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子宫内膜癌中p15及MDM2蛋白表达 作者：刘冬满 何世东 张志勇 郑寰宇【摘要】 目的 采用流式细胞术并结合免疫组化法检测p15蛋白和MDM2蛋白在正常子宫内膜、良、恶性子宫内膜肿物组织中表达，研究其与原发性妇科恶性肿瘤的关系及三者在原发性妇科恶性肿瘤表达的相关关系。方法 采用石蜡切片，提取各个实验组的单细胞悬液，利用流式细胞术并结合免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白过氧化酶结合法，分别检测子宫系列病变组织p15、MDM2表达情况。结果 从子宫肌瘤到子宫内膜癌，p15的表达量有明显进行性增高(P<0.01)。而p15过度表达时(FI>1.30)5年生存率很低。两组生存率比较有显著性差异(P<0.01)；MDM2的表达在子宫内膜样癌为48.28% 、非子宫内膜样癌为41.5%，都明显低于功能性子宫出血诊断性刮宫标本的60.2%(P<0.01)。结论 p15、MDM2蛋白表达异常可成为子宫内膜癌危险性评估、子宫内膜癌早期诊断及预后和复发判定的新途径。 【关键词】 子宫内膜癌；P15；MDM2，流式细胞术；免疫组化1994年Kamb1等人首先报道p16和p15基因缺失与许多类型肿瘤有关，可能是细胞恶性转化过程的关键。有关p15基因在妇科恶性肿瘤中的情况研究较少，且大多针对p15基因在妇科恶性肿瘤中的纯和性缺失、突变和过度甲基化进行讨论。MDM2基因是p53的负反馈调节因子，是影响p53失活的因素之一， p15、MDM2蛋白表达异常的研究对临床具有重大的意义，将成为子宫内膜癌危险性的评估、子宫内膜癌早期诊断及预后和复发判定的新途径。关于子宫内膜癌中p15及MDM2蛋白表达与临床病理诊断的关系未见相同报道。本研究观察p15蛋白和MDM2在正常子宫内膜、良、恶性子宫内膜肿物组织中的表达，探讨其与原发性妇科恶性肿瘤的关系及三者在原发性妇科恶性肿瘤表达的相关关系。1 材料与方法1.1 临床及病理资料标本取自唐山工人医院病理科存档的原发子宫内膜癌组织50例，年龄5075岁,平均62.6岁。所有患者术前未经放射治疗及化学药物治疗，根据1986年FIGO分期，分级按WHO标准，免疫组化采用石蜡包埋的肿瘤组织。正常的子宫内膜组织的供者10例，年龄5873岁,平均65.8岁，为同期接受手术治疗的子宫肌瘤患者， 行子宫全切加一侧或两侧附件切除术,经组织学证实正常，以此作为对照组。1.2 方法1.2.1 流式细胞术检测p15蛋白（1）准备单细胞悬液：选择组织结构完整，无变性及非相关成分的蜡块，切取厚度为0.05 mm的组织片5片，置于试管中，以二甲苯脱蜡，室温下24 h(中间更换二甲苯1次)。以100%、95%、70%、50%梯度酒精依序水化，每次10 min。弃酒精加入磷酸盐缓冲液(PBS)5 ml，5 min弃之。用Medimachine细胞制备仪制成单细胞悬液，用300目尼龙过滤除去组织块及细胞碎片。1 250 r/min离心，弃去上清液，加入PBS重悬，再1 250 r/min离心弃上清液，加入PBS重悬。计数，调节细胞数为1109/L，待染色。（2）细胞间接免疫荧光标记法：单细胞悬液中加入1100稀释的p15蛋白多克隆抗体0.1 ml，轻微吹打混匀。37温水孵育30 min，离心弃上清，加入120稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG 50 l，轻微摇动混匀，室温避光孵育30 min。离心弃上清，PBS离心洗2次(1 250 r/min)。弃去上清以除去未结合的多余荧光抗体。加入含1%多聚甲醛的PBS 0.5 ml，重悬，置于BD样品管中，4避光保存待测。除设正常子宫平滑肌组织为对照，还设立:PBS代替第一抗体(p15抗体)的阴性对照;只加入1100第一抗体100 l的阳性对照;只加120第二抗体(FITCIgG)100 l的阳性对照。（3）流式细胞检测:应用美国BD公司生产的FACSCalibur型流式细胞仪。激光波长488 nm。检测期间以标准细胞样品调整仪器变异系数(cv)值在5%以内。（4）结果分析:以荧光指数(fluorescence index，FI)表示p15表达的相对含量。FI=(肿瘤细胞p15表达的平均荧光强度-对照样品平均荧光强度)/正常子宫平滑肌组织p15表达的平均荧光度。FI>1.0为阳性，Fl1.0为阴性，FI>1.30为过度表达，FI1.30为低表达。1.2.2 免疫组化法检测MDM2MDM2单克隆抗体及EnVision复合物为Dako公司产品。主要步骤:病理切片常规脱蜡至水,在pH为6.0的0.01 mol/L枸橼酸溶液中进行抗原修复，加入MDM2单抗(MDM2 为150稀释)，湿盒中4过夜,加EnVision复合物室温30 min,DAB显色,苏木精对比染色、脱水、透明、封固。 结果判断标准：光镜下组织细胞核或胞质存在棕黄色颗粒为阳性。根据阳性细胞在组织中所占面积分为4个等级:<10%为(-)、10%25%为(+)、25%50%为()、>50%为()。1.3 统计学分析采用SPSS10.0软件包，应用2检验、spearman相关分析法对研究结果进行统计学分析。2 结 果2.1 子宫内膜癌病理组织学分类与p15表达关系本组正常子宫平滑肌组织10例中p15表达均为阴性。子宫肌瘤14例中9例为阳性表达，只有1例过度表达(7%);子宫交界性癌7例中5例阳性，其中4例出现过度表达(57%);而子宫内膜癌29例全部都为阳性，其中23例过度表达(79%)，三组资料间差异有显著性(P<0.05)。可见从子宫肌瘤到子宫内膜癌，p15的表达量明显进行性增高(P<0.01)。2.2 子宫内膜癌组织形态特征与p15表达关系p15表达量随细胞分裂相的增加而明显增高。研究发现当细胞分裂相在5个/10高倍视野(HFP)以上时，p15表达量均有显著提高，并绝大多数出现过度表达。p15表达在低水平时(FI1.30)，5年生存率高达100%，而p15过度表达时(FI>1.30)，5年生存率很低，小于50%。经统计学处理，两组生存率比较有显著性差异(P<0.01)。2.3 MDM2蛋白表达情况 MDM2的表达在子宫内膜样癌为48.28%、非子宫内膜样癌为41.5%，都明显低于功能性子宫出血诊断性刮宫标本的60.2%(P<0.01)。3 讨 论 肿瘤的发生是一个多因素多步骤的慢性病理过程。近年来研究表明细胞周期的失控是导致肿瘤发生的重要原因。而细胞增殖的关键是G1期的启动。G1期的启动除受周期素(Cyclin)和周期素依赖性激酶(Cyclindependentknases,CDK)的正向控制外,还受到一些细胞周期调控相关基因的制约。如果这种负向调控作用丧失,细胞就会生长失控、转化,导致肿瘤的发生2。p15基因又称多肿瘤抑制基因MTS2,定位于人染色体9P21区,所编码的p15蛋白为细胞周期蛋白D/CDK激酶的抑制因子,p15蛋白与CDK4和CDK6结合,抑制CDK4cyclinD和CDK6cyclinD,抑制细胞增殖。p15基因纯合子缺失或过度甲基化导致该基因失活,使细胞无限制生长。p15蛋白的表达和子宫内膜癌的关系比较密切，p16和p15的表达具有一致性，且功能上有一定的互补作用3，4。 本文将子宫内膜癌的p15特征与其组织学各主要指标进行对比研究发现，随着细胞分裂相的增加及细胞异型性和细胞密度的增大，p15表达量明显增高。当分裂相增多或出现轻度异型性，p15表达量明显增高，并绝大多数为过度表达。所以，子宫内膜癌诊断中，一旦发现细胞分裂相或轻度异型性就诊断为恶性。 Combart等研究发现p15基因的纯合子缺失出现在p16基因发生纯合子缺失时,而p16发生纯合子缺失时不一定出现p15的缺失,故认为p15可能补充p16的缺失。目前已公认p16缺失导致肿瘤的发生,但如果再有p15的缺失则更易导致肿瘤的发生。Kudoh等5对p16及p15基因与卵巢癌化疗敏感性的关系进行研究发现，铂类化疗6个月后，经二次手术证实，不敏感组的p16及p15基因缺失率较敏感组明显升高，而且p16、p15基因缺失者的预后也较基因表达者更差。总之，本组资料中，50例原发性子宫内膜癌中MDM2蛋白的表达阳性率为48.28%，因而说明原发性子宫内膜癌中同时存在p15、p16基因的改变。原发性子宫内膜癌组织中p16与p15蛋白表达的相关性研究为探讨妇科肿瘤的发病机制提供了重要依据,并为临床上对妇科恶性肿瘤的诊断和监控提供了辅助手段。本组观察到p15低表达的患者5年生存率为100%，而过度表达者5年生存率明显降低(<50%)，可见p15过度表达时肿瘤分化差、恶性度高、预后差。所以p15表达可作为判断子宫内膜癌病人预后的一项客观指标。【参考文献】 1 Kamb A，Gru NA，WeaverFeldhaus J，et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor typesJ.Science，1994；264:43640.2 Peter M，Herskowitz I.Joining the complex：cyclindependent Kinase inhibitory proteins and the cell cycleJ.Cell,1994;79:181.3 张丽志.p16和p15基因在子宫内膜癌中的表达J.吉林大学学报(医学版)，2005；31（1）：11820.4 夏瑾瑜.原发性子宫内膜癌组织p15基因及其蛋