人血小板冻干前负载海藻糖技术的研究.doc

人血小板冻干前负载海藻糖技术的研究 作者：卢发强，刘景汉，欧阳锡林，李锡金，周俊，庄远【摘要】 为研究人血小板冻干前负载海藻糖技术与方法，筛选出最佳负载海藻糖实验条件并进一步研究血小板在温度37条件下、 负载海藻糖4小时后的平均体积、体外激活程度和聚集反应性的变化，绘制血小板胞内海藻糖负载效率及浓度随温度、时间、胞外海藻糖浓度变化曲线，筛选合适的负载条件，分别以凝血酶、ADP、胶原、瑞斯托霉素4种物质作为血小板激活诱导剂，用血小板聚集仪分别检测血小板负载海藻糖前后的聚集反应性，用流式细胞仪检测分析血小板负载海藻糖前后其膜表面糖蛋白分子CD62p、PAC-1的表达率，加可逆性激活抑制剂PGE-1、腺苷后血小板激活被抑制的程度。结果表明：海藻糖负载效率与孵育时间（2小时后）、温度（30-40）呈良好线性关系，在37条件下经4小时孵育后负载效率可达60%，载入到胞内海藻糖浓度随胞外海藻糖浓度（50 mmol/L的升高而递增；同负载前相比较，血小板平均体积（MPV）、血小板对4种激活诱导剂的最大聚集率均无显著性差别（P>0.01），经4小时负载海藻糖后血小板膜表面CD62p表达率升高，但联合添加可逆性激活抑制剂PGE-1、腺苷后CD62p表达率显著下降。结论： 37、4小时、胞外海藻糖浓度小于50 mmol/L为合适负载条件，添加可逆性血小板激活抑制剂后，冻干前负载海藻糖过程对血小板的体外激活和聚集活性没有显著影响。 【关键词】 海藻糖Process of Human Platelets Loaded with Rehalose before Lyophili-zationAbstract The aim of this research was to study the technology and methods of loading lyoprotectant-trehalose into cytoplasm of human platelets before lyophilization，to optimize experimental conditions of loading trehalose，to investigate the changes of platelets response to agonists and activation after incubation of platelets for 4 hours at 37 in the presence of lyoprotectant-trehalose，to protract the figures of loading efficiency and intracellular trehalose concentration versus incubation time，temperature and external trehalose concentration，to optimize loading parameters. The response of platelets to different agonists thrombin，ADP，collagen and ristocetin were measured respectively by APACT2 aggregometer before and after loading trehalose into platelets；the expressions of CD62p and PAC-1 on platelet membranes in the presence and absence of reversible platelets activation inhibitors were measured by flow cytometry respectively before and after loading trehalose into cytoplasm of platelets. The results showed that the loading efficiency was linear to incubation time (2 hours later) and incubation temperature (rang from 30 to 40)，respectively. The loading efficiency almost reached 60% when the platelets were incubated at 37 for 4 hours. The intracellular trehalose concentration was higher with the increase of the extracellular trehalose concentration（50 mmol/L. Compared to untreated groups，the values of MPV and aggregation to different agonists in treated groups showed no significant difference，respectively (P>0.01). After incubation of platelets for 4 hours，the expression of CD62p increased to some extent，however，the expression of CD62p decreased again when the reversible platelets activation inhibitor PGE-1 and adenosine were added to the incubation buffer. It is concluded that 37，4 hours and the extracellular trehalose concentration <50 mmol/L are the optimal conditions for loading with trehalose. The processing of loading with trehalose before platelet lyophilization has no significant effects on response of platelets to agonists and activation.Key words trehalose；freeze dried platelets；Platelets activation；Aggregation；reversible activation inhibitors血小板有效负载海藻糖至胞内是血小板冻干保存的重要环节1。冻干保护剂海藻糖是一种分子量较大的非还原性二糖，血小板胞膜对其是非渗透性的2，3，如何克服细胞膜的非渗透性而有效将海藻糖载入到血小板胞内是目前国内外学者研究的重点和热点，Wolkers等2发明了一种简便有效的将海藻糖负载到血小板胞内的方法液相内吞方法。本研究在此实验方法的基础上作了进一步的探讨和研究，筛选出负载海藻糖技术的最适实验条件，同时附带实验研究了血小板冻干前负载海藻糖过程对其体外聚集反应性和激活程度的影响。为此，我们既做了反映血小板主要功能活性的实验聚集实验，同时也做了反映血小板体外激活程度的实验流式细胞术测定血小板膜糖蛋白分子表达实验。现将血小板冻干制备必经步骤胞内海藻糖负载技术的系列实验研究结果报告如下。材料和方法浓缩血小板来源全部标本均来自解放军总医院输血科2004年1月至2005年8月间无偿献血者200毫升全血中分离的新鲜富含血小板血浆（FPRP）。主要试剂及仪器海藻糖(广西南宁中诺生物科技有限公司)、负载缓冲液A(100 mmol/L NaCl、 10 mmol/L KCl、 10 mmol/L EGTA、 10 mmol/L咪唑、10 mol/l 前列腺素-E1，pH 6.8)、80%甲醇溶液、硫酸蒽酮试剂、4种血小板聚集反应诱导剂： 凝血酶、ADP、胶原、瑞斯托霉素，荧光标记抗血小板表面糖蛋白单克隆抗体（2-8保存）：CD62p-PE、CD61-Percp、PAC-1-FITC、RGDS(PAC1阻断剂)，含1% 多聚甲醛及0.1%叠氮钠的PBS（pH 7.2）固定液，可逆性血小板激活抑制剂PGE-1和腺苷（Sigma公司产品）。酶标仪、恒温水浴箱、抽真空干燥器、可调温度孵育箱、超声清洗器、分析天平，Nihonkohden(MEK-6108K)血细胞自动分析仪。兰波APACT2血小板聚集仪（美生实业有限公司），FACS流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司），一次性12mm75mm Falcon试管（Becton Dickinson公司）、CaliBRITE Beads/FACSComp软件（FACS仪器校正，预设获取条件）、CellQuest软件（实验数据获取和分析软件）、微量加样器和加样头。血小板的洗涤将富含血小板血浆320g离心8分钟，移去红细胞和白细胞，上清液用负载缓冲液A溶液离心洗涤2次（480g离心22分钟，480g离心15分钟），用血细胞自动分析仪计数并调整血小板浓度在（1-2）109/ml之间。血小板负载海藻糖方法及胞内海藻糖浓度的计算将调整好浓度在（1-2）109/ml范围间的血小板置负载缓冲液A中负载不同浓度海藻糖（浓度范围： 0-80 mmol/L），在不同的孵育温度范围（4-37）和不同的孵育时间范围（0.5-4小时）条件下孵育，观察并记录海藻糖载入到血小板胞内的效率及浓度与孵育温度和时间的关系。经孵育之后的血小板溶液用负载缓冲液A洗涤2次（20 000g台式离心机离心20秒，20 000g离心45秒），留取血小板沉淀，用80%甲醇提取载入到血小板胞内的海藻糖，80条件下加热30分钟。用硫酸蒽酮反应定量载入到血小板胞内的海藻糖，用酶标仪测定用甲醇提取后的海藻糖溶液的吸光度值。绘制6-300 g/ml范围内的海藻糖的标准曲线。通过与标准曲线核对检测的每个标本的吸光度值，换算成负载到每个血小板胞内的海藻糖摩尔数，海藻糖摩尔数/血小板平均体积的一半即胞内海藻糖的浓度。海藻糖的负载效率（取均值）负载到胞内的海藻糖浓度/初始胞外海藻糖浓度100。血小板负载海藻糖前后平均体积的变化用血细胞分析仪分别测定。血小板聚集反应用APACT2型血小板聚集仪分别测定血小板在负载海藻糖前后对诱导剂凝血酶(1 U/ml)、胶原(2 g/ml)、ADP(20 mol/L)、瑞斯托霉素(1.6 mg/ml)的聚集率，调整血小板计数为250109/L，取调整好的FPRP 250 l，加入25 l诱导剂，记录最大聚集率。流式细胞术检测血小板膜表面糖蛋白分子的表达流式细胞术检测海藻糖负载前后血小板表面激活指标CD62p（磷脂酰丝氨酸，Ps）、PAC-1（活化的gpb/a复合物）的表达率，添加可逆性激活抑制剂PGE-1和腺苷后CD62p、PAC-1的表达率，表达用“”表示，未表达用“”表示。实验设阴性对照管：取新鲜血小板，调整细胞数在（1 000-2 000）109/L，取5 l加PE同型对照（IgG1 PE）、CD61-PerCP、PAC-1 FITC、RGDS各5 l；阳性对照管:取血小板5 l加入2 l凝血酶充分激活，再加1 l GPRP (Gly-Pro-Arg-Pro)（防止血小板聚集），在试验管中加入3种抗体各5 l和血小板5 l后，轻轻混匀，室温暗处孵育15-20分钟，各管中加入05 ml冷的固定液 (2-8)，充分混匀，在2-8阴暗处放置30分钟。上机获取数据： 开机后，打开CellQuest，顺序放置对照管和试验管。获取数据： 调出，获取条件、FSC和SSC选择Log方式；获取条件为CD61 PerCP阳性，使用对照管调整FL1和FL2的PMT，使阴性群体位于FL1 vs FL2点图左下角，分别使用PAC-1 FITC / IgG1 PE / CD61 PerCP和PAC-1 FITC+ RGDS / CD 62P PE / CD61 PerCP调整FL2-FL1和FL1-FL2补偿，获取各管的试验数据。结果分析：在CD61 vs SSC点图中找出CD61 PerCP阳性的血小板群 (单个血小板和黏附在白细胞上的血小板)设门。门内做PAC-1 FITC vs CD62P PE点图的双参数分析，统计结果。统计学处理将不同时间、温度、胞外海藻糖浓度对应的胞内海藻糖浓度的多个均数进行配对t检验，胞内海藻糖的浓度以xSD表示，用CHISS统计软件录入数据进行统计学分析处理。结 果胞内海藻糖浓度及负载效率与不同孵育温度（）的关系在胞外海藻糖浓度50 mmol/L、4小时孵育后，负载到血小板内部的海藻糖浓度（ mmol/L）及负载效率（%）与不同孵育温度（）的关系见表1。在25以下，胞内浓度及负载效率很低，且差别不大；当负载温度超过30以后，胞内浓度及负载效率急剧增加；37时，负载效率可达35；37以后，负载效率维持在一平稳水平。Table 1. Relationship between intracellular trehalose concentration，loading effeciency and incubation temperature (略)胞内海藻糖浓度及负载效率与不同孵育时间的关系在胞外海藻糖浓度为25 mmol/L、孵育温度37条件下负载到血小板胞内海藻糖浓度（ mmol/L）及负载效率（%）与不同负载时间(分钟)的关系见表2。孵育2小时之前，胞内海藻糖浓度及负载效率较低，2小时后，胞内海藻糖浓度及负载效率随时间的延长呈线性增加的趋势，4小时后维持在一平衡水平。Table 2. Relationship between intracellular trehalose concentration，loading effeciency and incubation time (略)血小板胞外海藻糖浓度与胞内海藻糖浓度的关系在37孵育、经4小时负载后，不同胞外海藻糖浓度（mmol/L）与负载到血小板胞内海藻糖浓度（mmol/L）的关系见表3。从表3可以看出，在37条件下，随胞外海藻糖浓度（50 mmol/L）的升高，其胞内海藻糖的浓度也随着升高，但当胞外浓度70 mmol/L时，胞内海藻糖的浓度反而降低。在4条件下，胞内海藻糖的浓度一直维持在一较低水平。Table 3. Relationship between original extracellular trehalose concentration and intracellular trehalose concentration at 4 and 37 after incubation for 4 hours (略)血小板胞内海藻糖的载入效率（%）随孵育时间、孵育温度及细胞内海藻糖浓度的关系血小板胞内海藻糖的载入效率（%）随孵育时间，孵育温度的关系曲线如图1、图2所示。在37和4温度条件下载入到细胞内海藻糖浓度与不同胞外海藻糖浓度的关系曲线如图3所示。由图1可见，孵育4小时后负载效率高，可达60%，但4小时后负载效率并不随孵育时的延长而明显增加。图2表明，37时负载效率较高，可达35%，但负载效率并不随孵育温度升高而明显增加。图3显示，37孵育4小时细胞内海藻糖浓度明显高于4孵育4小时时。细胞外海藻糖浓度为50 mmol/L时细胞内海藻糖浓度最高，而细胞外海藻糖浓度高于50 mmol/L时，细胞内海藻糖浓度却下降。海藻糖负载前后血小板MPV(fl)的变化检测结果表明：负载前MPV为6.31.10fl，负载后MPV为6.71.23 fl，负载前后比较，t=1.084，P=0.285（0.05），差别无统计学意义，故负载过程不影响MPV变化。海藻糖负载前后血小板对4种诱导剂的最大聚集率结果见表4。由表4可见，血小板负载海藻糖过程对血小板聚集反应性无显著影响。Table 4. Comparion of platelets Aggregation rates（） caused by 4 different agonists before and after loading with trehalose（略）海藻糖负载前后、加和未加可逆性激活抑制剂PGE-1（10ug/ml）、腺苷（5 mmol/L）后血小板膜表面糖蛋白磷脂酰丝氨酸（CD62p）、PAC-1的表达率流式细胞术检测结果见表5。从表5可见，在孵育溶液中加了可逆性血小板激活抑制剂PGE-1和腺苷后，CD62p的表达明显抑制，而PAC-1的表达保持稳定。Table 5. Expression of platelet membrane glycoprotein（CD62p）and PAC-1 before and after loading with trehalose (%) (略)讨 论通过与血小板胞膜第二相变温度（3037）有关的液相细胞内吞途径，血小板可将胞外海藻糖有效载入到细胞内部。海藻糖在干燥状态下维持玻璃化状态，有着独特的保护大分子蛋白质和细胞膜的作用4。图1所示血小板负载海藻糖可在37条件、短短几小时时间内顺利完成，仅经4小时孵育，海藻糖负载效率可达50%以上，表明有限几小时时间内，胞内海藻糖跟胞外海藻糖的浓度便达到了化学平衡。实验结果显示，血小板从开始孵育起到2小时内对海藻糖的吸收速率较慢，但2小时后，细胞内海藻糖的含量增加很快，这表明吸收后的海藻糖均匀分布在血小板胞质内，而非仅仅局限在几个有限细胞器内5。Tablin等1 和Wolkers等6利用一种分子量类似海藻糖的荧光染料(LYCH)作为标记也验证了上述观点的正确性，即荧光染料起初在内吞囊泡，短暂时间后，荧光染料便均匀分布在血小板胞质中，其确切机制有待进一步研究和探讨。图3所示在胞外海藻糖浓度0-30 mmol/L范围、37条件下，吸收到胞内海藻糖浓度与胞外海藻糖浓度呈现良好线性关系。但在胞外海藻糖浓度超过50 mmol/L，经过4小时孵育后，血小板体积变大，肿胀，且血小板聚集实验也验证其对包括凝血酶在内诱导剂的聚集反应性降低，吸收到胞内海藻糖浓度也开始降低。血小板细胞膜有两个相变温度范围，第一相变范围为膜磷脂相变范围，温度为15-18，第二相变范围为细胞膜结构域包括胆固醇在内的相变范围，温度为30-37。图2显示，在第一相变点15时，海藻糖只能少量缓慢吸收，当在第二相变点37时，海藻糖却被快速有效吸收，吸收效率可达35%。负载海藻糖后的血小板经冻干、再水化后，通过扫描电镜、流式细胞仪 、聚集实验等发现，其细胞膜的完整性、血小板的回收率、血小板同诱导剂的聚集反应性，与新鲜血小板相比，没有显著性差别2。海藻糖经液相内吞途径负载到血小板胞内来稳定冻干过程中膜脂、大分子蛋白质等物质的机制和原理不仅适宜于无核细胞如红细胞，也适宜于有核细胞如造血干细胞，海藻糖的细胞内有效负载是血细胞以及其他生物体冻干保存的生物物理学及生物化学基础7。 通过液相内吞途径，血小板可成功负载海藻糖到胞内8-10。这一过程大约需4小时，在这一时间间隔内，血小板平均体积并未因这一处理过程而发生改变，在胞外海藻糖浓度小于50 mmol/L情况下，血小板并未发生膨胀或皱缩等渗透性物理改变，但当胞外海藻糖浓度达到70 mmol/L以上时，细胞体积会发生明显膨胀，MPV变大，且当胞外海藻糖负载浓度大于50 mmol/L时，其负载到胞内海藻糖浓度反而降低。负载海藻糖之后的血小板对4种诱导剂的聚集反应性同负载前比较，虽略微降低，但无统计学意义 11，这表明明冻干前预处理血小板过程不影响反映血小板主要功能的指标对诱导剂的聚集反应性。因可逆性激活抑制剂PGE-1和腺苷的添加会干扰聚集实验的检测，故做聚集实验时，未添加可逆性激活抑制剂PGE-1和腺苷。用流式细胞仪检测反映血小板激活指标膜表面糖蛋白CD62p、PAC-1的表达率实验中，血小板负载海藻糖4小时后CD62p表达率高于负载前，加入可逆性激活抑制剂后，其表达率显著下降，与负载前比较，无显著性差别。而PAC-1的表达率在血小板负载海藻糖前后、加和未加可逆性激活抑制剂条件下，均未发生显著性改变。CD62p是反映血小板激活后期一个最为灵敏的指标，而PAC1（活化的 gpb/a复合物）是反映血小板激活早期的一个灵敏度不太高的指标。本研究显示，PAC1的表达一直维持在一恒定水平，可能与试剂PAC1FITC的灵敏度有一定关系，其灵敏度比CD62p-PE略显不足，具体原因尚待进一步查明。实验结果表明，血小板负载海藻糖前，事先在负载缓冲液中添加一种或几种可逆性激活抑制剂（如PGE-1、腺苷等），可有效防止血小板在冻干前预处理过程中体外过度激活12，13，血小板在37、孵育4小时条件下负载海藻糖后其体外激活程度和聚集反应性未发生显著改变。【参考文献】 1Tablin F，Wolkers WF，Walker NJ，et al. Membrane reorganization during chilling: implications for long-term stabilization of platelets. Cryobiology，2001；43:114-1232Wolkers WF，Walker NJ，Tablin F，et al. Human platelets loaded with trehalose survive freeze-drying. Cryobiology，2001；42:79-873Oliver AE，Jamil KM，Crowe JH，et al. Loading human mesenchymal stem cells with trehalose by fluid-phase endocytosis . Cell preserv Technol，2004；2:35-494Satpathy GR，Torok Z，Bali R