小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备.doc

小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 作者：鲍俊峰, 王胜军, 马洁, 崔大伟， 杨先知， 毛朝明, 仝佳, 邵启祥, 许化溪【摘要】 目的： 体外原核表达小鼠Foxp3蛋白，并以其免疫家兔，制备多克隆抗体。方法： 从质粒Foxp3pMD18T扩增小鼠Foxp3 全长基因，亚克隆至原核表达载体pET32a，转化E.coli BL21； IPTG诱导表达目的蛋白，Ni2+NTA柱纯化及蛋白质印迹鉴定蛋白；纯化蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体，ELISA法检测抗体效价，蛋白质印迹检测抗体特异性。结果： 成功构建了Foxp3pET32a原核表达载体，表达和纯化了目的蛋白；ELISA法检测抗体效价为120 000，蛋白质印迹检测结果显示抗体特异性与小鼠Foxp3蛋白结合。结论： 成功表达小鼠Foxp3蛋白并制备了多克隆抗体。 【关键词】 Foxp3； 原核表达； 多克隆抗体； 小鼠Abstract Objective: To prepare rabbit polyclonal antibody against mouse Foxp3 protein by prokaryotic expression of mouse Foxp3 protein in vitro. Methods： Foxp3 gene was amplified by PCR from the full length plasmid Foxp3pMD18T and subcloned into the pET32a vector; the recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 and the expression of recombinant protein was induced by IPTG. after purified with Ni2+NTA column, identification of the recombinant protein by Western blot was performed; the purified protein was used as antigen to immunize rabbits, the titer and the specificity of the rabbit antiFoxp3 antibody were detected by ELISA and Western blot, respectively. Results： The prokaryotic expression vector for Foxp3pET32a was constructed successfully; mouse Foxp3 protein had been expressed and purified; rabbit polyclonal antibody against mouse Foxp3 protein was prepared, the titer of the antibody was 120 000 by ELISA and Western blot analysis showed that the polyclonal antibody could specifically recognize mouse Foxp3 protein. Conclusion： Mouse Foxp3 protein had been expressed and rabbit antiFoxp3 antibody had been prepared successfully.Key words Foxp3; prokaryotic expression; polyclonal antibody; mouseFOX(forkhead box)是脊椎动物叉头样转录因子的总称，是一个具有多种功能的转录因子家族，通常和细胞生长发育的调控有关1。Foxp3蛋白是叉头样转录因子家族中的成员， 2001年由Brunkow等2首次报道。小鼠Foxp3基因位于其X染色体，全长为3 739 bp(包含5端非编码的外显子)，其基因编码的蛋白质也称为Scurfy，由429个氨基酸组成，N末端有锌指蛋白、亮氨酸拉链和一个富含脯氨酸的区域，而叉头样DNA 结合域与其他FOX成员不同,靠近蛋白C末端3。Foxp3在小鼠特异性表达于CD4+CD25+调节性 T细胞(regulatory T cells, Treg细胞)而不表达于CD8+T细胞，研究发现，Foxp3作为Treg细胞发育的一个关键转录因子，它的表达及功能与Treg细胞密切相关4，可以更好地在分子水平上了解Treg细胞。 本实验室已经构建小鼠Foxp3/AAV表达载体5，在此基础上我们构建原核表达载体Foxp3pET32a，IPTG诱导表达重组蛋白，并进行纯化。利用纯化的Foxp3蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体，为研究小鼠Foxp3蛋白对Treg细胞的功能影响提供基础。1 材料与方法1.1 材 料1.1.1 主要试剂 Ex Taq DNA 聚合酶、rTaq DNA 聚合酶、dNTP，T4DNA连接酶、蛋白标准参照物、DNA标准参照物、限制性核酸内切酶EcoR I，Sal I购自Takara公司；Profinity IMAC Nickel柱购自BioRad公司；ECL检测试剂盒购自GE公司；抗小鼠Foxp3单克隆抗体购自eBioscience公司；羊抗大鼠HRPIgG、羊抗兔HRPIgG购自上海普飞公司；IPTG、弗氏佐剂购自Sigma公司；家兔购自江苏大学动物中心。1.1.2 质粒载体和菌株 原核表达载体pET32a、感受态细菌E.coli BL21由本室保存；质粒mFoxp3 pMD18T由本室克隆并保存。1.2 方 法1.2.1 重组表达质粒Foxp3pET32a的构建 以质粒Foxp3pMD18T作为模板，PCR扩增获得Foxp3基因的PCR产物, EcoR I，Sal I双酶切PCR产物和载体质粒pET32a, 胶回收, T4DNA连接酶16过夜,连接两者的黏性末端,连接产物用热休克法转化感受态BL21菌，涂板，挑取单个菌落至3 ml LB培养基(含50 g/ml氨苄西林)中， 37摇菌过夜。抽提质粒DNA，进行质粒PCR和酶切鉴定，阳性质粒进行测序。1.2.2 Foxp3重组蛋白的诱导表达及鉴定 挑取鉴定正确的Foxp3pET32a重组质粒单个菌落，接种于3 ml LB 培养基(含50 g/ml氨苄西林)中，37，250 r/min振荡培养12 h，以1100的比例将菌液接种于5 ml LB培养基中，37摇菌至D（600 nm）=0.60.8 时加入终浓度0.5，1.0，1.5 mmol/L IPTG，于30或37在0，2，4，6 h分别进行诱导表达，以4,5 000 g离心10 min收集菌体，用1/10体积的冷PBS重悬细菌，加入100 g/ml的溶菌酶，冰浴超声破菌，4,12 000 g离心20 min,各取上清和沉淀行SDSPAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色显示蛋白条带。1.2.3 重组蛋白的蛋白质印迹鉴定 将表达蛋白行SDSPAGE电泳后，直接电转至PDVF膜上(恒流90 mA，4,5 h)，5%脱脂奶粉封闭，TBST缓冲液漂洗，滴加12 000稀释的Foxp3单克隆抗体作用2 h，漂洗，加110 000稀释的兔抗大鼠 HRPIgG二抗作用30 min，漂洗。用ECL检测试剂为底物，曝光X底片，显色，定影。1.2.4 Foxp3重组蛋白的纯化 扩大培养重组表达菌，大量诱导表达蛋白，Profinity IMAC Nickel柱纯化蛋白(按蛋白纯化试剂盒操作说明书进行)，简要操作如下：8 mol/L尿素、5 mmol/L咪唑结合缓冲液溶解包涵体，8 mol/L尿素、10 mmol/L咪唑洗涤缓冲液去除非特异蛋白，用梯度浓度的复性缓冲液(尿素8 mol/L至0 mol/L)直接在纯化柱上复性包涵体重组蛋白，然后再用梯度浓度(咪唑10 mmol/L至500 mmol/L)的复性洗脱缓冲液洗脱重组蛋白，取得纯化的Foxp3重组蛋白，以SDSPAGE分析检测蛋白的纯度，蛋白质印迹检测蛋白的特异，Bradford法测定纯化蛋白的浓度, 4保存备用。1.2.5 免疫动物 将纯化的Foxp3蛋白溶液与等体积的弗氏佐剂（第一次为完全佐剂，以后为不完全佐剂）充分乳化后，注射家兔进行免疫。主要程序如下：首先在兔双脚垫分别注射弗氏完全佐剂1 ml，两周后再在颈背部皮下注射弗氏不完全佐剂1 ml，然后每隔一周注射弗氏不完全佐剂进行加强免疫，取血前ELISA法测定抗血清的效价，达到理想效价处死家兔，收集血清，4保存备用。1.2.6 兔抗小鼠Foxp3多克隆抗体效价和特异性的测定 多克隆抗体效价用ELISA法检测，抗原为纯化的小鼠Foxp3重组蛋白，一抗为不同浓度稀释的兔血清，二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG(110 000稀释)，邻苯二胺(OPD)显色，酶标仪测定光密度。抗体特异性用蛋白质印迹鉴定，一抗为12 000稀释的多抗血清，二抗为110 000稀释的羊抗兔HRPIgG。2 结果2.1 重组表达质粒Foxp3pET32a的构建及鉴定 以质粒Foxp3pMD18T作为模板，PCR扩增小鼠Foxp3基因，在1 287 bp处可见单一条带，与目的片段大小相符（图1）。将Foxp3亚克隆到原核表达载体pET32a多克隆位点中，重组克隆经酶切鉴定，目的片段大小与预期相符(图2)。测序结果显示目标序列与NCBI(加入号: NM_054039)相应序列完全相符(结果未显示)，证实表达载体构建成功。 1：DL2000标记; 2：PCR扩增产物图1 小鼠Foxp3基因的PCR扩增产物（略）Fig 1 Amplification of cDNA fragment of mouseFoxp3 by PCR1：DL2000标记; 2：EcoR I和Sal I双酶切质粒Foxp3pET32a; 3：DL15000标记图2 重组载体的酶切鉴定（略）Fig 2 Analysis of the recombinant vector byrestriction enzyme digestion2.2 重组小鼠Foxp3蛋白的诱导表达,纯化及鉴定 Foxp3pET32a阳性菌株经IPTG诱导后收集细菌，SDSPAGE电泳显示在30，1 mmol/L IPTG诱导4 h条件下，融合蛋白表达达到高峰，蛋白条带位于约62 kD处，与预期相符，用抗Foxp3单克隆抗体进行蛋白质印迹鉴定显示，在约62 kD的位置出现单一条带,证实该蛋白条带为Foxp3融合蛋白。该重组蛋白主要以包涵体形式存在，用Profinity IMAC Nickel柱进行纯化蛋白，蛋白纯化扫描证实蛋白纯度在90%以上,Bradford法测定蛋白浓度约为1 mg/ml（图3）。我们在此条件下大量诱导Foxp3pET32a阳性菌,收集菌液500 ml, 获得干菌16.5 g,经纯化后获得Foxp3融合蛋白约10 mg。 1:蛋白标记; 2:Foxp3pET32a/ BL21经IPTG诱导4 h; 3:Foxp3pET32a/ BL21经IPTG诱导2 h; 4:pET32a/ BL21经IPTG诱导2 h; 5:纯化后Foxp3 融合蛋白; 6:蛋白质印迹鉴定Foxp3融合蛋白图3 Foxp3融合蛋白的表达、纯化及鉴定（略）Fig 3 Expression,purification and identificationof Foxp3 fusion protein2.3 兔抗小鼠Foxp3多克隆抗体效价和特异性的测定 以免疫前兔血清作为阴性对照，ELISA法测定抗体效价，以P/N2.1为判断指标，抗体滴度达到120 000；蛋白质印迹分析显示，多克隆抗体可单一结合重组小鼠Foxp3蛋白，与其他菌体蛋白无交叉反应（图4）。 1：蛋白标记; 2：对照蛋白; 3：Foxp3 融合蛋白图4 抗体特异性的Western blot分析（略）Fig 4 Analysis of antibody specificity by Western blot3 讨论 CD4+CD25+T 细胞是天然产生的调节性T细胞的重要亚群之一，在稳定的自身免疫环境中发挥重要的作用6。但有关CD4+CD25+T 细胞分化发育的具体机制尚不清楚。Hori等7在Science上阐述了Foxp3(forkhead box P3)与CD4+CD25+Treg细胞的关系，Foxp3特异性地表达于CD4+CD25+Treg细胞上，并在该细胞的发育和功能维持中起很重要的作用8,9，进而提示Foxp3可能是CD4+CD25+Treg细胞的一个特征性标志10。 本研究选用了T7表达系统中的原核表达载体pET32a，pET系列载体以T7为启动子，可使目的基因得到高效转录与翻译，同时它所表达的蛋白产物在N 末端带有6个连续的组氨酸，蛋白产物可通过亲和层析快速、简便地纯化。同时在诱导表达重组蛋白,IPTG浓度,诱导温度及时间均会影响融合蛋白的产量,我们最终选择在30，1 mmol/L IPTG 4 h来诱导表达蛋白，使获得融合蛋白的产量达到最高。取得纯化效果好的蛋白抗原是制备抗体实验成功与否的关键，我们使用Profinity IMAC Nickel柱进行纯化蛋白，原理是通过纯化柱中树脂的固化Ni2+与融合蛋白带有的多聚组氨酸结合，形成金属螯合物，再用咪唑竞争性结合固化Ni2+，从而达到洗脱蛋白的目的。金属螯合层析具有高效、高容量、快速、强力浓缩等特点，纯化后获得的蛋白经扫描证实蛋白纯度在90%以上，这为最终获得特异性的抗体提供保证。接下来有关Foxp3在CD4+CD25+Treg细胞的信号传导中如何发挥作用还需要进行很多工作，制备Foxp3纯化抗原及其多克隆抗体对CD4+CD25+T细胞的发育和免疫调节功能的研究提供了良好的实验基础。【参考文献】 1 Coffer PJ, Burgering BM. Forkheadbox transcription factors and their role in the immune systemJ. Nat Rev Immunol, 2004, 4(11): 889-899.2 Brunkow ME, Jeffery EW, Hjerrild KA, et al. Disruption of a new forkhead/wingedhelix protein, scurfin, results in the fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouseJ. Nat Genet, 2001, 27(1): 68-73.3 Carlsson P, Mahlapuu M. Forkhead transcription factors: key players in development and metabolismJ. Dev Biol, 2002, 250(1 ): 1-23.4 Hori S, Sakaguchi S. Foxp3: a critical regulator of the development and function of regulatory T cellsJ. Microbes Infect, 2004, 6(8): 745-751.5 王胜军，许化溪，钱 晖,等.重组Foxp3腺相关病毒转染小鼠CD4+CD25-T细胞的实验研究J.中国免疫学杂志，2006，22（4）：291-293.6 Tang Q, Blueston