvM-NCur34131597,1508,1426162812821029959Phen15871559,1502,1419852739Cu-Cur-Phen15101589,1510,140084872333921589,1510, 1400162012821026993662542Zn-Cur-Phen15091586,1509,141884272534311586,1509, 14181622128510289766885623.2.4 紫外-可见光谱室温下，测定了配合物和配体的DMSO溶液中在200800 nm范围内的紫外-可见光光谱（UV-Vis），见图9，各吸收峰峰位及相应的摩尔吸光系数列于表7。Cur和Phen在264 nm处均有一个强吸收峰，这分别属于Cur和Phen的*跃迁所致，而在配合物的紫外谱图中，该处的强吸收峰略微发生红移，且强度较配体的强；Cur在436 nm处有一个强吸收峰，同样归属于姜黄素的 * 跃迁，形成配合物后，此峰出现一定蓝移，且强度降低；不同于配体的是，配合物在450 nm左右出现了一个新的吸收峰，这可归属于姜黄素与金属离子之间的电荷转移所致。不同金属离子形成的配合物在436 nm左右的吸收峰强度的大小顺序为：Zn（）Cu（） 。总之，与配体比较，配合物的紫外-可见吸收峰的位置和强度都有所改变，且有新吸收峰形成，这些吸收峰值大小与浓度有关，这表明金属离子与配体Cur和Phen之间确实存在键合作用。表7 化合物在DMSO溶液中的电子光谱配体及配合物* /（nm）LM /（nm）1/104 Lmol-1cm-12/104 Lmol-1cm-13/104 Lmol-1cm-1Cur264（1.10）436（4.35）Phen264（3.77）Cu-Cur-Phen270（4.81）437（3.03）460（2.84）Zn-Cur-Phen266（4.05）430（4.02）452（3.58） 图9 姜黄素及金属配合物的紫外-可见光谱3.2.5 荧光光谱在配合物各自最大激发波长下进行荧光扫描，得到它们的荧光发射谱图，见图10。配体和配合物的最大激发波长（ex）和最大发射波长（em）及510-6 molL-1浓度下的最大荧光强度列于表8。比较配合物和Cur的ex和em，可以看出配合物的ex和em较Cur的出现不同程度的蓝移；所有配合物的em基本相同，且与Cur的em值接近，说明配合物的em都是来自配体Cur的特征发射，且配合物的荧光主要来自配体Cur的 -* 跃迁产生的；另外从荧光强度来看，配合物的荧光强度均较配体Cur的有不同程度的降低。这些说明有配合物的生成。图10 配体及配合物的荧光光谱图表8 510-6 molL-1浓度下各化合物的荧光光谱数据化合物 ex/nm em/nm最大荧光强度Cur462531991Phen373420187Cu-Cur-Phen36852