大鼠弥漫性脑损伤后Homer蛋白的表达及其意义.doc

大鼠弥漫性脑损伤后Homer蛋白的表达及其意义 作者：史铁钧，费舟，章翔，黄卫东，梁景文，宋蕾【关键词】 弥漫性脑损伤 Expression of Homer after diffuse brain injury in rats and its significance【Abstract】 AIM: To study the expression and significance of Homer in diffuse brain injury（DBI）of rat in vitro. METHODS: One hundred and five SD rats, weighing（30025）g, were randomized to normal, shamoperated and DBI groups. The Marmarou rats were applied to DBI group and the shamoperated group was treated as DBI group except for “free fall” attack. The rats main brain areas and nuclei were taken to detect for Homer by immunoblotting at 0.5, 1, 6, 12, 24, 72 and 168 h after injury respectively. RESULTS: Homer1a was positive in DBI group from 0.5 h to 168 h after injury but no Homer1a was observed in normal group and shamoperated group. Homer1b/c, Homer2a/b and Homer3 were present in the normal, shamoperated and DBI groups. CONCLUSION: There is a significant change in Homer1a expression before and after injury, but there is no significant change in Homer1b/c, Homer2a/b and Homer3 levels, which indicates that Homer1a is involved in the neuronal injury and may protect neurons from insults.【Keywords】 Homer; immunoblotting; diffuse brain injury; rats【摘要】 目的： 研究大鼠弥漫性脑损伤后不同亚型Homer蛋白表达规律及其意义. 方法： SD大鼠105只，体质量（30025） g，分为正常组、假手术组和弥漫性脑损伤(DBI)组， DBI组应用Marmarou大鼠致伤，假手术组不予以自由落体打击，其余处理同DBI组，分别在损伤后0.5, 1, 6, 12, 24, 72, 168 h取大鼠主要脑区及核团裂解匀浆，进行各Homer蛋白的免疫印迹分析. 结果： DBI组神经组织中Homer1a蛋白的表达自伤后0.5 h起持续至伤后168 h，而正常及假手术组未见该蛋白阳性表达；Homer1b/c, Homer2a/b和Homer3在正常组、假手术组和DBI组均可见明确的阳性表达. 结论： 大鼠弥漫性脑损伤后Homer1a蛋白的表达于损伤前后有显著变化，而Homer1b/c, Homer2a/b及Homer3于损伤前后无明显变化，提示Homer1a蛋白参与了神经元损伤过程,且可能对神经元损伤起到一定的保护作用.【关键词】 Homer；免疫印迹法；弥漫性脑损伤；大鼠0引言1997年Brakeman等首次发现Homer，目前Homer家族已分为3型(Homer1,Homer2和Homer3)，其中Homer1是唯一在外来刺激后高表达的家族蛋白，每型还有多种剪切变异，如Homer1a, Homer1b和Homer1c等. Homer1a是一种即早基因（immediately early gene, IEG）产物，它在细胞中呈动态表达,而随后又发现Homer1b, Homer1c,Homer2a, Homer2b及Homer3等，通常在多种神经元的突触后膜上表达，除含有与Homer1a相同的EVH1（Ena/VASP homology 1）结构域外，还在C端包含有一段卷曲螺旋结构域. 我们研究在大鼠弥漫性脑损伤(DBI)模型基础上Homer蛋白分子的表达及其意义.1材料和方法1.1材料健康成年雄性SD大鼠105只，体质量为（30025）g，第四军医大学动物实验中心提供. 各Homer蛋白亚型的多克隆抗体均购自SantaCruz公司，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）低分子量标准蛋白及BCIP/NBT显色盒购自武汉博士德公司.1.2方法 1.2.1动物分组及模型制作SD大鼠随机分为正常组、假手术组及损伤组，其中损伤组据标本采集时间又划分为0.5, 1, 6, 12, 24, 72, 168 h等7个亚组，每组5只，即在7个时间点划入实验范围的大鼠均为15只，损伤组采用Marmarou大鼠DBI模型1，假手术组仅不予以自由落体打击，其余处理同损伤组.1.2.2取材各组大鼠至预定时间后，常规麻醉，断头取脑，选取额顶叶皮层及海马区神经组织混合多去污剂裂解缓冲液于裂解器内裂解匀浆，匀浆液高速离心（15000 g, 15 min）后取上清液冷冻保存.1.2.3免疫印迹技术检测待样本制备完成后，分别行各亚型Homer蛋白免疫印迹技术检测，BCIP/NBT显色.2结果Homer1a及Homer1b/c蛋白阳性表达可见于额顶叶皮层及海马区神经组织，其中Homer1a分子于脑损伤后0.5 h起出现，持续至伤后168 h，正常组及假手术组均未见阳性表达；而Homer1b/c分子在正常组、假手术组及机械损伤组均可见阳性表达，在神经组织内的分布与Homer1a基本相同. Homer2a/b及Homer3分子的阳性表达主要见于海马区神经组织，而额顶叶皮层组织仅有微量表达（Fig 1）.3讨论近年来，不同的Homer基因剪切变异型不断被发现，到目前为止共有10余种，但从总体上可将其分为2大类，即短Homer和长Homer2. Homer1a蛋白的表达受神经元兴奋性活动的调节，癫痫、高频刺激、光刺激及发育过程中海马或皮层神经元的兴奋性突触活动可快速诱导Homer1a mRNA表达水平增加3，4. 我们已经通过石蜡切片的免疫组织化学方法证实： 大鼠DBI后，其额顶叶皮层神经元中Homer1a蛋白表达明显增强，而Homer1b/c等长Homer分子则于脑损伤前后无显著变化，不受神经元兴奋性活动的调节.以往研究表明： 虽然大鼠DBI后脑皮层内三组代谢性谷氨酸受体（mGluRs）表达均有改变，但以mGluR1a变化最为明显，是加重神经元损伤的主导因素5，而该组受体具有非激动剂依赖性活性（agonistindependent activity），即在没有激动剂存在下，它仍可以介导细胞内IP3的升高及Ca2+依赖的K+通道开放6，这种活性是由细胞内信号转导分子Homer所介导的. 长、短Homer分子通常相互竞争，起拮抗作用. 长Homer依靠它们特有的CC螺旋结构形成多聚体，有效连接第I组mGluR和IP3R分子，使刺激信号很快通过这种连接激活IP3R，引起胞内Ca2+的释放，导致神经元细胞的进一步损伤，而短Homer1a表达受多种刺激因素调控，其表达作用是选择性阻断长Homer分子多聚体与第I组mGluR的结合，延缓IP3R分子的激活，减少或延缓胞内Ca2+的进一步释放7. 因此，我们认为Homer分子对第组mGluRs信号转导的调控有重要作用，且短Homer分子Homer1a在神经元损伤过程中起到了一定的保护作用.本实验通过建立稳定的Marmarou大鼠DBI模型，依据免疫印迹分析技术及前述多项研究得知： 弥漫性脑损伤后，Homer1a分子出现明确的动态表达，自伤后30 min起持续表达至伤后168 h，而Homer1b/c, Homer1b2a/b及Homer1b3的表达于致伤前后无明显变化，是一种基本表达. 长短Homer分子与第组mGluR的竞争结合提示我们：增加Homer1a表达或减少Homer1b/c, Homer1b2a/b及Homer3的表达可以改变mGluR受体信号的传递效率，可能对神经元损伤起到保护作用，这为开发新型神经保护剂提供了新的实验依据.【参考文献】1 费舟，章翔，李树合，等. 弥漫性脑损伤合并二次脑损伤脑组织谷氨酸及环核苷酸的改变J. 第四军医大学学报,2000;21(9):1064-1066.Fei Z, Zhang X, Li SH, et al. Alteration of glutamate and cyclic nucleotide in rat brain after diffuse brain injury with secondary brain insults J. J Fourth Mil Med Univ, 2000;21(9):1064-1066.2 Soloviev MM, Ciruela F, Chan WY, et al. Molecular characterisation of two structurally distinct groups of human homers, generated by extensive alternative splicing J . Mol Biol, 2000;295(5):1185-1200.3 Bottai D, Guzowski JF, Schwarz MK, et al. Synaptic activityinduced conversion of intronic to exonic sequence in Homer1 immediate early gene expression J . Neuroscience, 2002;22(1):167-175.4 Nielsen HS, Georg B. Homer1 mRNA in the rat suprachiasmatic nucleus is regulateddifferentially by the retinohypothalamic tract transmitters pituitary adenylate cyclase activating polypeptide and glutamate at time points where light phaseshifts the endogenous rhythm J . Mol Brain Res, 2002;105:79-85.5 何远东，费舟，章翔，等. 大鼠脑损伤后大脑皮层代谢性谷氨酸受体1 a的表达变化及意义J. 第四军医大学学报,2001;22(7):612-615.He YD, Fei Z, Zhang X, et al. Gene expression of metabotropic glutamate receptor 1a after brain injury and efficacy of its antagonist MCPG J . J Fourth Mil Med Univ, 2001;22(7):612-615.6 Ango F, Prezeau L, Muller T, et al. Agonistindepend