小鼠大脑中动脉梗死模型VERGE蛋白表达的变化及其机制.doc

小鼠大脑中动脉梗死模型VERGE 蛋白表达的变化及其机制 作者：王赞 姜宏宇 纪莉 林卫红【摘要】 目的 探讨VERGE蛋白在小鼠大脑中动脉梗死模型(MCAO)中蛋白表达的变化及其机制。方法 C57BL/6小鼠30只，随机分为2组：30 min MCAO模型组、90 min MCAO模型组，制备MCAO模型，应用激光多普勒血流仪进行术中脑血流监测，应用Western 印迹法观察各组梗死侧及非梗死侧的VERGE、pJNK2、pERK1/2、P38蛋白表达的变化。结果 30 min、90 min MCAO模型组梗死侧VERGE、pJNK2 的蛋白表达明显增高，pERK1/2、P38蛋白表达无变化;两组MCAO模型非梗死侧的VERGE、pJNK2、pERK1/2、P38蛋白表达均无变化。结论 VERGE 蛋白表达在小鼠MCAO的早期明显升高可能与JNK2通路有关而与ERK、P38通路无关。 【关键词】 VERGE;大脑中动脉梗死;机制【Abstract】 Objective To study the protein expression and its mechanism of VERGE in MCAO mice models. Methods The mice were divided into 30 and 90 min MCAO groups. All mice were made into MCAO models. The protein expressions of VERGE, pJNK2, pERK1/2, P38 were tested by Western blot. Results The protein expressions of VERGE, pJNK2 of both groups in ischemia hemisphere were increased, while the protein expressions of pERK1/2, P38 had no change. There were no protein expression changes of VERGE, pJNK2, pERK1/2, P38 in the nonischemic hemisphere of both groups. Conclusions The protein expression of VERGE is increased in the transient MCAO models , the mechanisms of which may be related to JNK2.【Key words】 VERGE; Middle cerebral artery occlusion (MCAO); Mechanism 血管早期反应基因(VERGE)可以快速、选择性地表达在成熟脑的血管内皮细胞，与血管的形成及发展密切相关，可以作为一种即早基因调控1。VERGEE 编码一个73个氨基酸的区域与Apol有30%的同源性，在缺血缺氧时迅速爆发，通过PKC 引起MAPK蛋白表达的变化，但其细胞信号传导的机制尚不完全清楚。本研究拟建立小鼠大脑中动脉梗死(MCAO)模型，观察VERGE及pJNK2、pERK1/2、P38蛋白表达的变化，进一步明确脑缺血后VERGE表达变化及其信号传导的通路。1 材料与方法1.1 动物及分组 实验过程按照瑞士政府实验动物保护条例进行，C57BL/6小鼠为苏黎世大学附属医院动物室提供。共分2组：30 min MCAO组;90 min MCAO组,每组10只。A组为30 min MCAO模型非梗死侧;B组为30 min MCAO模型梗死侧;C组为90 min MCAO模型非梗死侧;D组为90 min MCAO模型脑梗死侧。1.2 VERGE 由Jean B博士赠给Dirk.M.Hermann 教授。1.3 小鼠MCAO模型制备2 各组大鼠采用1% Isoflorin 气体麻醉,应用恒温仪使直肠温度保持在37，分离结扎左侧颈总动脉和颈外动脉，将带有硅胶的8.0尼龙线从颈总动脉插入颈内动脉，长度为9 mm，阻断大脑中动脉血流，A、B组在30 min将尼龙线撤出,C、D组90 min将尼龙线撤出，进行再灌注。1.4 激光多普勒血流仪(LDF)监测 在实验过程中脑血流用0.5 mm光纤探头进行监测，右大脑中动脉区位置为囟门旁开6 mm，后2 mm，只有LDF的血流值降低到15%20%，再灌注血流恢复到50%左右为梗死再灌注模型成功。1.5 Western 印迹分析 将两组梗死侧及非梗死侧脑组织分别进行Actin、VERGE、pJNK2、pERK1/2、P38 的 Western 印迹分析，组织冰冻切片，应用裂解液裂解,取上清液用于SDSPAGE,等量蛋白被溶于6SDS缓冲液，煮沸，并载入15%多丙烯胶，蛋白被转移到PDF膜上，浸在鼠抗Actin、一抗多克隆抗VERGE、pJNK2、pERK1/2、P38中过夜干燥，膜再浸在驴抗羊或羊抗兔二抗中，洗脱后，浸在ECL显影液中，显影。采用IMAGE J软件对所得的蛋白带进行灰度值分析。1.6 统计学分析 应用SPPS 软件包，组间差异采用单因素方差分析及配对t检验。2 结 果2.1 LDF监测 两组MCAO小鼠术中均进行LDF监测，线栓后两组LDF的血流值降低到15%20%，分别在30 min及90 min进行MCAO模型再灌注，血流恢复50%以上为梗死再灌注模型成功，两组组间LDF值无明显差异(P>0.05)。2.2 Western 印迹分析 将两组梗死侧及非梗死侧脑组织分别进行Actin、VERGE、pJNK2、pERK1/2、P38 的 Western 印迹分析及灰度值比较，结果显示，两组小鼠MCAO模型梗死侧的VERGE、pJNK2蛋白表达升高(P<0.05)，pERK1/2、P38蛋白表达无变化(P>0.05);两组小鼠MCAO模型非梗死侧的VERGE、pJNK2、pERK1/2、P38 蛋白表达均无变化(P>0.05)见图1。图1 各组小鼠的actin、VERGE、pJNK2、pERK1/2、P38 Western 印迹法蛋白表达的变化3 讨 论在短暂性脑缺血引起的脑损伤中，血管内皮及血脑屏障的功能起着非常重要的作用，VERGE 是一种血管早期反应基因，被Jean B Regard 命名为VERGE，VERGE 可以在血管的形成及发展中快速的高表达，PKC 可以使细胞骨架蛋白重构，并改变血管的渗透性，在体外血管培养中，海人藻酸、戊氮唑、缺氧等可诱导VERGE的高表达，VERGE 进一步引起PKC信号的高表达，MAPK 在细胞的生长、分化及凋亡过程中起着重要作用3，4，并参与脑缺血损伤及神经保护的过程，JNK2、pERK1/2、P38 均与细胞的生长及分化密切相关5，6，本研究将30 min、90 min小鼠MCAO 模型的梗死侧及非梗死侧脑组织分别进行actin、VERGE、pJNK2、pERK1/2、P38 Western 印迹分析，结果显示，两组小鼠MCAO模型梗死侧的VERGE、pJNK2蛋白表达升高，pERK1/2、P38蛋白表达无变化;两组小鼠MCAO模型非梗死侧的VERGE、pJNK2、pERK1/2、P38 蛋白表达均无变化，说明 VERGE 蛋白表达在小鼠MCAO梗死的早期明显升高可能与JNK2通路有关，而与ERK、P38通路无关。Verge参与了短暂性脑缺血损伤与保护的早期过程，激活JNK2后是否通过线粒体途径参与凋亡的过程，尚待进一步研究。【参考文献】 1 Regard J,Scheek S,Borblev T,et al.Verge:a novel vascular early response geneJ.Neuroscience,2004;24(16)：4092103.2 Kilic U,Kilic E,Russel J,et al.signal transduction pathways involved in melatonininduced neuroprotection after focal cerebral ischemia in miceJ.Pineal Res，2005;38:6771.3 Nagata Y,Takahashi N,Davis RJ,et al.Activation of p38 MAP kinase and JNK but not ERK is required for erythropoietininduced erythroid differentiation.JBlood，1998;92:185969.4 Kilic E,Kilic U,Bassetti C,et al.Intravenously administered recombinant tissueplasminogen activator attenuates neuronal injury after mild focal cerebral ischemia in miceJ.Neuroreport,2004;15:6879.5 Zhang L,Zhang ZG,Liu XS,et al. The PI3K/Akt pathway mediates the neuroprotective effect of atorvastatin in extending thrombolytic therapy after embolic stroke in the ratJ.Arterioscler Thromb Vasc B