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实验九 植物单细胞分离技术（理论）一、植物细胞培养概述 指以单细胞（single cell）或细胞团（cell aggregate）为单位进行的植物组织培养方式。1、技术特点：操作简单 试验重复性好 单次实验群体大2、培养的植物细胞的特点A、培养时生长速度慢 B、直径为20 150um，比细菌大C、纤维素细胞壁非常脆弱 D、生理与代谢活性低E、需求营养成分复杂 F、不易于保存G、次生物质的合成与积累和细胞分化过程有关3、细胞培养液的性质培养液具有一定的黏度 提供细胞生长发育所需的营养黏度随细胞浓度的增加而增大 需不停搅拌而进行通气二、植物细胞悬浮培养（一）悬浮细胞培养的优点A、提供大量的均匀的植物细胞B、细胞增殖速度比愈伤组织快C、适宜大规模培养D、增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应E、避免有害物质的过分积累F、保证氧的充分供给（二）悬浮培养细胞的建立与测定1、诱导建立诱导细胞悬浮培养的方法A、选择一块易破碎的愈伤组织，转移到适合的培养液中，经12个周期振荡培养，得到呈分散状的细胞培养物。B、选择有用的培养材料，进行匀浆处理，过滤，转入液体培养基中培养。C、选择有用的材料多次转移与液体振荡培养，得到分散程度高的细胞。悬浮培养的材料：愈伤组织的疏松程度、分散效果的好坏。2、生长与增殖扩增曲线：S形 延迟期、对数生长期、平台期、衰减期悬浮培养细胞起始浓度：一般在0.5 1052.5 105个/ml 悬浮培养的单个细胞，35d可见分裂状况3、悬浮培养物的保持A、培养瓶100ml或250ml的三角瓶作容器 装20ml或50ml的培养液B、振荡培养装置旋转式摇床 转速控制在 120r/min以下 体积不宜过大，温度可调C、继代培养定期继代培养，最适周期为12周继代时间为1周的可用1：4的接种量继代时间为2周的可用1：10的接种量移液管口径可稍大，易吸取细胞接种前后要用酒精灯灼烧瓶口定期检查是否有微生物污染4、生长测定对任何一建立细胞系都应进行生长动态测定不同培养基及不同条件，细胞的最大生长速率可由细胞数、细胞干重或细胞蛋白的对数对培养时间作坐标而测定临界起始浓度：低于此值，细胞无法生长，略高于此值，则延迟期伸长常用的生长测定方法A、细胞计数血球计数板：计算公式：细胞数/ml = 5大格内细胞总数5 104 稀释倍数B、细胞体积一定量的细胞悬浮液放入15ml刻度的离心管中离心以每毫升培养液中细胞体积的毫升数来表示细胞体积C、细胞的鲜重与干重将一定量的细胞悬浮液加到预先称重的尼龙布上，用水冲洗并抽滤，然后称重测干重时，将离心收集的细胞转移到预先称重的定量滤纸上，然后80烘箱内10 12h，在干燥器中冷却称重细胞鲜重与干重一般以每毫升悬浮培养物的重量表示（三）悬浮培养工艺1、成批培养 把细胞接种到一个与外界隔绝的只允许气体和挥发性的代谢物质交换的、营养液体积保持不变的密闭系统中培养。 特点a、培养系统密闭b、培养基体积固定c、培养数目、总重量、DNA含量变化，呈一个“S”曲线d、使细胞保持对数生长e、细胞在培养液中分布均匀。2、连续培养 用一定容积但非密闭的特别容器进行大规模细胞培养的方法。 特点a、使细胞保持在增殖最快的对数生长期b、具有稳定的培养状态c、适于大规模工业化生产3、分批培养与连续培养比较（四）悬浮植物细胞培养反应器1、类型： 机械搅拌式、气动式、混合式A、机械搅拌式特点：剪切力大，对细胞易伤害 消耗功率大 易形成供氧不足 易产生死角解决途径：建立抗剪切力的细胞株系 改造反应容器结构B、气动式搅拌反应器类型：鼓泡式和气升式特点：剪切力小传质效果好运行成本和造价低结构简单易保持无菌三、固相化培养（一）固相化细胞 把细胞固定在一种惰性基质，如琼脂、藻酸盐、纤维膜等上面或里面，细胞不能运动，而营养液可在细胞间流动，供应其营养。特点：A、可消除或极大减弱流质引起的切变力B、细胞缓慢生长，次生代谢物占优势C、细胞之间紧密接触，利于次生代谢D、便于操作E、便于次生代谢物的收集F、可连续地对细胞作各种化学处理G、可向反应器中提供大量的、浓度极低的毒性代谢物，从培养基获得代谢物（二）固相化方法A、褐藻酸和藻酸盐 褐藻酸：海草灰分离产物，多聚体 藻酸盐：葡糖醛酸和甘露糖醛酸组成的多糖，在Ca+存在下，形成盐胶B、甲叉藻聚糖 K+存在下，形成强力胶，需先加热熔化 常选用低熔点（5%浓度时，3035）C、琼脂糖与琼脂 凝固剂、无毒、很好的固相化材料、现在常选用（三）固相化细胞活力检测A、成活力染色 荧光素二醋酸（FDA）、苯番红染色观察B、质壁分离测定质膜完整性；质壁分离剂：甘油、山梨醇C、呼吸作用 悬浮培养，测定培养时间与耗氧量关系D、细胞生长 以相对干重表示E、32P核磁共振（四）固相化细胞生物反应器1、特点： 消除或极大地减弱流质引起的切变力有利于次级代谢物的积累有利于产物的合成与分泌有利于连续培养和生物转化2、固相化方法：凝胶包埋、表面吸附、膜固定、网格固定等A、填充床反应器 B、流化床反应器 C、膜生物反应器主要适应于分泌产物到体外的细胞培养体系（五）影响因素1、遗传特性2、环境条件：光、温、pH、培养基成分等四、单细胞培养（一）单细胞分离方法1、机械法 利用叶肉组织排列疏松、细胞间接触较少的特点，将叶片轻轻研碎，经过滤和离心，收集和净化细胞。优点a、细胞未受酶伤害b、有利于细胞的生理和生化研究c、无须质壁分离2、酶法 利用果胶酶、纤维素酶处理植物叶片或其他外植体，使细胞分离。优点：是可以得到较多的游离细胞3、化学法 利用一些化学药剂游离细胞。如秋水仙碱等特点：分离细胞数量大、易引起细胞改变（二）单细胞培养 植物单个细胞培养，最终目的是长成一株完整的植株。培养方法：平板培养、条件培养、看护培养、微室培养、微滴培养、液体浅层培养1、平板培养 按一定细胞密度制备好单细胞悬浮液，再将含0.6%琼脂的培养基加热熔化后冷却至35左右，尚未凝固时与细胞悬浮液混合迅速倒入培养皿中形成一平板进行培养。 特点：单细胞在培养基分布均匀便于定点观察筛选效率高、量大操作简便通气状况不佳排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收植板率计算公式：植板率高低随细胞种类、接种密度及培养基成分不同而异细胞接种密度，一般不低于103 104个/L2、条件培养 选用的培养基中，加入一定量已生长过组织或细胞的条件培养液，进行细胞培养的方法。起始细胞密度高时，成分可简单些；相反，成分就复杂些。高密度细胞群体，在分裂临界度以上的细胞，能较快地分裂。3、看护培养 是用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的方法。特点是简便易行，效果好，但显微镜下难以追踪细胞分裂、生长过程。4、微室培养 是在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。特点是能连续进行显微观察，但培养基量少，培养时间短。5、液体浅层培养 先在培养皿中注入浅层液体培养基，再接种已分散的单细胞的培养方法。6、其他培养方式 膜室培养、双层滤纸培养（三）单细胞培养程序建立细胞株、高产细胞株的选择、分化培养或扩大培养、鉴定和提取1、建立细胞株 A、确定材料选择易于分散的花粉为材料分散性好的愈伤组织材料直接从叶肉、根尖、髓组织取材B、悬浮细胞液的制备振荡培养分散性好的材料，提取用孔径为200300目的网过滤收集2、起始浓度控制细胞密度 起始细胞密度：临界密度3、高产细胞株的选择细胞株：在培养基上生长出的每个细胞团都来自一个细胞的分裂。初步鉴定和测定 高抗、高品质、高产4、分化培养与扩大培养5、鉴定与提取（四）影响因素营养条件：要求更高环境条件：要求更高初始细胞密度条件培养基生长调节剂pH值五、植物细胞培